金免疫层析试验(dot immunogold chromatographic assay,DICA)

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结核病的实验室诊断方法及评价

结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。

耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。

因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。

1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。

其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。

2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。

3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。

基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。

多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。

这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。

由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。

胶体金免疫层析技术原理

胶体金免疫层析技术原理介绍胶体金免疫层析技术（Colloidal Gold Immunochromatography Test）是一种常用于快速、便捷地检测生物体内特定分子的方法。

该技术基于免疫层析原理，利用胶体金颗粒作为信号指示剂，实现对目标分子的高灵敏检测。

原理胶体金免疫层析技术主要依赖于抗原-抗体的专一性识别和相互结合。

当胶体金颗粒与特异性抗体结合后，形成颗粒/抗体/抗原复合体。

通过将样品与含有抗原的试剂盒进行反应，可使目标分子与胶体金颗粒上的特异性抗体结合，形成颗粒/抗体/抗原/目标分子复合体。

操作步骤使用胶体金免疫层析技术进行检测通常需要以下步骤：1.样品处理–收集待测样品，并进行必要的前处理，例如离心、稀释等。

–如果样品是固体，需要先进行溶解或悬浊处理。

2.反应溶液的制备–根据试剂盒的说明书，将试剂溶解或稀释到适当的浓度。

3.准备试剂盒–打开试剂盒包装，并将提供的试剂按照指示加入到试剂盒中。

4.加样–使用专用的吸管或滴管，将处理好的样品滴入试剂盒的样品孔中。

5.反应–让样品与试剂盒中的抗体共反应一定时间，通常为几分钟。

6.拍照解读–将试剂盒放置在专门的解读器上，并对结果进行解读。

–解读器会对胶体金颗粒的颜色进行分析和判断，从而得出检测结果。

7.结果判读–根据解读器显示的结果，确定样品中目标分子的存在与否。

–通常，胶体金免疫层析技术结果可分为阴性、阳性或无效，具体判读标准需根据试剂盒说明书确定。

优势和应用领域胶体金免疫层析技术具有以下优势和应用领域：1.快速：检测时间短，通常在几分钟内可以得出结果。

2.简便：操作简单，无需复杂的设备和专业技术人员。

3.准确：具备高灵敏性和特异性，可以有效地识别目标分子。

4.可视化：结果直接显示在试剂盒上，无需显微镜等设备。

5.应用广泛：可以用于临床医学、环境检测、食品安全等多个领域。

局限性和发展趋势胶体金免疫层析技术虽然具有许多优点，但也存在一些局限性：1.灵敏度限制：相比于其他方法，如PCR和ELISA，胶体金免疫层析技术的灵敏度相对较低。

第5章常见免疫学检测技术-胶体金免疫层析

（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
LA T E R A L FLO W T E S T S T R IP O F V E D A LA B
30
（三）胶体金免疫测定技术
§ （2）胶体金免疫层析
©①双抗体夹心法
• 固定于膜上的抗体1＋标本中待测抗原＋金标记的抗体2显色
• 用于测抗原
原 • 是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术理 • 将结合各的种以反应微试孔剂滤分膜点为固载定体在的测快试速版的相固应相
• 通区膜域过免，毛疫检细分测析管标作技用术本加使在样试品纸溶条液的在一层端析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记抗体显色
§ 最初应用于免疫组化染色，随后发展到以膜为载体的免疫测定技术
一、胶体金标记免疫检测应用现状
§ 胶体金标记技术具有简单、快速、灵敏等特点，得到了广泛应用
§ 20世纪90年代兴起的胶体金免疫层析技术，特别是试纸条的发展，使操作更加方便快捷
§ 胶体金标记免疫检测技术在临床医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测，以及抗原抗体分析等诸多领域迅速发展
食品食品安全检测中心, 农兽药残留（磺胺类、瘦肉精
安全各监管部门
等）,大肠杆菌,黄曲霉素
--
瘦肉精
沙丁胺醇
--
瘦肉精
沙丁胺醇
—
瘦肉精
克伦特罗
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
瘦肉精—莱克多巴胺
—
兽药
恩诺沙星
致病菌--大肠杆菌O157

