限制性核酸内切酶(双语)
限制性内切核酸酶消化DNA及从琼脂糖凝胶中回收DNA
紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条置于1.5ml离 心管中； 加入3体积溶胶液，50~60℃数分钟直至无可见凝胶块； 冷却至室温； 加入到离心吸附柱中，室温放置1min后，5000～10000rpm 1~5min使 液体滤过；倒掉离心管中液体； 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管 中液体 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管 中液体； 将离心柱放入离心管中12000rpm 2min； 将离心柱放入新的1.5ml离心管中，向离心柱中滤膜上加入20~30ul洗 脱液，室温放置5min，12000rpm离心3min，液体中即为回收的核酸。
5‘…G GATCC…3’ 5‘…A GATCT…3’ 3‘…CCTAG G…5’ 3‘…TCTAG A…5’ 5‘…GGATCT…3’ 3‘…CCTAGA…5’ 这些粘性末端连接后， BamHI和BglII酶将 不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为 GATC)来进行再切割。
3. 酶切反应的设计一般应注意问题:
PCR产物的酶切 及琼脂糖凝胶电泳回收
限制性内切核酸酶消化DNA
限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上3-8个特定核苷酸序列并产 生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的 总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀” 对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不 可缺少的酶之一。
4. 酶切实验中的注意事项:
1) 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时 应尽量缩短酶在室温的放置时间。
2) 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内 切酶变性及DNA大分子的完整。
3) 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于 管壁上的液滴全部沉至管底。 4) 终止酶反应可根据需要采用不同的方法： ①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终 止液终止反应。 ②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管 置65℃保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases）是一类酶，在一个特定的基因序列中，它能够以高精度地找到并且切割目标片段。
它的另一个叫法是限制性内切酶，是一种分子生物学中的重要工具，通常用来分离和分析特定的DNA片段，从而帮助研究人员全面了解和研究基因组。
这类酶被发现于1960年，并于1972年获得诺贝尔生理学或医学奖，因为它们在分子生物学方面具有重要的意义。
限制性核酸内切酶是一种能够将双链DNA分割成其他片段的酶。
它们是自然界中存在的，细菌通过限制内切酶来防御抗生素和其他有害细菌，另一方面，研究人员也可以使用它们来分离和分析DNA片段，从而了解基因信息和细胞运行机制。
在这种情况下，限制性核酸内切酶能够将双链DNA识别为其特定目标序列，在这个特定序列处将所有字母（A，T，G，C）切断，并将其分割成单链片段。
每个限制性核酸内切酶都有一个特定的识别序列，只有细菌有多种不同的内切酶，这些酶可以识别每个特定的目标序列，并且可以在这些序列处将双链DNA切割成片段。
限制性核酸内切酶的工作原理和精度使它们成为了分子生物学方面的重要工具。
它们可以用来识别和分析基因片段，而这些片段可以用来研究基因组，并了解基因如何影响细胞运作及机体发育，以及疾病随之而来的基因变化。
限制性核酸内切酶可以用来分离DNA，而这也是各种分子生物学应用所必需的。
例如，它们可以用来制作基因组图谱、分析基因组差异、复制特定基因以及在真核细胞和原核细胞等不同的生物体中测量基因表达的等，在医学研究中也有很大的应用。
此外，由于限制性核酸内切酶的超精确切割功能，它们被广泛应用于基因工程和转基因技术中，可以帮助开发者们分离和重组特定的基因，以获得想要的表型。
这些技术也能够应用于改变植物的物种，用以改善植物的各种性状，例如增加水合作用，减少营养价值，增强抗病性能，增加耐盐性以及改变其他特性。
总之，限制性核酸内切酶是一种重要的酶，它的工作原理和精确的切割功能使它成为了分子生物学研究中的重要工具，并且它还在基因工程和转基因技术中有着广泛的应用。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ），简称限制酶，是一类能识别和切割双链 DNA 分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。
根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。
Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对 DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的 DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。
Ⅱ型限制酶的主要作用是切割 DNA 分子，在 DNA 重组、构建新质粒、建立 DNA 的限制性酶切图谱、 DNA 的分子杂交、制备 DNA 的放射性探针、构建基因文库等方面起到重要作用，是基因工程重要的工具酶。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构。
Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：切割产生 5 ' 突出的粘性末端（ sticky ends ）；切割产生 3 ' 突出的粘性末端；切割产生平头末端（ blunt ends ）。
Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ酶。
最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。
反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。
因此，I类酶作为DNA的分析工具价值不大。
Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。
反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
限制性内切酶
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。
它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。
另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。
限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。
实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。
在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。
该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。
