无动物源成分培养基用于人脐带间充质干细胞培养的研究

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无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞

无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80%汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)是从人脐带组织中分离的间充质干细胞,具有增殖能力,如:神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力,由于脐带体外细胞能迅速扩增,生物性能稳定,取材比较容易并且细胞来源相对广泛,在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景,已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞

比较不同培养基培养脐带间充质干细胞作者:王蓓来源:《医学信息》2014年第20期摘要:目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基,但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制,存在不安全因素。

通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12(不含酚红)及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增,比较三种培养体系的优略。

建立从减血清到无血清的培养体系,减少血清对临床细胞治疗的干扰,提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。

关键词:有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究,脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增,且生物性能稳定,多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。

同时脐带间充质干细胞还具有取材方便,无伦理学限制,免疫原性相对纯净的优势,可以为实验和临床提供足够的细胞来源。

1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意,采集足月剖宫产健康胎儿脐带,无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中,4℃保存,6h内无菌处理。

1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带:用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm,D-hank's液充分洗涤,去除脐静脉及动脉内的新鲜血液,分离并去除脐带外膜组织和血管组织,获得脐带wharton胶。

将其剪碎至1mm3组织块,使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底,密度20~25块/瓶为宜,组织小块在瓶底要分布均匀,倒置放入37℃,体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

3~5h后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内,加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。

72h后换液,一般5~7d可有间充质干细胞爬出。

1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后,在IMDM、DMEM/F12(不含酚红)、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养,在生长过程中进行形态学观察。

临床研究用人间充质干细胞质量评价

临床研究用人间充质干细胞质量评价

临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞(MSCs)由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点,被广泛用于临床研究。

在众多疾病的治疗中,MSCs 都展现出了巨大的潜力。

然而,要确保其在临床研究中的有效性,首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。

本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。

二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性:这是MSCs质量评价的核心指标。

纯度是指MSCs中目标细胞的比例,而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。

2、细胞的遗传稳定性:通过基因测序等方法,可以检测MSCs是否存在基因突变,以及是否存在潜在的致癌风险。

3、细胞的免疫调节特性:MSCs具有免疫调节特性,可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。

因此,评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。

4、细胞的来源和生产过程:MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。

例如,来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。

同时,生产过程中的质量控制,如无菌操作、细胞培养基的质量等,也会影响MSCs的质量。

三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察:通过观察MSCs的形态,可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。

2、生长曲线测定:通过绘制MSCs的生长曲线,可以评估其增殖能力。

3、细胞表面标志物检测:通过检测细胞表面标志物,可以确定MSCs 的纯度和活性。

4、染色体核型分析:通过染色体核型分析,可以评估MSCs的遗传稳定性。

5、免疫调节特性检测:通过检测MSCs对免疫反应的调节作用,可以评估其免疫调节特性。

6、生产过程质量控制:通过监控生产过程中的关键控制点,可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。

四、结论人间充质干细胞(MSCs)在临床研究中的应用前景广阔,但其质量评价是关键环节。

通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价,可以确保其满足临床研究的需求。

脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究

脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究

前持评件耐觅 Drug Evaluation Research 第43卷第12期2020年12月• 2385 ・脐带来源间充质干细胞的免疫抑制功能研究杨 莹,李政楠,王秀娟,李 伟,牟春琳,金 星,徐永胜•天津长和生物技术有限公司,天津301925摘 要:目的观察人源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对异体总淋巴细胞和不同淋巴细胞亚群增殖能力的影响,以及对 细胞因子分泌的影响。

方法分离并培养hUC-MSCs 及健康成人外周血淋巴细胞,以淋巴细胞为阴性对照,MTT 法检测共 培养(淋巴细胞:hUC-MSCs 为1:0.5、1 : 1、1 : 5、1 : 10) 3 d 后淋巴细胞的增殖情况;流式细胞仪检测共培养体系中 CD4 CD25 FOXP3\ CD3 CD16* C D56\ CD4 CD45RA CCR7*的细胞比例;ELISA 法检测白细胞介素(IL) -2、IL-4、IL-10、 Y-干扰素(INF-?)细胞因子分泌情况。