即时检测技术的概念、原理与分类

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9
四、POCT技术的分类
（二）多层涂膜技术多层涂膜技术是从感光胶片制作技术引申而来
的，也属于干化学测定，将多种反应试剂依次涂布在片基上并制成干片。这种干片比运用简单显色技术的干化学纸片均匀平整，用仪器检测，可以准确定量。
按照干片制作原理的不同，可分为采用化学涂层技术的多层膜法和采用离子选择性电极原理的差示电位多层膜法。
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11
多层涂抹技术化学法干片结构及功能示意图
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12
四、POCT技术的分类
2．差示电位多层膜法该类仪器使用的膜片包括两个完全相同的“离子
选择性电极”，均由离子选择敏感膜、参比层、氯化银层和银层组成，并以一纸盐桥相连。
测定时取血清和参比液分别加入并列而又独立的两个电极构成的加样槽内，即可测定两者的差示电位。
2
• 即时检测（point-of-care testing,POCT)技术作为检验医学的重要组成部分，不仅提高了检验速度和方便程度，并具有实验仪器小型化，操作方法简单化，结果报告即时化等优点，在检验医学中得到了较大的发展和应用。
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3
一、POCT的概念
• POCT是指在病人旁边分析病人标本的分析技术，或者说只要测试不在主实验室做，并且它是一个可移动的系统，就可以称为POCT。
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6
比P较O项CT目与传统实验P室O检CT测的主要传不统实同验点室检测
周转时间
快
慢
标本鉴定标本处理
血标本操作步骤
校正试剂检测仪对操作者的要求单个试验花费试验结果质量
简单不需要多为全血
简单不频繁随时可用
简单普通人亦可以
高一般