因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。
从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。
但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。
虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。
经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。
限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)
在 生 物 制 药 、转 基 因农 作 物 、工 业 用 的 基 因 再 连 接 到 别 的 基 因 上 去 。 因 酶 ．生物 降解 塑 料等 各 种 各 样 产 品 的 此 ， 基 因插 入 质 粒 ＤＮＡ，首先 使 目 将 开发 、制造 方 面 广 泛使 用 的 基 因重 组 的 基 因的 扩增 、改 变 、表 达等 试 管 内 技 术 是 依 靠 ” 制 性核 酸 内切 酶 可 以 的 基 因操 作 变得 简 单 。 限 选择 Ｄ ＮＡ的切 割 位 置 ”及 ” 接 酶 把 连 限 制 性核酸 内切 酶不仅 可 以应 用 ＤＮＡ 的 断片 连 接起 来 ”得 以实 现 的 。 到 基 因重 组技 术 上 ，还 可 以 用 多个 限 限 制 性核 酸 内切酶 是 一 种能 够 识 制 性 核 酸 内切 酶 切 割 基 因组 ＤＮＡ 绘 别特 定 的 碱 基序 列 ．在该 碱 基 序 列 的 制 基 因图 （ 制性 核 酸 内切酶 的切 割 限
飞 跃 的 发展 。
有 一个 单 链 部 分 （ 叫做 黏 性末 端 ）用 同一种 限 制 性核 酸 内切 酶 切 割 的断 片 的末端 是互 补 的 ，所 以连 接酶 就 很 容 易 把 这 些 末 端 互 补 的 ＤＮＡ 片 段 连 接 起 来 ，这 就 是 ” 刀 与糨 糊 ”这 种说 剪
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维普资讯
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生物技术专业英语翻译——《限制性内切酶与电泳技术》
G3 RESTRICTION ENZYMES AND ELECTROPHORESISG3 限制性内切酶与电泳技术Restriction endonucleases: To incorporate fragments of foreign DNA into a plasmid vector, methods for the cutting and rejoining of dsDNA are required. The identification and manipulation of restriction endonucleases in the 1960s and early 1970s was the key discovery which allowed the cloning of DNA to become a reality. Restriction-modification systems occur in many bacterial species, and constitute a defense mechanism against the introduction of foreign DNA into the cell. They consist of two components; the first is a restriction endonuclease, which recognizes a short, symmetrical DNA sequence (Fig. 1), and cuts (hydrolyzes) the DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence. Foreign DNA will hence be degraded to relatively short fragments. The second component of the system is a methylase, which adds a methyl group to a C or A base within the same recognition sequences in the cellular DNA (see Topic Cf). This modification renders the host DNA resistant to degradation by the endonuclease.Recognition sequences: The action of restriction endonudeases (restriction enzymes for short) is illustrated in Fig. la including the archetypal enzyme EcoRI as an example. This enzyme, which acts as a dimer, will only recognize a 6 bp palindromic sequence (the sequence is the same, reading 5'→3', on each strand). The product of the cutting reaction at this site on a linear DNA is two double-stranded fragments (restriction fragments), each with an identical protruding single-stranded 5'-end with a phosphate group attached. The 3'-ends have free hydroxyl groups.A 6 bp recognition sequence will occur on average every 46 = 4096 bp in random sequence DNA; hence, a very large DNA molecule will be cut into specific fragments averaging 4 kb by such an enzyme. Hundreds of restriction enzymes are now known, and a large number are commercially available. They recognize sites ranging in size from 4 to 8 bp or more, and may give products with protruding 5'- or 3'-tails or blunt ends. The newly formed 5'-ends always retain the phosphate groups. Two further examples are illustrated in Fig. 1. The extremely high specificity of restriction enzymes for their sites of action allows large DNA molecules and vectors to be cut reproducibly into defined fragments.Cohesive ends: Those products of restriction enzyme digestion with protruding ends have afurther property; these ends are known as cohesive, or 'sticky' ends, since