Get清风3荧光磷光 仪器分析选修课课件
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➢Sharmistha Sinha, Shruti S. Bandyopadhyay, Debjani Ghosh, Udipta Ranjan Chatterjee and Sudipta Saha, et al.
➢Food Science and Biotechnology, 2021, Volume 20, Number 4, Pages 1005-1011
特点：灵敏度高，检测下限比分光光度法低 2~4个数量级。但应用范围不如分光光度法广 泛。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
3.磷光：由三线态的最低振动能级以光的形式放 出能量返回基态的各振动能级，其发光现象称为 磷光。 4.荧光与磷光的比较： 发光机制不同：单线态至单线态跃迁→荧光
三线态至单线态跃迁→磷光。 激发分子寿命：荧光→ 约10-9~10-6s
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2、分子结构与荧光的关系 〔1〕跃迁类型： π-π、n-π弱； π-π*强光。 〔2〕共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共 轭双键脂肪烃π-π激 〔3〕分子的刚性平面：效应增加，可使荧光 效率增大。 〔4〕取代基效应： ①给电子基：荧光效率提高。 ②吸电子基：荧光减弱熄灭 ③对π电子共轭体系作用小，对F无影响
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2.磷光与荧光比较： 磷光辐射波长比荧光长； 磷光寿命比荧光长； 磷光的寿命和辐射强度受重原子和顺磁性
离子影响较大。
3.低温磷光分析： 为减少无辐射跃迁能量损失， 保持磷光强度， 采用低温磷光分析。但制冷设备 和制冷剂昂贵，操作麻烦，需除氧。目前，仪器 已有很大改进。
(五) 分子荧光及磷光分析法的应用
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
3.胶束增稳定磷光分析(micelle stabilized RTP)：将发光物质 保护或 缔结在外表活性剂的混合胶束中。
4.环糊精诱导室温磷光法(cyclodextrin induce RTP)：在环糊 精溶液中进行磷光测定的方法。发磷光物质进入环糊 精空腔，形成稳定的包合物，使磷光增强。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
(三) 激发光谱与荧光光谱 1.光谱的形成 激发光谱〔excitation spectrum〕 ：固定λem，改 变λex，测定F，作图F-λex ，得该荧光物质的激 发光谱 荧光光谱〔fluorescence spectrum〕 ：定λex，改 变λem，测定F，作图F-λem ，得荧光发射光谱， 简称荧光光谱
四．荧光分析方法 (一) 常规荧光分析法 (二) 同步荧光分析 (三) 胶束增敏荧光分析：由于胶束溶液对荧 光有增溶、 增敏和增稳作用，采用胶束溶液 作为荧光介质可大大提高荧光分析法的灵敏 度和稳定性。 (四) 其它荧光分析法
Spectroscopic Properties and Laser Induced
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
3.应用 a.定性分析：激发和荧光光谱的形状、位置等与标准
物质光谱比较； b.定量分析：激发和荧光光谱中的最大激发波长λex
和最大荧光波长λem，选择最正确光谱条件进 行定
量分析。
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
(四) 荧光强度与溶液浓度关系
〔1〕荧光方向：荧光可在各方向观察到， 因激发光可局部透过溶液，为减小干扰， 在与透射垂直方向观测。 〔2〕选两个不同波长光：λ激、λ荧 〔3〕定量关系： IF=2.3 ФI0abC IF=K’C (abc≤0.05) 定量分析根底
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。 4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。光二极 管阵列检测器。 5、仪器的类型 1〕荧光光度计：滤光片荧光计。溴钨灯，滤光片 ，光电管。 2〕荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，光电倍 增管。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
磷光→10-3~10s
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
(二) 物质结构与荧光的关系 物质结构与荧光的发生关系密切
1.荧光物质的必要条件 ①分子在UV-Vis有较强吸收的特定结构。 ②分子有较高的荧光效率〔 Fluorescence efficiency〕。 ③荧光效率： Ф=IF/Ia
IF发射荧光的量子数; Ia吸收激发光的量子数
2、生物与有机化合物的分析
Study of Scavenging Activity of Sorghum Pigment to Hydroxyl Free Radicals by Fluorimetry， Spect roscopy and Spect ral Analysis， Vol1 27 ,No13 ,pp547-551 March , 2007