免疫层析法胶体金法

免疫层析法胶体金法免疫层析法（Immunoassays）是一种常用的生物化学分析方法，可以用来检测和测量样品中的特定分子。

它基于抗体和抗原之间的特异性相互作用，利用这种相互作用来检测和量化感兴趣的分子。

胶体金法（Colloidal Gold）是一种常用的免疫层析法的检测方法。

它利用胶体金颗粒的特殊性质，结合抗体和抗原的特异性相互作用，实现对目标物质的定性和定量分析。

免疫层析法的原理是利用抗体与抗原的特异性结合，从而实现对目标物质的检测。

在胶体金法中，胶体金颗粒被偶联上特异性的抗体，形成胶体金标记物。

当样品中存在目标物质时，胶体金标记物会与目标物质结合形成免疫复合物。

这个免疫复合物可以通过免疫层析膜迁移，最终形成可见的条纹或颜色变化。

胶体金法的优势在于其操作简便、结果直观、灵敏度高和特异性好。

它可以应用于多种领域，如临床医学、食品安全、环境监测等。

在临床医学中，胶体金法常用于检测生物标志物，如肿瘤标志物、感染性疾病的病原体等。

在食品安全领域，胶体金法可以用来检测食品中的有害物质，如农药残留、重金属等。

在环境监测中，胶体金法可以用于检测水体、土壤等环境样品中的污染物。

使用胶体金法进行免疫层析分析的步骤一般包括样品预处理、胶体金标记物的制备、样品与标记物的反应、免疫层析膜的制备以及结果的读取和分析等。

首先，需要对样品进行预处理，如提取、纯化或稀释等，以获得适合分析的样品。

然后，制备胶体金标记物，将特异性抗体与胶体金颗粒偶联。

接下来，将样品与标记物反应，使目标物质与胶体金标记物结合形成免疫复合物。

然后，将反应混合物加载到免疫层析膜上，免疫复合物会随着溶液的迁移在膜上形成条纹。

最后，通过肉眼或专用的读取设备对条纹进行观察和分析，根据条纹的颜色、强度和位置等来判断目标物质的存在与浓度。

虽然胶体金法在免疫层析分析中具有许多优点，但也存在一些局限性。

首先，胶体金颗粒的稳定性较差，容易聚集和沉积，影响结果的准确性和可重复性。

免疫检验第十一章固相膜免

检测蛋白质
检测激素检测药物
41
小
结
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性，像滤纸一样，固相膜可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行，利用这种性能建立了多种类型的快速检验方法。固相膜免疫测定包括了斑点金免疫渗滤试验、免疫层析试验、斑点ELISA 、免疫印迹法。
• 又称酶联免疫电转移印迹法（EITB）， • 又称Western-blot 。 • SDS-PAGE高分辨率＋Ag-Ab反应的高特异性
36
(一)原理
37
（二）技术要点
– SDS-PAGE
– 电转移
– 酶免疫定位
应用：因可确定蛋白组份的分子量，可用
于分析抗原组份及其免疫活性，也可用于疾病的诊断，如AIDS的确诊试验
2
第一节胶体金免疫技术
(colloidal gold immunoassay)
胶体金也称为金溶胶，是金盐被还原成
金原子后形成的金颗粒悬液。
稳定性
• 胶体金胶粒间的相互吸引力 • 胶体金胶粒及其溶剂化层的带电情况 • 胶体界面的溶剂膜
聚沉现象 : 电解质 \ 温度 \ 浓度
3
（二）胶体金的制备
2. 抗原抗体反应
– 滴加样品血清 – 洗涤后滴加酶标二抗
3. 显色反应
– 滴加底物
34
（三）方法学评价
1. 灵敏度高（因NC膜吸附蛋白的能力强，所以比普通 ELISA 高6～8倍） 2. 省试剂（比ELISA节约10倍） 3. 操作简便，不需特殊设备 4. 结果可长期保存（－20℃半年）
35
二、免疫印迹法（IBT）
操作方法

第十一章金免疫技术【52页】

（1）制片（2）滴加特异抗体（3）封闭（4）滴加SPA-胶体金（5）滴加新配的银染液（6）封片，镜检
三、临床应用与评价
1. 应用（1）细胞的膜表面抗原（2）细胞胞/组织内抗原（3）组织中或亚薄切片中抗原 (4) 病毒检测或病毒分型
2.评价
（1）优点：标本用量少,敏感性高，特异性好, 标本用量少,可进行双标或多标检测。
原理：
免疫反应
胶体金颗粒(CG)沉积在Ag位置
CG 催化，对苯二酚还原剂
银离子(Ag+) 还原成银原子(Ag)
银原子围绕金颗粒形成一个“银壳”
子
“银壳”催化，还原更多银离
“银壳”越长越大,抗原位置得到清楚放大
（二）操作技术要点
1.试剂：免疫金、配制新鲜配制银染液。 2.检测：多用于抗原检测。
目前得以广泛应用。
第一节胶体金与免疫金的制备
1. 胶体金的制备 2. 免疫金的制备 3. 免疫金的保存
1.1胶体金的结构
胶体金是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。
胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成(内层AuCl2－，外层H+）。
金颗粒间静电相互排斥而悬浮形成一种稳定的胶体状态。
DIGFA
穿流（flow through）
DICA
横流（lateral flow）
(二) 方法类型
1.双抗体夹心法 2.竞争法/抑制法 3.间接法
1.双抗体夹心法
？
免疫层析试验双抗体夹心法测
双抗体夹心法
标本
Gold
test
control
结果观察
Gold
阳性
test control