they can bind to any other end with the same overhanging sequence, by base pairing (annealing) of the single-stranded tails. Hence, for example, any fragment formed by an EcoRI cut can anneal to any other fragment formed in the same way (Fig. lb), and may subsequently be joined covalently by ligation (see Topic E4). In fact, in some cases, DNA ends formed by enzymes with different recognition sequences may be compatible, provided the single-stranded tails can base-pair together.The digestion of a few hundred nanograms(<1μg) of plasmid DNA is sufficient for analysis by agarose gel electrophoresis; preparative purposes may require a few micrograms. The former amount corresponds to a few percent of a miniprep sample, as described in Topic G2. The DNA is incubated with the enzyme and the appropriate buffer at the optimum temperature (usually 37℃), in a valume of perhaps 20μl. A dye mixture is then added to the solution ,and the sample is loadedon an agarose gel.Agarose gel electrophoresis: Agarose is a polysaccharide derived from seaweed, which forms a solid gel when dissolved in aqueous solution at concentrations between 0.5 and 2%(w/V). Agarose used for electrophoresis is a more purified form of the agar used to make bacterial culture plates.When an electric field is applied to an agarose gel in the presence of a buffer solution which will conduct electricity, DNA fragments move through the gel towards the positive electrode (DNA is highly negatively charged; see Topic C1) at a rate which is dependent on its size and shape (Fig. 3). Small linear fragments move more quickly than large ones, which are retarded by entanglement with the network of agarose fibers forming the gel. Hence, this process of electrophoresis may be used to separate mixtures of DNA fragments on the basis of size. Different concentrations of gel [1%, 1.5% (w/v), etc.] will allow the optimal resolution of fragments in different size ranges. The DNA samples are placed in wells in the gel surface (Fig. 3), the power supply is switched on and the DNA is allowed to migrate through the gel in separate lanes or tracks.The added dye also migrates, and is used to follow the progress of electrophoresis. The DNA is stained by the inclusion of ethidium bromide (see Topic C4) in the gel, or by soaking the gel in a solution of ethidium bromide after electrophoresis. The DNA shows up as an orange band on illumination by UV light.Figure 4a illustrates the result of gel electrophoresis of the fragments formed by the digestions in Fig. 2. The plasmid has been run on the gel without digestion (track U), and after digestion with BamHI (track B) and EcoRI (track E). A set of linear marker DNA fragments of known sizes (tracks M) have been run alongside the samples at two different concentrations; the sizes are marked on the figure. A number of points may be noted.Undigested plasmid DNA (track U) run on an agarose gel commonly consists of two bands. The lower, more mobile, band consists of negatively supercoiled plasmid DNA isolated intact from the cell. This has a high mobility, because of its compact conformation (see Topic C4). The upper band is open-circular, or nicked DNA, formed from supercoiled DNA by breakage of one strand; this has an Opened-out circular conformation and lower mobility.The lanes containing the digested DNA dearly reveal a single fragment (track B) and fivefragments (track E), whose sizes can be estimated by comparison with the marker tracks (M). The intensities of the bands in track E are proportional