结果 与阴性对照组比较,hUC-MSCs 对淋巴细胞的增殖具有显著抑制作用(P< 0.05),抑制效果随数量增加而增强;hUC-MSCs 能够显著增加共培养体系中CD4CD25FOXP3*细胞比例(PV0.05),显著 降低CD4*C D45RA'CCR7‘细胞比例(PV0.05),对CD3 CD16 CD56*细胞比例无显著影响;hUC-MSCs 能够显著降低IL-2、 IL-4、INF-y 水平,显著增加IL-10的分泌水平(P<0.05)。

结论hUC-MSCs 具有免疫抑制功能。

收稿日期:2020-09-11基金项目:国家重点研发计划"干细胞及转化研究"重点专项(2019YFA0112100);天津市科技计划项目(17ZXXYSY00020)*通信作者:徐永胜 E-mail :***********************关键词:脐带间充质干细胞;淋巴细胞;免疫反应;细胞因子中图分类号:R329 文献标志码:A 文章编号:1674-6376 (2020) 12-2385-05DOI : 10.7501/j.issn.l674-6376.2020.12.005Research on immunosuppressive function of umbilical cord mesenchymal stem cellsYANG Ying, LI Zhengnan, WANG Xiujuan, LI Wei, MU Chunlin, JIN Xing, XU Yongsheng Ever Union Biotechnology Company Limited, Tianjin 301925, ChinaAbstract: Objective To observe the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) on the proliferation of allogeneic total lymphocytes and different lymphocyte subsets, as well as the secretion of cytokines. Methods hUC-MSCs and peripheral blood lymphocytes of healthy adults were isolated and cultured; MTT method was used to detect the proliferation of lymphocytes by after co-culture for 3 days; the proportion of CD4+CD25 FOXP3 ., CD3 CD16 CD56* and CD4 CD45RA CCR7 in the co-culture system was detected by flow cytometry; ELISA was used to detect the secretion of IL-2, IL-4, IL-10 and INF-y. Results hUC-MSCs could significant inhibit the proliferation of T lymphocytes, and the anti-proliferative effect was enhanced with the increase of the number of lymphocytes; the proportion of CD4 CD25 FOXP3 cells in co-culture system was increased by hUC- MSCs (P < 0.05); the proportion of CD4TD45RA +CCR7+ cells showed a downward tendency, and the difference was statistically significant (P < 0.05); however, there was no significant difference in CD3 CD16 CD56+ cells. hUC-MSCs could reduce the levels of IL-2, IL-4 and INF-y, but increase the secretion level of IL-10, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusion HUC-MSCs had immunosuppressive function.Key words: umbilical cord mesenchymal stem cells; lymphocytes; immune response; cytokines间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 来源于发育早期的中胚层和外胚层,属于多能干细 胞,因其具有多向分化潜能⑴、造血支持和促进干细 胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人 们的关注。

临床研究用人间充质干细胞质量检验规范-讨论版

临床研究用人间充质干细胞质量检验规范-讨论版

临床研究用人间充质干细胞质量评价规范(讨论稿)前言人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞,广泛存在于胎儿和成人各组织中,如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱,以及新生儿附属组织,如脐带、胎盘、羊膜等等组织。

除一定程度的分化潜能外,hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能,参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡,帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境,以促进损伤组织细胞的修复或再生。

hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症,并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。

过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示,不同组织来源的hMSCs均具有不同程度,针对不同临床适应症的治疗效果。

目前在登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种,其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮,等等。

然而,无论是临床前或临床研究阶段,现有的研究结果仍都存在不同程度的问题,而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。

其中临床前研究所表现的问题是,不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异,也存在质量评价内容和技术的合理性等问题,因此导致不同研究者间的研究结果很难具有可比性,或结果难以重复,因此也很难形成相对统一的质量标准。

而临床研究中所存在的问题是,绝大多数临床研究还处在早期阶段,所观察的病例数还很有限,临床研究中细胞质量的标准化和细胞使用的规范性仍存在巨大差异,所有这些尚不足以完全支持hMSCs的安全性和/或疗效。