临床免疫学：胶体金免疫分析

反应线质控线
阳性
阴性 23
操作技术要点
A
B
DIGFA——双抗体夹心法测抗原 24
DIGFA——结果判断
InstantChek HIV 1+2的结果判断 (图像)
阳性
阴性
测定无效
25
胶体金免疫层析试验
（ dot immunogold chromatographic assay, DICA)
G
T
C
26
夹心法双抗原夹心法
双抗体夹心法
抑制法(竞争法）间接法
27
胶（体
金免疫层析试验
dot immunogold chromatographic
assay,DICA )
双抗体夹心法
阳性结果
标本
G区：金标特异性抗体(兔型)
T区：特异性抗体
吸水纸
C区：羊
抗兔Ig
28
29
ICA 结果观察阳性阴性无效
体
-
+
金
-
+
白质
-
+
15
免疫金的制备
制备要点 ➢ PH值的调整：原则上可选择待标记蛋白质等
电点，也可略为偏碱 ➢ 蛋白质最适标记量的确定 ➢ 标记过程 ➢ 离心纯化：超速离心法 ➢ 免疫金最终用稀释液配成工作浓度保存：稳
定剂-PEG，BSA
16
对
蛋白量逐渐减低
照
管
待标记蛋白作系列稀释+定量胶体金+Nacl 最适标记量：能保持红色不变而蛋白含量最
标本 Ab
Ab*
Ag
标记物放射性核素
荧光素酶

胶体金免疫层析竞争法

胶体金免疫层析竞争法1. 背景介绍胶体金免疫层析竞争法（Colloidal Gold Immunochromatographic Assay）是一种常见的免疫层析快速检测方法。

该方法基于免疫学原理，利用胶体金颗粒与样品中的目标分子相互作用，通过色素沉淀形成可见的测试结果。

这种检测方法具有检测快速、操作简单、结果直观等优点，在临床诊断、食品安全监测、环境污染监测等领域得到广泛应用。

2. 原理介绍2.1 免疫学原理免疫学原理是胶体金免疫层析竞争法的基础。

免疫层析法是一种通过抗原-抗体反应实现分离和检测的技术。

在该方法中，通过将抗原（目标分子）与抗体（特异性与抗原结合的蛋白质）结合，形成免疫复合物，从而实现目标分子的检测。

2.2 胶体金颗粒胶体金颗粒是胶体金免疫层析法的关键试剂。

胶体金颗粒具有良好的生物相容性、稳定性和可见性，广泛应用于免疫学和生物医学领域。

胶体金颗粒的颜色通常为红色或紫色，直径一般在10-100纳米之间。

在光学显微镜下观察，胶体金颗粒呈现明显的表面等离子共振吸收峰，即表现为红色。

2.3 竞争反应胶体金免疫层析竞争法通过竞争反应实现目标分子的检测。

竞争反应分为两个步骤：竞争体系构建和检测结果显示。

2.3.1 竞争体系构建竞争体系构建是胶体金免疫层析竞争法的关键步骤。

在这一步骤中，将胶体金颗粒与目标分子结合。

首先，将目标分子与胶体金颗粒中的抗体结合，形成免疫复合物。

然后，将样品中的目标分子与胶体金颗粒中的抗体竞争结合。

当样品中的目标分子存在时，会与胶体金颗粒中的抗体竞争结合，导致免疫复合物的形成减少。

而当样品中的目标分子不存在时，胶体金颗粒中的抗体能与胶体金颗粒自身上的抗原结合，免疫复合物形成量较多。

2.3.2 检测结果显示检测结果显示是胶体金免疫层析竞争法的关键步骤。

在这一步骤中，利用胶体金颗粒的可见性进行结果显示。

当竞争体系构建完成后，将样品滴在测试纸上，胶体金颗粒会经由纸质的吸收作用，沿纸张上升。

[基础科学]斑点免疫层析试验

实验二十三斑点免疫层析试验(Dot immunogold chromatographic assay)斑点金免疫层析试验是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。

本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。

本实验以双抗体夹心法测定HBsAg为例。

【实验原理】金标抗HBsAg抗体(兔型)干片粘贴在近下端，抗HBsAg单克隆抗体(鼠型)羊抗兔IgG抗体分别包被在NC膜的测试区和质控区。

测试时，试纸条下端浸入血清样品中或滴加血清样品，通过层析作用，上端移动，流经干片时将金标抗HBsAg抗体复溶，若待检血清中含HBsAg，即形成金标抗HBsAg-HBsAg复合物，移至测试区时，形成金标抗HBsAg-HBsAg-抗HBsAg复合物，金标抗HBsAg 被固定下来显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标抗HBsAg抗体移至质控区被羊抗兔免疫球蛋白抗体捕获，呈现红色质控线条。

