PCR方法扩增种属特异性片段检测猪源成分

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中国 动 物检 疫
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２０ ０ ８年 第 ２ ５卷 第 ８期
—３ — — ４—
麟 目主持人 ： 庞素芬 ｆ ４＠ 。 ．ｍ ｅ 。 ｈ ｉ 。 ｍｌ
Ｐ 法扩增 种属 特异性片段检测 猪源成 分 ＣＲ方
毕道荣 ， 宏伟 ｚ 孙 ，高 ， 敏 ｚ 君妮 ｚ ，梁
监管 ． 具有参考价值
关 键 词 ： ＣＲ ：猪 ：检 测 ｐ
中图 分 类 号 ： ８ １３ ７ １， Ｓ２ １５ １ ￥ ５ ．４ ． Ｔ ５ ．＋ 我 国 每 年 需 从 国 外 进 口大 量 肉 骨 粉 类 饲 料 ． 了 防 范 疯 牛 病 、 病 为 痒 发 生 风 险 ． 国相 关 部 门先 后 颁 布 了 我 《 于 严 防 牛 海 绵 状 脑 病 传 人 中 国 的 关 通 知》 《 于 禁 止 用 反 刍 动 物 源 性 饲 、关 料 饲 喂反 刍 动 物 的通 知 》 《 于 加 强 、关
文献标识码 ： Ａ
文章 编 号 ：０ ５ ９ ４ （０ ８０ — ０ ４ ０ １０ — ４ Ｘ ２ ０ ）８ ０ ３ — ３
性 实 验 ． 肉 和鸡 肉用 于 猪 成 分 Ｐ Ｒ １ Ｐ Ｒ 反 应 猪 Ｃ ． ５ Ｃ 鉴 定 的灵 敏 性 实 验 。 肉 骨 粉 、 粉 与 血 采 用 ２ １ 反应 体系 ．反 应液包 ５ Ｍ ＰＲ １ ． １ ｂ ｆ ｒ 和 羽 毛 粉 的 混 合 样 品 用 于 验 证 在 实 括 ： 水 （ Ｃ 级 ） ５２ 、 ０ｘ ｕ ｅ
食物链发 生传播 ． 同时减少 因食 用含 对 于 动 物 血 液 样 品 ．直 接 取 ３ ０ 脂 糖 凝 胶 在 ０５ Ｔ Ｅ（． ５ Ｍ ０ ．ｘ Ｂ ０ ４ ｓ ０ 一 硼酸 、． １Ｍ Ｅ Ｔ 电泳缓 冲液 中 ０ ０ Ｄ Ａ） ０ 有 猪 成 分 的食 品 而 引 发 的 宗 教 、 物 Ｌ全 血 提 取 Ｄ 食 ＮＡ。 过 敏 等 问题 ． 立 食 品 和 饲 料 中 猪 源 建 用 于 灵 敏 性 实 验 的 的 猪 肉 和 鸡 ８Ｖ 恒 压 电 泳 １— ０ ｉ 根 据 Ｄ Ａ ０ ０ ２ ｍｎ Ｎ ａｋｒＤ ２ ０ ， Ｋ Ｒ ） 阴 Ｔ 性成分的快速检测方法很有必要 。 笔 肉 ． １ ３ 烘 烤 ３ ｎ后 ． 液 氮 研 Ｍ ｒｅ（ Ｌ ０ ０ ａ ａ ａ、 性 对 照 、 ３℃ ０ ｍｉ 加 者 参 考 文 献 ．建 立 了 猪 源 性 成 分 的 磨 成 粉 状 ．称 取 １０ ｇ用 于 Ｄ Ａ提 阳性 对 照 判 定 结 果 使 用 凝 胶 成 像 系 ０ｍ Ｎ Ｐ ＣＲ检 测 方 法 ． 对 方 法 的灵 敏性 和 取 将 猪 肉 粉 和 鸡 肉粉 的 Ｄ Ａ 抽 提 统 拍 照 记 录 并 Ｎ 特 异 性 进 行 了分 析 ． 讨 了其 用 于 食 缓 冲 液进 行混 合 以得 到 系列 百 分 比 １ 探 ． 限制性酶切反应 体系 ７ 品 和 饲 料 中 猪 成 分 检 测 的 可 行 性 使 用 限 制 性 内切 酶 Ｍｎ Ｉ 对 扩 ｌ 酶 （ Ｏ ％ ， ０ 。％ ， ．％ ，．％ ，．５ ， １ ０ １ ％ １ ０５ ０１ ００ ％ ００１ ．．０ ％ ．％ ） ． ％ ００ ５ ０ 的猪 肉 Ｄ ＮＡ。饲 增 产 物 进 行 酶 切 鉴 定 采 用 ５ １ 反 ０ Ｍ １ 材 料 与 方 法 Ｍｎ Ｉ酶 １ ｌ（０／ ，Ｏ １ ｕｔ ｌ ｘ ． ｄ） １１ 样 品 ． 料混 和样 品 的制 备 分别 以不 含猪 成 应 体 系 ： ｌ 血 羽 按 ｂ ｔ ｒ５ ｌＤ Ａ 扩 增 产 物 ２ ｔ ， ２ ｕ ｅ ， Ｎ ｔ ０ｄ Ｈ０ ． 用 于 做 引 物 特 异 性 实 验 和 Ｐ Ｒ 分 的 肉骨 粉 、 粉 、 毛 粉 为 基 质 ， Ｃ ４１ ｄ。 灵 敏 度 实 验 的 样 品 及 其 来 源 见 表 １ 表 ２分 别 制 备 样 品 的 不 同 质 量 百 分 ２ ． 其 中 各 种 动 物 血 液 用 于 猪 引 物 特 异 比 梯 度 的 混 样 １ Ｐ Ｒ 产 物 序 列 测 定 ． Ｃ ８ Ｐ Ｒ 扩 增 产 物 经 柱 纯 化 （ 据 博 Ｃ 根 表 １ 样品种类及来源