除此以外,因hMSCs临床前研究还远不够完善,对其临床研究的指导作用还不强,或者临床前研究与临床研究存在严重脱节现象,临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺,细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立,等等。

不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较

不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较

不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较作者:王丽娟来源:《赤峰学院学报·自然科学版》 2011年第7期王丽娟(赤峰学院医学院,内蒙古赤峰 024000)摘要:比较不同密度下DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血间充质干细胞的效果,发现应用IMDM培养基以2.0×106个细胞/ml的密度接种在培养瓶底可以完全铺层,而且加入碱性成纤维细胞因子可以显著加快脐血间充质干细胞的贴壁、伸展和铺层的速度.关键词:脐血间充质干细胞;培养基;生长过程中图分类号:R329 文献标识码:A 文章编号:1673-260X(2011)07-0037-02实验证明间充质干细胞(MSC)存在于身体的很多部位,骨髓和脐血是间充质干细胞的最主要来源.体外分离培养骨髓间充质干细胞已被广泛应用于各研究领域,而对人脐血中的MSC的研究尚处于起步阶段.在培养方面还没有统一的方法,培养的方案也各不相同.本试验分别应用DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基对脐血单个核细胞进行培养,比较不同细胞密度下各种培养基培养脐血MSC的效果,并对培养出的脐血MSC的生长过程进行了研究.1 材料和方法1.1 脐血新鲜脐血由赤峰学院附属医院提供.在征得产妇同意后,无菌条件下采集新生儿脐血,用肝素抗凝.1.2 脐血MSC的分离和培养取血后12h内,用Ficoll-Hypaque分离液分离单个核细(MNC),并用PBS培养液洗涤3次,然后分别用含20%的胎牛血清(杭州四季青)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的IMDM 完全培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-LG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-HG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的α-MEM培养基调整细胞密度,每种培养基各自调整的密度分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0×106/ml,种植于培养瓶中,然后于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养.2 结果2.1 不同培养条件对脐血间充质干细胞的贴壁、生长的影响在使用同一批号血清的情况下,几种培养基培养脐血间充质干细胞的情况如下:DMEM-LG 培养基和DMEM-HG培养基有大量的细胞贴壁,但贴壁的细胞形状多样,有圆形、椭圆形、多角形等不规则形状,生长缓慢,随着培养天数的增加,贴壁的细胞都脱落下来.α-MEM培养基仅有少量的细胞贴壁,且贴壁的细胞是圆形或椭圆形,扁平的,几乎无生长,随着培养天数的增加,也都脱落下来.IMDM培养基培养出的细胞呈纤维状,形成克隆,并逐渐扩张.2.2 脐血间充质干细胞的最适接种密度细胞以不同密度接种于培养瓶中,并于倒置显微镜下进行观察.结果发现,在各个密度下,DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基和α-MEM培养基均没有完全铺层,20天后都脱落下来.而应用IMDE培养基,以0.6~0.9×106个细胞/ml的密度接种后,细胞贴壁稀疏甚至不贴,间距大,生长缓慢,随培养时间的延长,贴壁的细胞也都从瓶底脱落下来.以密度为2.0×106个细胞/ml接种时,细胞活性好,生长旺盛,形态为有规则的束状.密度在4×106/ml及其以上时,细胞生长拥挤,培养基消耗快,短时间内变黄,虽有大量细胞贴壁,但细胞贴壁不牢固.经过3次换液后,大部分贴壁细胞又都脱落下来.由此可见,最适合细胞贴壁的接种密度在2.0×106个细胞/ml左右.密度高于或低于2.0×106个细胞/ml,细胞不贴壁或贴壁状态不好.2.3 脐血间充质干细胞的生长过程脐血单个核细胞接种后,定期显微镜观察:24h可见细胞贴壁,最初细胞为圆形或不规则散在分布,有时与破骨细胞混杂存在.48h可见贴壁细胞增多,细胞周边开始伸出小突起,细胞呈条形或多角形(图A).72h更多的细胞伸出突起,且细胞突起变长变大,折光性强,为类似成纤维细胞样的长梭形细胞,少数细胞可见微绒毛(图B).1周可见成纤维细胞样的长梭形细胞更多,有的细胞开始接触(图C).2周可见细胞集落融合成片,细胞排列有一定的方向性,呈漩涡状生长(图D).3 讨论目前大量的研究已经证明脐血中存在间充质干细胞,本试验的结果也证明了这一结论.但是脐血中的MSC的量要小于骨髓中的MSC的量,而且也并不是每份脐带血中都能培养出间充质干细胞,培养条件各家实验室的报到也不尽相同.本实验在加入同一批次的胎牛血清和20μg/L的bFGF的条件下比较了DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血MSC的效果,发现IMDM培养基培养的细胞能够伸展且在培养瓶底部形成一层同源的纤维细胞层,可见本试验条件下IMDM培养基效果较好.不同的培养密度对细胞的生长也有影响,密度过低,细胞相互作用较少,联系少,细胞很难生长;密度过高,细胞过于拥挤,接触抑制,也很难生长,且培养基中的营养很快被消耗掉,为补充营养需频繁换液,细胞未牢固贴壁就掉下来,更不利于细胞的生长.本试验在贴壁较好的IMDM培养基的条件下2.0×106个细胞/ml是最适合细胞贴壁的接种密度.本试验培养基中加入了20μg/L的bFGF,从培养结果发现加入bFGF后比未加任何外源性生长因子[1]培养的脐血MSC贴壁要早,伸展的也要早,且能提前2周在培养瓶底完全铺层,这结果也与俞猛等报到的bFGF能够促进间充质干细胞的增殖的结果一致[2].这一试验对脐血MSC的培养条件进行了初步的研究,至于脐血MSC细胞间相互作用的机制及其分化、分化机制和分化后移植效果都有待于进一步研究.——————————参考文献:〔1〕王丽娟,张叶萍,王金福,等.脐血间充质干细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用.[J]中华血液学杂志,2005,26(2):65-68.〔2〕俞猛,夏仁云,高飙,等.bFGF和地塞米松对骨髓基质干细胞增殖与分化的影响[J].中国康复,2006,21(1):12-15.。