【主要试剂与器材】1.胶体金层析条所用试剂全部为干试剂被组合在该层析条上，有商品供应。

2.样品待检血清和HBsAg阳性质控血清【操作方法】1.将试剂条标记线一端浸入待检样品中2～5秒或在样品加样处加一定量待检样品，平放于水平桌面上。

2.室温下5～15min，目测观察结果。

【结果判断】结果判断见图23-1。

HBsAg阳性(+)：两条紫红色条带出现，样品中含有乙肝表面抗原。

HBsAg阴性(-)：仅质控区(C)出现一条紫红色条带，样品中检测不出乙肝表面抗原。

试剂条无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质失效。

图23-1 斑点免疫层析试验结果判断示意图【注意事项】1.打开试剂条包装后应在1h内应使用。

2.将试剂条插入血清/血浆样品中，血清/血浆样品液面不能超过试剂条的标记线。

3.若发现试剂条无效，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。

如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品。

免疫标记技术

• 100 ul of fresh substance (DAB) are added into each well.
Incubated at 37℃ for 20min. • 50 ul (one drop) of the stop solution are added into each well. • Read OD of each well at 490nm with a ELISA reader.
• 以胶体金为标记物的抗原抗体反应。 • 分类：定性：免疫电镜技术和免疫组织化学技术
半定量：常与膜载体技术结合，包括斑点金免疫渗滤
试验和斑点金免疫层析试验等。
• 胶体金是由金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液，呈红色，并能与蛋白质等大分子物质结合。
斑点金免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)
• 三种试剂： ① 固相抗原或抗体即把抗原或抗体用合适的方法连接到固相载体表面，同时保留它们的免疫活性；
② 酶标抗原或抗体，即把某些酶用合适的方法连接到抗原或抗体表面，同时保留它们的免疫活性以及酶的催化活性。常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)； ③ 酶作用的底物：一般是能发生颜色改变的化合物，也可以是发光类化学物质。
Immunogold labeling technique
the "rapid tests" that you might use to detect pregnancy, or diagnose an infection quickly in a doctor's office
胶体金免疫技术
Method
• Rabbit anti-human antibody are attached to the surface of microplate. (have been done)

免疫层析法

免疫层析法免疫层析法（immuno－affinitychromatography），是一种利用特殊的抗体-抗原结合的生物物理方法，它可被用来分离和纯化多种有机结构上相似的复杂混合物。

这种方法源于实验室分子反应中使用抗体来选择性捕获具有特定抗原性质的分子，经过几十年的发展，在今天已被广泛应用于生物分离、纯化以及生物工程领域等。

免疫层析法通常由抗原与抗体结合反应、抗原-抗体复合物吸附到层析塔上以及抗原-抗体复合物从层析塔上分离等几个步骤组成。

首先，抗原与抗体进行反应，抗原分子与抗体结合催化生成抗原-抗体复合物，然后将结合后的复合物吸附在层析塔上，该复合物可因为其标志性抗原而与其他物质形成分离层，最后采用不同的溶剂从层析塔中收集抗原-抗体复合物，从而达到分离和纯化的目的。

免疫层析法的特殊优势在于其可以分离分子结构相似、非特异性蛋白或相似的复杂混合物，这一特点使得它可以用于采集和深入研究特定蛋白的生物功能、生物学功能及健康关系，并且在众多研究领域都得到了广泛的应用，如分离具有特异性的表达蛋白、抗原结构研究、蛋白质、小分子抑制剂研究等。