to the sizes of the fragments, since a small fragment has less mass of DNA at a given molar concentration. This is also true of the markers, since in this case they are formed by digestion of the 48.5 kb linear DNA of bacteriophage k (see Topic H2). The amount of DNA present in tracks U, B and E is not equal; the quantifies have been optimized to show all the fragments clearly.A more accurate determination of the sizes of the linear fragments can be made by plotting a calibration curve of the log of the size of the known fragments in track M against the distance migrated by each fragment. This plot(Fig. 4b) is a fairly straight line, often with a deviation at large fragment sizes. This may be used to derive the size of an unknown linear fragment on the same gel from its mobility, by reading off the log(size) as shown. It is not possible to derive the sizes of undigested circular plasmids by the same method, since the relative mobility of circular and linear DNA on a gel depends on the conditions (temperature, electric field, etc.).Isolation of fragments: Agarose gels may also be used preparatively to isolate specific fragments for use in subsequent ligation and other cloning experiments. Fragments are excised from the gel, and treated by orie of a number of procedures to purify the DNA away from the contaminating agarose and ethidium bromide stain. If we assume that the EcoRI fragment containing the gene X (Fig. 2) is the target DNA for a subcloning experiment (see Topic Gl), then the third largest fragment in track E of Fig. 4a could be purified from the gel ready for ligation into a new vector (see Topic G4).中文译文：限制性内切酶：限制性内切酶是将外源DNA整合到质粒载体时将双链DNA切断与使其重新连接到DNA上所必需的酶。
(整理)限制性内切核酸酶
第三章限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。
作用时需要——作辅助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。
限制性内切酶
5’-G BamH I 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Sau 3A
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
III类限制性内切酶
能完全肯定的识别位点和切割位点，但切 割位点也是在识别位点的一侧的一定距离，通 常距特异性位点24bp-26bp。
I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。 Ⅱ型：基因工程的工具酶。 Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作 亦无实用意义。
I型限制性内切酶
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大 肠杆菌B株和K株分离得到。 作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异 序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移 动，在距离特异性识别位点约1000-1500bp处 随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的 切口。
4.DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性内切酶 的活性也有很大的影响。某些限制性核酸 内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量 要比消化线性的DNA量高出很多倍。
5. 缓冲液
是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限 制酶一般都带有专用缓冲液。
化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl：维持pH 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定
• 识别序列
通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在 识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。
• 酶切切口
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases,RNases）是一类重要的核酸分子分析工具，是由胞壁杆菌和放线菌等微生物中编码的特定核酸酶类别。
它可以特异性的切割DNA和RNA的特定序列，对研究DNA和RNA的结构和功能有着重要的作用。
限制性核酸内切酶的分子结构基本上是由多聚腺苷酸（polypeptide）和双聚腺苷酸（dipeptide）组成的。
此外，它们还包含辅酶（cofactor），例如Mg2+或Ca2+、K+等，并且需要这些辅酶才能激活其具有酶活性。
一个限制性核酸内切酶在一次反应中可以检测出多个DNA序列，而且能够辨识具有同系特征特异性碱基对，尽量减少大量的氧化废物产生。
与其他核酸分子分析工具不同的是，限制性核酸内切酶具有单端可切或双端可切的特性，可以选择性地切割DNA分子的特定序列，其切割后的片段可以进一步用于分子生物学技术，如DNA测序、PCR及DNA杂交等。
例如，细菌DNA内切酶BamHI以TGT^AAT为切割位点，能有效地将DNA分子切断，切割后可以得到二条内切片段，分别以TGT和AAT为3端，以及一条5末端非切片段；而HpaII以C^CGG为切割位点，切割后可以得到二条内切片段，分别以C和CGG为5端，以及一条3末端的非切片段。
此外，限制性核酸内切酶还可用于检测DNA片段的克隆和定位，以及调控基因表达，控制蛋白质翻译等用途，因此，它们在遗传学、分子生物学研究中起着重要的作用。