人脐带间充质干细胞培养上清对米非司酮处理的人子宫内膜基质细胞存活、凋亡和子宫内膜容受性的影响

人脐带间充质干细胞培养上清对米非司酮处理的人子宫内膜基质细胞存活、凋亡和子宫内膜容受性的影响

第 50 卷第 1 期2024年 1 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.50 No.1Jan.2024DOI:10.13481/j.1671‑587X.20240110人脐带间充质干细胞培养上清对米非司酮处理的人子宫内膜基质细胞存活、凋亡和子宫内膜容受性的影响武梦雪, 陈士玲, 刘艳, 米旭光, 林秀英, 付建华, 方艳秋(吉林省人民医院生殖医学中心,吉林长春130021)[摘要]目的目的:探讨人脐带间充质干细胞培养上清(hUCMSCs-Sup)对米非司酮(Ms)处理的人子宫内膜基质细胞(hEndoSCs)增殖、凋亡和子宫内膜容受性的影响,并阐明其可能的作用机制。

方法方法:体外培养hEndoSCs,分为对照组和40、60、80及100 μmol·L-1 Ms组,MTT法检测各组细胞存活率。

hEndoSCs分为对照组、40 μmol·L-1 Ms组和60 μmol·L-1 Ms组,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平并计算Bcl-2/Bax比值。

hUCMSCs-Sup作用后,hEndoSCs分为对照组、Ms组、Ms+hUCMSCs-Sup组和Ms+hUCMSCs-Sup+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,MTT法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)和微管相关蛋白1轻链3B-Ⅰ(LC3B-Ⅰ)蛋白表达水平并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中子宫内膜容受性标志分子mRNA表达水平。

结果结果:与对照组比较,40、60、80和100 μmol·L-1 Ms组细胞存活率明显降低(P<0.05),且具有时间和剂量依赖性。

人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册说明书

人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册说明书

产品描述人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册产品规格:400mL产品货号:PD-019人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基专门为人脐带间充质干细胞成脂诱导分化而开 发,针对人脐带间充质干细胞的特性优化分化试剂的配方,可增加人脐带间充质干细胞的成脂 分化效果。