另外，免疫层析法不但适用于高效提取和纯化特定蛋白质，而且可以利用于治疗某些疾病的治疗方法。

例如，对于乙型肝炎的潜伏期患者，可以使用免疫层析法快速和高效地纯化抗乙型肝炎精子，从而为乙型肝炎潜伏期患者提供治疗。

带有抗原-抗体复合物的免疫层析法可以成功地实现抗原分离，并具有选择性、特异性以及高效率等优点，因此，它在分子生物学、生物技术、分离纯化以及生物制品研究领域都被广泛应用。

然而，由于免疫层析法需要事先获得合适的抗原-抗体复合物，因此，在实际分离研究过程中，可能需要花费大量的时间和金钱来生产和维护抗体，以确保分离效率的高度可控性。

总的来说，免疫层析法具有众多优点，它可以成功地实现抗原分离和纯化，在众多研究领域都得到了广泛的应用，但是也存在一些限制和问题，一定程度上影响了其在实际应用中的灵活性和适用性。

固相膜免疫分析技术技术

临床免疫学检验
固相膜免疫分析技术
北京大学第一医院检验科刘平
固相膜免疫分析技术
掌握胶体金免疫技术原理、技术要点掌握不同膜载体免疫技术的原理熟悉金免疫检测的临床应用了解胶体金和免疫金的制备了解固相膜及其技术要求
概述：
随着免疫学技术和相关生物化学技术的发展，检测方法上派生出了多种类型的固相膜免疫快速检测试验。该类试验的最大特点是不需要大型设备，对检测人员稍加培训即能掌握操作要求和判定标准。
其中以胶体金和荧光素最为常用
胶体金免疫技术（免疫金标记技术或金免疫技术）
胶体金免疫技术（colloidal gold immunoassay ）是以胶体金作为标记物（示踪剂或显色剂），应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。
1971年由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。
固相膜免疫分析技术：
是以微孔膜作为固相载体，利用液体可以流过微孔膜也可通过毛细管作用在膜上向前移行的特性，以酶标记或者各种有色颗粒（如彩色胶乳、胶体金、或胶体硒等）标记抗原或抗体作为标记物，通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法。
常用的固相膜
玻璃纤维素(fiberglass)膜尼龙(nylon)膜聚偏氟乙稀( polyvinylidene fluoride ， PVDF)膜硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜
➢ 斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)
➢ 斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay,DICA）
➢ 斑点ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)

免疫层析法和胶体金

免疫层析法和胶体金
免疫层析法（Immunoassay）和胶体金（Colloidal Gold）是生物医学领域中常用的两种技术，它们常常结合使用。

以下是对这两个概念的简要解释：
1.免疫层析法：
定义：免疫层析法是一种生物化学分析技术，用于检测和定量测量样品中的生物分子，例如蛋白质、抗体、抗原等。

原理：这种方法基于抗体和抗原之间的特异性结合。

样品通过一张包含抗体或抗原的固定相，通过毛细作用或其他物理过程，目标生物分子与标记的生物分子结合，形成一个复合物。

这个复合物在固定相上移动，然后通过检测设备进行分析。

应用：免疫层析法在医学、生命科学研究和临床诊断中被广泛应用，例如用于妊娠检测、感染疾病的检测、药物检测等。

2.胶体金：
定义：胶体金是金纳米颗粒的悬浮液，通常具有球形形状。

这些颗粒的直径在1到100纳米之间，呈现出特殊的光学性质，如表面等离子共振。

原理：胶体金的颜色可以调节，当颗粒聚集时，溶液呈现不同的颜色。

这一特性可用于指示生物分子的存在或浓度变化。

胶体金也可以作为标记物，通过将其与特定抗体或抗原结合，用于标记并检测免疫层析法中的生物分子。

应用：胶体金在生物医学领域中有广泛的应用，特别是在免疫层析法中作为标记物。

由于其独特的光学性质，胶体金标记通常能够提供灵敏度高、可视化检测的优势。

在免疫层析法中，胶体金通常被用作标记物，以帮助检测目标生物分子。

这样的组合可以提供简便、快速、敏感的检测方法，因此在临床诊断和实验室研究中得到了广泛应用。

胶体金免疫层析试验须注意的几个问题

胶体金免疫层析试验须注意的几个问题1971年，Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。

1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。

此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快[1]。

目前在医学检验中的应用主要是胶体金免疫层析法（gold immunochromatography assay GICA）和胶体金免疫渗滤法（gold immunofiltration assay GIFA）。