它们能够解析特定DNA序列，同时保留它们的原始特征，有助于研究者对其进行详细的调查。
在生物技术的应用中，使用限制性核酸内切酶可以改变DNA序列，实现重组DNA的目的，创造各种抗性等目的。
因此，限制性核酸内切酶的重要性不言而喻。
它们是研究 DNARNA 构和功能的重要工具，同时也是实现技术转化的重要基础。
它们可以用于检测DNA片段，改变序列，以及调控基因表达等多种用途，同时也可以做出有意义的蛋白质和重要生物体系。
(整理)英语翻译MicrosoftWord文档
限制性核酸内切酶微生物能够在获得的其他来源的ＤＮＡ中识别自己的ＤＮＡ。
这种体系已经发展到识别自我和非自我，依靠细胞内部的两种酶：修饰性甲基化酶和限制性核酸内切酶。
这种甲基化酶在新生的双链ＤＮＡ链上以特定的方式对各种核苷酸残基增加甲基集团。
这种识别序列在长度上通常有４到７个碱基对并且是回文序列，这就是说，这种序列在ＤＮＡ一条链上与它互补链是相同的。
大多数生物体具有许多不同的修饰性甲基化酶。
限制性核酸内切酶作为修饰性酶识别相同的序列，但是代替甲基化，在序列上切割ＤＮＡ。
然而，核酸内切酶不会切割自身序列但是会降解外援ＤＮＡ。
这种识别和切开双链ＤＮＡ特殊序列的特性已经成为从许多类型的微生物中切除ＤＮＡ片段的基础。
不同种类的限制性内切酶被发现，被称为１，２，３，和４类型。
只有２类型对新的DNA 技术是重要的。
2类型限制性内切酶有特殊的重要性因为他们的特殊序列并且可以在精确的位置使双链DNA断裂。
用这种方式切开长的外源DNA分子成为短的片段也可以在质粒载体做一个单一缺口，在这位置上DNA片段可以被插入。
在一些酶的作用下，切口产生单一链末端并且对于一个给定的限制性核苷酸得到的所有片段的目的序列是相同的。
用这种方法，任一片段通过一种特殊的退火增殖可以与其他通过相同核酸内切酶切割的片段进行配对，因此创造出一个杂交分子。
自从来自大量细菌的限制性核酸内切酶发现以后，命名细菌的一套专业术语就被采用了。
宿主微生物的属名和种名由类型的首字母确定，并且种名的前两个字母用斜体字形成三个字母的缩写。
例如，E。
coli，Eco.菌株和类型用无下滑线记号鉴定并且核酸内切酶的号码用罗马数字—EcoRⅡ.不同的核算内切酶可以用于产生不同尺寸的DNA片段使不同的3‘或5’单链延长。
这种DNA片段可以用电泳纯化。
通过EcoR1水解PBR322的单一目的位点或者通过限制性核酸内切酶因为有一个单一的目标位点，改变环状制粒成为线状DNA分子。
这个位点可以通过有两个折叠对称轴的2型限制性核酸内切酶识别：它们可以是4，5，或6核苷酸序列。
(完整版)名词解释(分子生物学)
名词解释1.操纵子（operon）：是真核生物基因的一个基本转录单位，由编码序列及上游的调控序列组成。
编码序列通常包括几个功能相关的结构基因，调控序列由启动序列（启动子），操纵序列（操纵基因）及其他调节序列构成。
2.顺式作用元件（cis-acting element）：是真核基因表达是调控转录过程的特殊DNA序列，以转录因子结合而起作用，通常包括启动子，增强子，沉默子等。
3.反式作用因子（trans-acting factor）：与其他基因的顺式作用元件结合，调节基因转录活性的蛋白质因子，根据其功能不同可分为基本转录因子和特异性转录因子。
4.启动子（promoter）：位于结构基因上游，与RNA聚合酶识别，结合的特异DNA 序列，与基因转录起始有关。
5.增强子（enhancer）：指决定基因的时间，空间特异性表达，增强启动子的转录活性的特殊DNA序列，作用特点是无方向性，位置或距离不固定。
6.沉默子（silencer）：某些基因含有负性调节原件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。
7.基因表达调控（regulation of gene expression）：指细胞或生物体在接受环境信号刺激时或适应环境变化的过程中在基因表达水平上做出应答的分子机制。
8.基因重组（gene recombination）：DNA片段在细胞内、细胞间、甚至是在不同物种之间进行交换，重组后具有复制和表达功能。
9.基因工程：按照人为预愿获得目的基因，与载体拼接形成重组体，重组体转入宿主细胞，筛选和鉴定出含阳性重组体宿主细胞，经大量增殖，最总获得该目的基因决定的大量表达产物的过程。
10.同源重组（homologous recombination）：发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。
11.DNA克隆：在体内对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入适当细胞内，使其在细胞内扩增和繁殖，从而获得该DNA分子大量拷贝的过程，又叫基因克隆或重组DNA技术。
限制性核酸内切酶共5页
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物；必须具备一个选择性标志, 以便筛选；还要有一至多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求使用安全。
限制性内切酶小知识
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简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割 特异的双链DNA序列的一种内 切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分 裂DNA分子在一限定数目的专 一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
2．限制酶识别序列的结构 限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相 对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下： EcoRⅠ G↓AATTC；HindⅢ A↓AGCTT CTTAA↑G TTCGA↑A 有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在 两条链上的切割位置。 AccBSⅠ CCG↓CTC；BssSⅠ C↓TCGTG GGC↑GAG GAGCA↑C 有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ， 也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。 有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱 基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下： AlwNⅠ CAGNNNC↓TG；DdeⅠ C↓TNAG GT↑CNNNGAC GANT↑C
限制反应与甲基 化反应
限制作用是否需 用 ATP
分开的反应
No
互斥
Yes
同时竞争
Yes
限制酶识别的序列
限制性核酸内切酶是什么
限制性核酸内切酶是什么关于《限制性核酸内切酶是什么》，是我们特意为大家整理的，希望对大家有所帮助。
我们大家都了解，小朋友们的遗传基因全是来自于自身的爸爸妈妈的，因此许多的孩子们并不是像父亲便是像母亲，换句话说彻底便是父母在其中一个人的Q版，真是一棋一样的，那怎么会有这么大的不一样呢?实际上在基因遗传的DNA之中，有一个维护基因遗传平稳的物质，那便是约束性核苷酸内切酶了，这一东西就起着那么奇妙的功效，下边就来认识一下约束性核苷酸内切酶。
约束性核苷酸内切酶是能够鉴别特殊的脱氧核苷酸编码序列，并在每条链中特殊位置的2个多肽链中间的磷酸二酯键开展激光切割的一类酶，通称限制酶。
依据限制酶的构造，辅因子的要求切位与作用方法，可将限制酶分成三种种类，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。