本产品含血清成分,仅用于科研用途,不可用于诊断、治疗、临床及其他用途。

培养基组成成分●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP1:成分名称添加体积175 mL 20 mL 2 mL 2 mL 400μL 200μL 200μL 人脐带间充质干细胞成脂诱导分化诱导基础培养基 ADP1FBS谷氨酰胺 Glutamine青链霉素 Pennicillin-Streptomycin胰岛素 InsulinIBMX罗格列酮 Rosiglitazone地塞米松A Dexamethasone 200μL●人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP2(维持培养基)成分名称添加体积人脐带间充质干细胞成脂诱导分化基础培养基 ADP2175 mL FBS20 mL 谷氨酰胺 Glutamine2 mL 青链霉素 Pennicillin-Streptomycin2 mL 胰岛素 Insulin 400μL油红-O 染色液 10 m L操作流程一、人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基的准备注:各成分请根据试剂管上标签标示温度保存。

地塞米松A和地塞米松B浓度不同,不能混用。

染色液1.本产品为试剂盒型,使用前需将试剂盒内各成分试剂混匀。

(请勿将 ADP1 与 ADP2混淆)2.使用前,请将血清置于4℃解冻,直至血清完全溶解;待血清完全溶解后,将所有添加物置于室温溶解。

待试剂完全溶解后,轻轻摇晃使试剂混合均匀(低于 500μL 体积的试剂无需此操作)。

注:为了保证微量试剂的使用效果,请将低于 200μL 的试剂管进行短暂离心,使试剂能全部收集至管底。

3.按上述两个成分表,将表一 ADP1 中的 FBS、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松A等试剂按体积大小先后加入到诱导基础培养基中;混合均匀后做好标识,培养基即可使用。

MesenGro中文说明书

MesenGro中文说明书
导读:MeseMesenGro化学成分明确人类间充质干细胞培养培养基(以下简称MesenGro)是为扩增从骨髓、脐带血脐带血或脂肪组织提取的
人类间充质干细胞(humanmesenchymalmesenchymalstemcells,hMSCs)而设计的无血清培养基。MesenGro化学成分明确,所有组分为化学合成或重组纯化的蛋白。
复苏hMSCs细胞:
1. 37°C水浴快速复苏冻融细胞。
2. 将细胞转移到50ml离心管中。
3. 逐滴向装有1mL细胞液的离心管中加管中加入10ml预先复温的MesenGro完全培养基,注意边意边加边轻轻晃动离
心管。
4. 将上述混合溶液转移到细胞培养瓶或细或细胞培养板中。或者可250xg(~1200rpm)离心10min0min,再用MesenGro
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其它所需试剂
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选择不铺板: 建议使用BD公司的Primarrimaria 系列培养板 (如25 cm 培养板, BD货号3538083808),
或 Corning公司的CellBIND 系列培养板 (如25 cmcm 培养板, Corning货号3289) 选择铺板: Fibronectin (StemRD货号FibroFibro-10) TrypLEExpress (GIBCO #12604)或胰酶胰酶(Trypsin 0.05%/0.53mM EDTA) ? ?2TM2
11. 4-6%CO2,37°C培养。
12. 每隔2天换新鲜的MesenGro完全全培养培养基。
13. 当细胞量达到70-80%满时,传代(一般每隔3-4天)。切记,在任何情况下,不要让细胞细胞超过80%满! 242532

间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方

间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010110451.6(22)申请日 2020.02.21(71)申请人 广东国科细胞科技有限公司地址 510000 广东省广州市黄埔区(广州国际生物岛)螺旋四路一号生产区第二层201单元(72)发明人 陈海佳 陈东煌 戚康艺 姜交华 岳坤 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 温可睿(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法(57)摘要本发明涉及干细胞培养技术领域,尤其涉及间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法。

本发明提供的间充质干细胞无血清培养基包括氨基酸类、维生素类、无机盐类、pH缓冲剂、脂类、核酸类和其他物质,该培养基能够为细胞的生长、增殖提供充分的养分,更加适合MSCs无血清条件及高密度培养,从而获得良好的培养效果。