1990年Beggs[2]和Osikowicz[3]等相继建立了免疫层析试验。

胶体金免疫层析试验是将各种反应试剂分点固定在同一试纸条上，待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上移行并与膜上另一种试剂接触，标本中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。

层析过程中免疫复合物被聚集或截留在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。

而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。

其特点是单份测定、简单、快速，除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果。

目前已在临床检测中获得广泛应用，极大地简化了检验步骤，同时，也给试纸条制备者带来了一定的难度。

胶体金免疫层析试纸条有十几种原材料及辅助材料组成，要想达到临床要求需作大量的试验，根据我们多年的工作经验，现就胶体金免疫层析试验过程中必须注意的几个关键问题作以介绍。

1 胶体金颗粒大小的选择胶体金颗粒的大小与产品的灵敏度及特异性有关。

我们制备了如下胶体金液体各100ml，0.01％氯金酸水溶液中加入1％柠檬酸三钠的量分别为：①1.0ml；②1.5ml；③2.0ml；④2.5ml。

各取其50ml，调PH值为6.9进行抗HBsAg抗体标记,分别做灵敏度及特异性实验,结果见表1。

由表1可看出：胶体金颗粒越大，灵敏度越高，但特异性越差。

胶体金

(二) 方法类型 • 1．双抗体夹心法用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，若标本中待测抗原则与膜上抗体结合，然后滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。 • 2．间接法用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后, 滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰, 易导致假阳性结果,临床上较少用。
(二) 方法类型
• 1.双抗体夹心法若图20-2所示，G处为金标抗体(免疫金)，T处包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。测试时A端滴加待测标本，通过层析作用，待测标本向B端移动，流经G 处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体-抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体-抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。
• 1.胶体金的结构胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
• 3．间接法为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图204)。
•
测试卡分成可左右折叠的两部分，右面中央纵向贴有 NC膜条为膜上包被有抗原线T，E处为含能与蛋白结合的有色染料的标本加样区，F处吸水材料；左面中央开有观察窗口B，C处固定有金标记羊抗人抗体，A、 D处为吸水材料。测定时先将缓冲液加在D处层析至C 处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。该法有效地排除了非特异性抗体对测试的干扰。

胶体金法的定义和分类

胶体金是一‎种常用的标‎记技术，是以胶体金‎作为示踪标‎志物应用于‎抗原抗体的‎一种新型的‎免疫标记技‎术，有其独特的‎优点。

近年已在各‎种生物学研‎究中广泛使‎用。

在临床使用‎的免疫印迹‎技术几乎都‎使用其标记‎。

同时在流式‎、电镜、免疫、分子生物学‎以至生物芯‎片中都可能‎例用到。

1971年‎F aulk‎和Tayt‎o r将胶体‎金引入免疫‎化学，此后免疫胶‎体金技术作‎为一种新的‎免疫学方法‎，在生物医学‎各领域得到‎了日益广泛‎的应用。

目前在医学‎检验中的应‎用主要是免‎疫层析法(immun‎o chro‎m atog‎r a-phy)和快速免疫‎金渗滤法(Dot-immuo‎g old filtr‎a tion‎assay‎DIGFA‎)，用于检测 HBsAg‎、HCG 和抗双链Ｄ‎ＮＡ抗体等‎，具有简单、快速、准确和无污‎染等优点。

免疫胶体金‎技术的基本‎原理：胶体金是由‎氯金酸(HAuCl‎4)在还原剂如‎白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用‎下，可聚合成一‎定大小的金‎颗粒，并由于静电‎作用成为一‎种稳定的胶‎体状态，形成带负电‎的疏水胶溶‎液，由于静电作‎用而成为稳‎定的胶体状‎态，故称胶体金‎。

