基因编辑技术PPT课件

GAATTC
AGATCT
CTTAAG
TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT
A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
CELLECTIS S.A. NASDAQ
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
基因组编辑技术简介
Genome Editing
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA
第一节 基 本 概 念
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。
植物遗传转化方法和技术
根癌农杆菌介导的植物转基因
图10-1 农杆菌侵染伤口的模式图
基因枪介导法 电转化法 PEG转化法 花粉管通道法
动物遗传转化方法和技术
原核显微注射法 胚胎干细胞介导法 病毒载体法
SUCCESS
THANK YOU
2019/8/9
基因重组/敲除的概念及简史
1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠 定了基因重组/敲除的技术基础
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体
技 外显子插有新霉素抗
术 性基因 （neor）作为
路
正选择
疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk)基因作为
负选择
线
将重组体导入ES细胞，体外培养
neor 和HSV-tk作双重筛选
存活的ES细胞
显微注射
回交得到X被敲除的动物
表型分析
示图
ZFN 技术原 理 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内
第三节 工具酶
1、 “基因剪刀”－限制性核酸内切酶
Werner Arber 理论预见限制酶
Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶
Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断
1978年Nobel生理或医学奖
1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。
（1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身
连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 ℃加热15 min而 失活，故CIP较为常用。
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。
Ⅰ型酶、Ⅲ型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。Ⅰ型和Ⅲ型酶都没
有多大的实用价值。
Ⅱ型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切
割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
4.识别和切割位点：
识别位点：即为Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列 。
通常是4～8个碱基对、具有回文序列的DNA片段
T C - 3’ A G - 5’
5’ – G A A T 3’ – C T T A
① 5`突出粘性末端 ② 3`突出粘性末端 ③ 平头（钝性末端）
5ˊ突出黏性末端(EcoRⅠ)：
5ˊ-G↓AATTC-3ˊ 3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ
克隆基因的表达
基本步骤
1、 制备目的基因
（1）化学合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序
列推导出相应基因DNA碱基序列。
目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小 分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用 连接酶NA用物理或酶学的方法 切割成预期大小的片断，并将 所有这些片断都与适当的载体 连接，引入相应的宿主细胞中 保存和扩增。
又称为分子克隆技术或基 因工程技术
第二节 重组DNA技术的发展史
基因工程的诞生
1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组 猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA
1980年Nobel化学奖
2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年
同源重组进行的基因敲除是通常意义上 的基因敲除
适用范围：适用的细胞既可以是原核细 胞，也可以是真核细胞;
原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源 载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之 间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶 细胞的特定的基因座上
图1
图同 示源
重 组 原 理
图2
单交换
双交换
同源重组引起的基因敲除—ES细胞
51重组质粒dna转化微生物化学转化法电转化法基因枪转化法52电转化法的特点适用微生物多效率高死亡率高化学转化法的特点适用微生物较少效率较高53基因枪转化法的特点适用微生物较少效率较高54革兰氏阳性菌的转化一般需要制备原生质体55真菌的转化一般需要制备原生质体56植物遗传转化方法和技术57根癌农杆菌介导的植物转基因图101农杆菌侵染伤口的模式图5859基因枪介导法电转化法peg转化法花粉管通道法60动物遗传转化方法和技术61原核显微注射法胚胎干细胞介导法病毒载体法62?1980年代初es细胞分离和体外培养成功奠定了基因重组敲除的技术基础?1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因重组敲除的理论基础?1987年thompssonetal首次建立了完整的es细胞基因敲除的小鼠模型?在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步发展和完善基因重组敲除的概念及简史63基因敲除的原理基因突变rnai同源重组64rnai引起基因敲除的机制65?同源重组进行的基因敲除是通常意义上的基因敲除?适用范围
b.插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使 此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有 这种抗生素的培养基中生长。
(
抗 生插 素入 抗失 性活 筛法 选
)
（2） β-半乳糖苷酶系统筛选
（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法
（1）快速裂解菌落并鉴定分子大小 （2）内切酶酶切图谱鉴定 （3）分子杂交 （4）PCR （5）核酸序列测定