Ⅰ型约束性内切酶既能催化反应寄主DNA的甲基化，又催化反应非甲基化的DNA的水解反应;而Ⅱ型约束性内切酶只催化反应非甲基化的DNA的水解反应。
III型约束性内切酶另外具备装饰及认知能力激光切割的功效。
主要用途：1、用以DNA基因物理学图普的建立;遗传基因的精准定位和基因分离;DNA分子碱基序列剖析;较为有关的DNA分子和遗传工程。
2、约束性核苷酸内切酶是由病菌造成的，其生理学实际意义是提升本身的防御力.3、限制酶一般不激光切割本身的DNA分子，只激光切割外源性DNA。
限定功效具体便是限制酶溶解外源性DNA，维护保养寄主基因遗传平稳的维护体制。
甲基化是普遍的装饰功效，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而遭受维护。
根据甲基化功效做到鉴别本身遗传信息和外地人遗传信息的目地。
因此，能造成防御力病毒感染浸染的限制酶的病菌，其本身的基因中可能有该酶鉴别的编码序列，仅仅该鉴别编码序列或酶切位点被甲基化了。
限制性核酸内切酶.
• (三)基因的甲基化研究 • 由于HPal仅能识别切割双链DNA分子中ccGG顺序,但其中Cyt必需是 设有甲基化的;而MPsI识别同样的顺序,但其中Cyt必需是被甲基化的。 因此有人利用这一对限制酶对真核基因的甲基化程度进行研究(1〕。 • (四）应用于DNA重组 • 分子生物学研究中发现的许多核酸酶类都可用作基因工程的工具。其 中能识别特定的回文序列并切割DNA双链的Ⅱ类限制性核酸内切酶在 DNA重组技术中被广泛应用。 • （五）构建载体 • 采用5'端引入1个限制性内切酶Xcm Ⅰ酶切位点的1对引物,以水稻品 种日本晴基凶组DNA作为模板,扩增得到一段627 bp的PCR片段.并将 其连接到pGEM-T Easy载体上得到名为T-xia的重组载体.利用限制性 内切酶Xcm Ⅰ酶切T-xia载体产生的自制T载体与其他PCR片段连接, 检测结果表明,有80%的重组菌能扩增出目的片段。
限制性内酶的应用
• 自从I型限制酶发现以来,越来越多地受到生化学家 的青睐,因为限制酶对DNA分子具有专一性的切口, 而为人们在分子水平上切割分析、重组遗传信息 提供了重要的工具。 • (一)用于染色体DNA的分析 • 先将DNA用限制性内切酶切割成一系列片段,利用 聚丙烯酷胺或琼脂糖电泳可以轻而易举地将上述 片段分离并且通过测定它们在凝胶中的迁移速度 或直接在电镜下观察测量它们的大小。这些碎片 在整个基因组的排列次序,主要靠几种不同的限制 酶部分水解DNA,再对产物进行电泳分析。
应用实例 -1
• 将水稻叶绿体的DNA，用EcoRI核酸限制性内切酶消化之 后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝 胶中作电泳分离。从LMP中分离出分子大小为1.8～2.5kb 之间的DNA片段，再与同样经过了EcoRI核酸限制性内切 酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒连 接。然后，将混合物转化到大肠杆菌5346菌株，培养在氨 苄青霉素选择平板上，形成Ampr转化子菌落群体。这样 就构成了由EcoRI核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体 DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的 玉米psbA DNA 探针作菌落杂交，可以分离出其中的阳性 克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA， 经过进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序 列。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶:是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类:根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用;另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。
例如:EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如:EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用:1、在甚因工程方面利用能产生“粘性末端” 的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面?(1)目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.(2)建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物;必须具备一个选择性标志, 以便筛选;还要有一至多种限制酶的作用位点(每种酶只有一个切口);也要求使用安全。
基因工程工具酶限制酶
4) 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需 的时间进行温育。
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(4)DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活 性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超 螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比 消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。
此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们 自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明 显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的 核苷酸成份的差造成的。
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在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核 酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用 Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内 切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”， 从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA 分子。
有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用 的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的 EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G AATTC 识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的 甘油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序列的特 异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序 列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的 识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。