其中各种动物血液用于猪引物特异表1样品种类及来源样品及样品种类样品来源猪血狗血丰血阜血鸡血鱼血驴血兔血鹿血马血猪肉鸡肉肉骨粉血粉羽毛粉市场中国青岛爱诺动物医院中国青岛市场中国青岛市场中国青岛市场中国青岛市场中国青岛青岛动物目中国青岛青岛动物园中国青岛青岛动物园中国青岛青岛动物圆中国青岛市场中国青岛市场
际 饲 料 中 的灵 敏 性 和 特 异 性 （ｒｍ ｇ ， ｓｏ ｓ Ｓ ）．１ Ｍ Ｃ２ Ｐｏ ｅａ Ｗｉ ｎｉ Ｕ Ａ２５ ｃ ｎ Ｍ、 ｇ Ｉ １２ 仪 器 ． （５ ２ ｍＭ） ｔ ｄ Ｔ （．ｍＭ ａ ｈ ２． ２． Ｎ Ｐ ２５ ｄ、 ｅｃ） ｔ ｄ、 台 式 离 心 机 （ ｐ ｅ ｄ ｆ ８ ０ Ｒ。 Ｔ ｑＤ Ａ 聚 合 酶 （Ｕ Ｉ Ｐｏ ｅａ Ｅ ｐ ｎ ｏ ５ １ ａ Ｎ ５ ／ Ｉ。ｒｍ ｇ， ￣ ｅｍ ｎ ） Ｅ ｐ ｎ ｏ ｓ ｎ ｉ Ｕ Ａ） － ｃ ｎ ｌ ｏ 肉 骨 粉 等 动 物 性 饲 料 产 品 管 理 的 通 Ｇ ｒ ａｙ ． 基 因 扩 增 仪 （ ｐ ｅ ｄｆ Ｗ ｉ ｏ ｓ Ｓ ０３ 、 引 物 ｐ ｒＦ和 知 》 《 物 源 性 饲 料 产 品 安 全 卫 生 Ｍａ ｔ ｃ ｃｅ ｒｄｅ ｔＧｅ ａ ｙ 。 泳 ｐ ｒ （Ｏ Ｍ 和 动 ｓ ｒｙ ｌｒｇａ ｉｎ ． ｒ ｎ ） 电 ｅ ｍ ｏ Ｉ ￣ ）各 １ ｌＤ Ａ模板 １ 。 Ｒ ｗ、 Ｎ ｌ 管理办法》 。上 述 文 件 明确 提 出 。 止 仪 （ Ｐ ３ １ Ａｍｅｓ ａ Ｐ ａ ｃａ 禁 Ｅ Ｓ ０． ｒｈ ｍ ｈ ｍａ ｉ Ｐ Ｒ 反 应 条 件 随 不 同 仪 器 略 有 Ｃ ｉ ｃ） ｔ Ｂ ｃｍ ｎ ９ ℃预变性 在 反 刍 动 物 饲 料 中使 用 、 加 以 哺 乳 Ｂｏｅｈ ．核 酸 蛋 白 分 析 仪 （ ｅｋ ａ 改变 ．一般 反应 程序 为 ： ４ 添 类 动 物 为 原 料 的动 物 性 饲 料 产 品 ． 各 ＤＵ６ ０， ｅｎａ ｖ 。 恒 温 干 燥 箱 ３ｍｉ ９ ℃变 性 ４ ．９Ｃ 火 ４ 。 ４ Ｇ Ｙｌｎ ） ｎ ４ ５Ｓ５ ｏ 退 ５Ｓ 出 入 境 检 验 检 疫 部 门 要 依 法 严 格 对 （ ＡＮ ｖ ２ ２ Ｊｐ ｎ 。 ７ ℃延 伸 ４ ．５个 循 环 。 ２ 延伸 ５ ２ ５ ３ Ｓ ７￣ Ｃ Ｓ ＹＯ ｎｏ 一 １Ｆ，ａ ａ ） 允 许 进 口的 动 物 饲 料 产 品 实 施 检 验 １ 模板 Ｄ Ａ提取 Ｉ ３ Ｎ ｍｎ ４Ｃ 存 ｉ ￣保 ． 检疫。 按 Ｔ ｒａｌ ａｔｇｉ ａ等 人 的 方 法 分 别 抽 １６ 电泳 检 测 取 Ｐ Ｒ产物 ８ ｌ Ｃ ，使 用 ２ 的琼 ％ 为 有 效 防 止 动 物 疫 病 通 过 进 入 提 阳 性 和 阴 性 对 照 ＤＮ ｌ Ａ＿ ＿
（． １中国动物卫 生与流行病 学 中心 。 东青岛 ２ ６ ３ ； ． 东出入境检验检疫局 ， 东青岛 ２ ６０ ） 山 ６ ０ ２ ２山 山 ６ ０ １
摘 要： 针对猪 线粒体基 因的保 守序 列 。 设计特 异性 引物 。 优化反 应条件和反应参 数 ， 建立 了食 品和饲料 中猪源
性成分的 Ｐ ＣＲ 检 测 方 法。 方 法灵 敏 、 异 。 测低 限 达 ００ ％。 推 广使 用 ， 于 加 强食 品 、 料 的 质 量 控 制 和 监 督 该 特 检 ．１ 其 对 饲