切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识 别3-4个碱基；
清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组， 可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获 得目的基因。
2； 待测DNA序列使用M13噬菌体。
3、目的基因与载体的连 接
⑴粘性末端连接：
修改遗传信息的第二步： 怎样将需要的信息导入到细胞？
重组质粒DNA转化微生物
化学转化法 电转化法 基因枪转化法
化学转化法的特点 适用微生物较少 效率较高
电转化法的特点 适用微生物多 效率高 死亡率高
基因枪转化法的特点 适用微生物较少 效率较高
革兰氏阳性菌的转化 一般需要制备原生质体
真菌的转化 一般需要制备原生质体
5ˊ-G
AATTC-3ˊ
3ˊ-CTTAA +
G-5ˊ
3ˊ突出黏性末端(PstⅠ)：
5ˊ-CTGCA↓G-3ˊ
5ˊ-CTGCA
G-3ˊ
3ˊ-G↑ACGTC-5ˊ
3ˊ-G
+ ACGTC-5ˊ
平端缺口（钝性末端）( SmaⅠ）
5ˊ-CCC↓GGG-3ˊ 3ˊ-GGG↑CCC-5ˊ
5ˊ-CCC 3ˊ-GGG
方法：
（一）根据遗传表型进行筛选的方法 （1）抗生素抗性筛选 （2）β-半乳糖苷酶系统筛选
（二）根据重组子结构特征进行筛选的方法
（一）根据遗传表型进行筛选的方法
（1）抗生素抗性筛选:
大多数载体均带有抗生素抗性基因
a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞 就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞 则不能生长。
由同一种限制酶切 割或不同的限制酶切割 形成互补的黏性末端。 经退火后，由DNA连接 酶连接。
（2）平端连接：
平端 DNA片段可以在T4 DNA连接酶的 作用 下相连接，但连接效率较低。为提高连接 效率, 所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末 端 连接要高些。
（3）定向连接：
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
重组体
（4）同聚物加尾连接：
（5）人工接头连接：
接头是指含有某些 限制性内切酶切点的寡 核苷酸片段。
Eco RⅠ 5´- CCGAATTCG 3´- GGCTTAAGC
4、重组DNA导入受菌体
将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞的常用方法： 转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。 转化（transformation）：是指将重组质粒DNA导入受体细胞。
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外 切酶活性。
可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序 列分析等。
耐热DNA聚合酶 最适反应温度为75～80℃ 具有5ˊ→3ˊ外切酶活性，不具有3ˊ→5ˊ外切酶活性
第四节 重组DNA技术常用载体
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的 一类DNA分子。
分类： 克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外
源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因
表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多
是感染细菌的一 类病毒，寄生于细菌中，并 能溶解细菌细胞，故称噬菌 体。
噬 菌 体 生 活 周 期
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
第五节 重组DNA技术
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
↓
重组体的筛选
↓
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
1985年首次证实了哺乳动物细胞中同源重组 的存在奠定了基因重组/敲除的理论基础
1987年，Thompsson et al首次建立了完整的 ES细胞基因敲除的小鼠模型
在随后的时间里基因敲除技术得到了进一步 发展和完善
基因敲除的原理
③
同源重组
②
基因突变
①
RNAi
RNAi引起基因敲除的机制
同源重组引起的基因敲除
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
3、常用载体
质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并 赋予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单 一的限制酶切点等。
1、质粒（plasm持稳 定遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
小结：
（1）分离：提取和获得目的基因和载体 （2）切割：分别对目的基因和载体DNA
酶切； （3）连接：目的基因与载体连接，形成
新的重组 DNA分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体细
胞； （5）筛选：筛选转化成功的细胞克隆 （6）表达：培养获得外源基因的细胞或
生物体，获得所需的遗传性 状或表达出所需要的产物。
+
GGG-3ˊ CCC-5ˊ
切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。
大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不 但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
ACG-OH TACTTAA-P
pBR322质粒载体 ①相对分子质量小，长度为4.3kb。 ②含有氨苄青霉素和四环素的抗性 基因(Ampr和Tetr)。 ③有24种限制性内切酶位点。 ④有一个复制起始点（ori）及与 DNA复制有关的序列，赋予该质粒 复制子特性。 ⑤为松弛型复制子。
2、噬菌体（bacteriophage,phage)
理论上讲，这些重组载体 上带有了该生物体的全部基 因，称为基因。(3)构建cDNA：
(4)聚合酶链反应（PCR） 已知目的基因的基因序列，用PCR从基因组
DNA中获得目的基因，或用逆转录PCR方法直接 从mRNA获得特定基因的cDNA。
(5)直接用限制性内切酶切取、分离： 对一些物理图谱已经确定，背景资料
转染（transfection）：将重组噬菌体DNA直接引入受体细 胞的过程。 转导（transduction）：重组噬菌体DNA分子，在体外经过包 装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将 重组DNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。
5、重组体的筛选与鉴定
筛选是指通过某些特定方法，从被转 化的细胞群体或基因中，鉴别出真正 的阳性重组子的过程。