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（2） 用一个写在右下方的标注字母代表 菌株或型，例如Ecok。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个 不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表 示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制 与 修 饰 体 系 分 别 表 示 为 HindI 、 HindII 、 HindIII等等。
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一、限制性内切酶(restriction enzyme) 1．限制性核酸内切酶的发现
第十五章限制性内切核酸酶讲解
第十五章限制性内切核酸酶一、填空题1.严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是——-------的酶。
基因工程中把那些具有识别------------------------------------------的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2．—---—--年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的--------------一现象。
3．1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为------——，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的—---------—。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20～40kDa，通常由—-----—亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链。
这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有—-------—专一性，也具有——------专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有--------——，产生末端的DNA片段或—----—的DNA片段。
作用时需要-------------作辅助因子，但不需要—------—和------------——。
6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1)一-------------------------(2)------------------------------------------------------------------。
7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别——----个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。
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EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT
Palindromic(回文序列）
EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG
Cutting sites
At least 1000bp away
At or close to recog. seq
24-26 bp away
Type II Recognition sequence characteristics （识别序列特点）——
Restriction endonuclease (origination)
• One component of the bacterial restriction-modification system, a natural defense mechanism of bacteria to against the introduction of foreign DNA into the cell • Restriction endonuclease: recognize a short, symmetrical DNA sequence, and cut DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence (kill foreign DNA) • Methylase: methylates C or A of the cellular DNA
blunt ends（平末端）
Enzyme and connection
Commo n enzyme
nomenclature（命名）
EcoRⅠ
属 种 株 序
Escherichia coli RY13株
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
同尾酶
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
限制酶—Cut
Restriction enzyme or restriction endonuclease 一种能选定特定DNA片段攻击的核酸酶 （nuclease）。 许多细菌（bacteria ）天生就会产生，用来 自我防御。 细菌产生的限制性核酸内切酶有两种特性：
只有特定的短序列（restriction site）會是攻擊的 目標。 細菌會在自己的restriction site(限制性内切点)加 上化學保護（甲基化, methylated）。
Restriction sequences（限制性识别序列）
5’ protruding ends
3’ protruding ends
Cohesive/sticky ends（粘性末端）
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC-OH+ 3’-GGGCCC-5’ 3’-GGG- p p -GGG-3’ OH-CCC-5’
palindrome（回文结构）
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
Flat end incision （平端切口）
G + GATCC G CCTAG Sticky end incision （粘端切口）
Restriction enzymes
(限制性核酸内切酶）
100108128
赵博
Overview
• • • Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragments Identified in the late 1960s Key discovery which allowed the DNA cloning to become a reality
Types of Restriction endonuclease
Type I
Functions Endonuclease & methylase
Type II
Endonuclease
Type III
Endonuclease
Conditions
ATP, Mg2+
Mg2+
ATP, Mg2+
Recognition sequences
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
isochizomer
(同功异源酶)
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC CCTAG + G
BstⅠ GGATCC CCTAGG G + GATCC G CCTAG