胶体金在弱‎碱环境下带‎负电荷，可与蛋白质‎分子的正电‎荷基团形成‎牢固的结合‎，由于这种结‎合是静电结‎合，所以不影响‎蛋白质的生‎物特性。

胶体金除了‎与蛋白质结‎合以外，还可以与许‎多其它生物‎大分子结合‎，如SPA、PHA、ConA 等‎。

根据胶体金‎的一些物理‎性状，如高电子密‎度、颗粒大小、形状及颜色‎反应，加上结合物‎的免疫和生‎物学特性，因而使胶体‎金广泛地应‎用于免疫学‎、组织学、病理学和细‎胞生物学等‎领域。

胶体金标记‎，实质上是蛋‎白质等高分‎子被吸附到‎胶体金颗粒‎表面的包被‎过程。

吸附机理可‎能是胶体金‎颗粒表面负‎电荷，与蛋白质的‎正电荷基团‎因静电吸附‎而形成牢固‎结合。

免疫胶体金测试原理

胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。用于胶体金标记的蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如牛
双抗体夹心法（double antibody sandwich format）主要用于检测比较大的生物分子及颗粒性抗原（细菌和、病毒、蛋白质、LPS 等）。大的抗原分子有多个抗原位点，根据不同情况可以采用单抗和多抗配对或单抗和单抗配对检测。单抗配对时应对两株单抗进行位点分析，位点相距越远的单抗，其配对检测效果越好。有人认为在某些情况下，可用同一株单抗制备双抗体夹心试剂，前提是抗原拥有多个相同的位点用于结合抗体。
胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000 等的加入有良好的稳定效果。.
当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液 pH 而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点，如 ConA，过氧化物酶等，当 pH 较低时保持稳定，提高 pH 则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用 0.2～0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在 4～10℃贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。

医学检验部分简答和名词解释

免疫应答主要分为哪几个阶段？1）识别阶段2）活化和增值阶段3）免疫效应中枢免疫器官和外周免疫器官有哪些器官组成？各有什么功能？1）中枢免疫器官：免疫细胞发生、分化、成熟的场所，如骨髓，胸腺2)外周免疫器官：免疫细胞产生应答的场所。

如脾脏，淋巴结，黏膜，扁桃体等。

T细胞、B细胞和NK细胞的主要功能分别是什么？1）T细胞：介导细胞免疫，辅助体液免疫。

2）B细胞：产生体液免疫3）NK细胞：介导天然免疫，发挥细胞毒作用。

根据作用方式及其特点的不同，机体存在两类免疫简述各自的概念和特征？1)先天性免疫或固有性免疫，是个体出生是就具有的天然免疫，可通过遗传获得，是机体在长期进化过程中逐渐建立起来的主要针对入侵病原体的天然防御功能。

其主要特征是反应迅速，针对外来异物的范围较广，不针对某个特定异物抗原，也称非特异性免疫。

2)适应性免疫，是个体出生后，接触到生活环境中的多种异物抗原，并在不断刺激中逐渐建立起来的后天免疫，也称获得性免疫。

其主要特征是针对某个特定的异物抗原而产生免疫应答，开始的应答过程比较缓慢，一旦建立清除该抗原的效率很高，特异性很强，也称特异性免疫。

简述抗原抗体反应的原理。

答：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的，它们之间的结合是抗原表位与抗体超变区沟槽分子表面的结合简述抗原抗体反应的类型。

答：抗原抗体反应分为五种类型：①颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应；②可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应；③抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应；④细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；⑤免疫标记的抗原抗体反应等。

什么是带现象?答：在抗原抗体反应等价带前后，由于抗体或抗原过量(形成前带或后带)，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少，不出现可见反应，这种现象在做血清学试验时称为带现象。

影响抗原抗体反应的环境条件有哪些?在实验中如何控制这些条件因素?答：环境条件包括：电解质，酸碱度和温度。