本发明还提供了一种补充因子,其包括激素及生长因子、贴壁因子、抗氧化成分、脂类、大豆胰酶抑制剂和大豆水解物。

该补充因子配合本发明所述的无血清培养基使用,能够保证在无动物源组分添加的情况下,干细胞能够快速增殖,且保持良好的干性。

权利要求书7页 说明书24页 附图3页CN 111440764 A 2020.07.24C N 111440764A1.间充质干细胞的无血清培养基,其特征在于,包括:氢基酸类、维生素类、无机盐类、pH缓冲剂、脂类、核酸类和其他物质;所述的氨基酸类包括:甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸;所述的维生素类包括:维生素C、生物素、氯化胆碱、泛钙素、叶酸、维生素B2、维生素B12、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、肌醇和烟酰胺;所述无机盐类包括:氯化钙、五水合硫酸铜、七水合硫酸铁、硫酸镁、硫酸锰、七水合硫酸锌、柠檬酸铁、氯化钠、氯化钾、氯化锂、丁酸钠、钼酸铵、六水合氯化镍、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠;所述pH缓冲剂类包括:碳酸氢钠和Hepes;所述脂类包括:亚油酸所述核酸类包括:腺嘌呤和胸苷;其他物质类包括:葡萄糖、腐胺、硫辛酸和丙酮酸钠。

聊一聊间充质干细胞的工艺开发难点

聊一聊间充质干细胞的工艺开发难点

聊一聊间充质干细胞的工艺开发难点随着CAR-T产品在国内的上市,今年也被称为是中国的CAR-T元年,可以预见不久的将来陆续将会有更多的免疫细胞治疗产品上市。

然而,作为比CAR-T研究更早的细胞产品,间充质干细胞产品上市的形势却依然不太明朗。

同样的情况也发生在美国,美国食品药品监督管理局(FDA)至今没有批准过一款真正意义上的间充质干细胞产品(下文简称MSC产品)上市。

目前处在临床研究阶段、离获批上市比较接近的是Mesoblast公司的Remestemcel-L,它是一款骨髓来源、可用于异体移植的MSC产品。

适应症为儿科患者SR-aGVHD,在2020年提交了NDA申请。

依据Mesoblast披露的数据,在其3期临床试验中,28天OR达70%,100天OS达75%。

但是FDA还是提出了一些担忧,包括临床有效性的证据不充分、产品有效性检测指标与临床效果关联性不强等。

MSC产品走向上市,药学研究是基础,稳定成熟的生产工艺则是实现细胞治疗产品成为药品这一转化过程中的关键要素。

以下四个工艺开发中的难点,是笔者认为的、目前影响MSC产品通向成功上市大道上的四大拦路虎。

培养体系作为饲养细胞所不可或缺的“饲料”,培养基及其添加物组成的培养体系,在细胞治疗产品的生产中,属于最重要的原料。

它就相当于燃料对于火箭、芯片对于计算机来说一样的重要。

目前MSC培养基可以分为如下五类(TABLE 1),基础培养基加5%或10%胎牛血清是常见的培养体系,研究表明,αMEM或DMEM/F12较适合于MSC的培养,低糖的环境更加接近生理环境,也更利于维持MSC的特性。

胎牛血清中含有丰富的生长因子及贴壁因子,一些研究者通过外源添加一些生长因子来降低对FBS的依赖,例如EGF、FGF、PDGF等。

但是,由于FBS来源于动物,存在着动物病毒传播的风险。

同时,输注后,也可能存在病人对异种蛋白产生免疫反应的风险。

虽然目前美国、欧盟等国家未禁止FBS的使用,但作为原材料,应对其建立严格的质控,尤其是避免引入TSE/BSE(海绵状脑病)风险。

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( 1 . E n d o s c o p i c C e n t e r o f t h e F i r s t A f i l i a t e d H o s p i t a l o f S h a n t o u U n i v e r s i t y Me d i c a l C o l l e g e ,
U n i v e r s i t y Me d i c a l C o l l e g e , S h a n t o u , 5 1 5 41 0 C h i n a )
Ab s t r a c t : O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a x e n o / s e r u m —f r e e m e d i u m f o r h u m a n u m b i l i c a l c o r d m e s e n c h y ma l s t e m c e l l s
胞 的分化 能力 。结论 本 室制备 的无 动物 源成 份无 血清培养基 X F / S F—MS C M 可支持脐带 间充 质干细胞 的体外
扩增 , 维持其免疫学表 型及分 化潜能 , 提 供数量 充足 的高 质量 间充质 干细 胞 , 满 足 临床治疗 及生 物医学 研究 的需
要。
关键 词 : 脐带 间质 干细胞 ; 无血清培养基 ; 细胞培养 ; 增殖
中图分类号 : R 3 文献标识码 : A 文章编号 : 1 6 7 2— 2 6 3 9 ( 2 0 1 5 ) O 1 — 0 0 0 1 —0 4
Cul t ur e o f h um a n u mb i l i c a l c o r d me s e n c hy ma l s t e m c e l l s b y Xe no /s e r u m — . f r e e me d i a m REN C h u n — h o n g . ZHA NG Xi n
M S C M与 S C— M S C M 两种培养基 中连续培养传代 , 细胞增 殖能力 及形态 无显著差 别 。两组 P 代细胞 的生长 曲线
相似 , 但X F / S F—MS C M组 间充质 干细胞贴壁的 紧密程度 稍低 ; 流式 细胞检测 结果显 示 , X F / S F—MS C M组 细胞 保 持 了间充质 干细胞的免疫学表 型 , 高表达 c D c D c D , 不 表达 C D C D 弘、 C D 并 维持 了 良好 的成 骨和脂 肪细
a n d c o n s e c u t i v e l y p a s s a g e d i n o u r h o me ma d e x e n o / s e r u m —f r e e m e d i u m( X F / S F—M S C M)a n d c o n v e n t i o n l a s e r 。
MS C s w e r e i s o l a t e d f r o m Wh a r t o n " s J e l l y o f u mb i l i c a l c o r d o f h e lt a h y n e w b o r n . C e l l s w e r e r e s p e c t i v e l y ma i n t a i n e d
( h U C—MS C s )a n d e v l a u a t e i t s c a p a c i t y t o s u p p o r t t h e e x p a n s i o n o f h U C— MS C s i n v i t r o . Me t h o d s P r i m a r y h U C—
无 动 物 源 成 分 培 养 基 用于 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞 培 养 的研 究
任 春 红 , 张 昕
( 1 .汕 头 大学 医学 院第 一 附属医 院 内镜 中心 ; 2 .汕头 大 学 医学 院第一 附属 医 院 内镜 中心 中心 实验 室 , 广 东 汕头 5 1 5 0 4 1 )
第 1 3卷第 1期 2 0 1 5年 3月
延安 大学学报( 医学科学版 ) J o u r n a l o f Y a n a n U n i v e r s i t y( M e d S c i )
Vo L l 3 No .1 Ma L 2 01 5
摘 要: 目的 建立一种无动物源成份 无血清的间充质干细胞培养基 X F / S F—MS C M, 并探讨其支持人 脐带 间充 质 组织块 贴壁法分离 获得原代 人脐带 间充质 干细胞 ,
干细胞 ( h U C— MS C s ) 体外增殖 、 维持分化潜能 的效果 。方法
P . 代起分别使用 自制 的 X F / S F—MS C M 培养基与含 1 0 %胎 牛血清 的传 统培养基 ( S C—MS C M) 对 脐带 间充质干 细 胞进行连续 培养传代 至 P 6 代, 观察 比较两组 P 6 代 细胞 的形态及 增殖能力 , 以流式细 胞术检测 连续传 代后细胞 的 免疫学表型 , 比较其成 骨 、 成脂 肪 的分 化潜 能 。结 果 分离 获得 的原 代 P 。脐带 间充 质干 细胞 , 分别 在 X F / S F—
S h a n t o u, 5 1 5 0 4 1 C h i n a; 2 . C e n t r a l L a b o r a t o r y o f t h e F i r s t Af i f l i a t e d Ho s p i t a l o f S h a n t o u
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