磷光分析可得到激发光谱发射光谱磷光效率等不同特征信息谱发射光谱磷光效率等不同特征信息用以鉴定未知样品并根据物质所发射的磷光强度进行含量测定
3荧光磷光 仪器分析选修课课件
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
荧光〔fluorescence〕:物质受紫外光或可见光 照射时，吸光后能发射出不同波长和强度的光。 当停止照射时，发出的光很快消失〔约108s〕。 而能持续一段时间〔约10-3~10s〕的光称为磷 光。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
五．磷光分析法 (一) 概述 磷光〔phosphorescence〕是20世纪40年代发 现，50年代应用于分析化学。磷光分析，可 得到激发光谱、发射光谱、磷光效率等不同 特征信息，用以鉴定未知样品，并根据物质 所发射的磷光强度进行含量测定。
(二) 磷光的产生及低温磷光分析 1.磷光产生：激发态分子由第一电子激发三 重态以无辐射跃迁降至 基态的各振动能级， 就产生磷光。
(四) 磷光强度与溶液浓度的关系 1.磷光强度与浓度的关系：
与荧光相似。当磷光物质浓度很小时，磷光强 度与磷光物质的浓度成正比。 2.磷光定量分析依据： P=K’C P-磷光强度；C-浓度。 3.磷光分析仪器：与荧光分析仪相似，只是附加 一个机械切光器，为磷光镜。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(三) 室温磷光分析 (room temperature phosphorescence, RTP)
1.室温磷光分析优点：不用制冷设备、制样简单、灵敏度高、 选择性好，有利于分析自动化，因此，开展很快。
2.固体基质室温磷光法(solid-surface RTP)：将发光物质固定 在固体基质上。
➢Structural characteristics, fluorescence quenching, and antioxidant activity of the arabinogalactan protein-rich fraction from senna (Cassia angustifolia) leaves
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
二．环境条件对荧光强度的影响 (一)温度： 温度升高，外转换去活的几率增 加。荧光效率和荧光强度 减小，降温测定。 (二)溶剂：同一物质，不同溶剂中光谱位置
和荧光强度有差异。 荧光强度随溶剂粘度减小而减小； 溶剂使物质的电离状态改变，荧光峰波长和
荧光强度都有较大变化； 荧光波长随溶剂极性增大而长移。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(六)荧光熄灭Байду номын сангаас荧光物质分子与溶剂分子的相互 作用引起荧光强 度下降或荧光强度与溶液浓 度不成线性关系的现象。
(七) 激发光源：激发光波长不同，光强度不同， 使摩尔系数不同，导致溶液的荧光强度不同 而影响测定。
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
三．仪器与技术 组成：激发光源、单色器、样品池、检测器等
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳 定的光源。有：溴钨灯 氢灯 高压汞灯 氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器〔激发单色器〕：位于光源 与液槽间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器〔发射单色器〕：位于液槽 与检测器之间，滤去反色光，散色光和 杂质产生的荧光。
Fluorescence Determination of Some
Endocrine Disrupting Compounds
• Journal of Fluorescence, 2021, Volume 21, Number 3, Pages 843-850
• Abstract This work presents spectroscopic properties of some Endocrine Disrupting Compounds (EDCs), frequently found in food and in natural water. Studied molecules belong to the groups of phenolic and phthalate EDCs. In a first part, we have examined their absorption and fluorescence properties. Fluorescence emission wavelengths are about 300 nm for phenolic compounds and 360 nm for phthalate compounds; main excitation wavelengths being comprised between 210 nm and 230 nm. Fluorescence lifetimes measured are short (about 4 ns) and the fluorescence quantum yield has been determined. In a second part, to avoid the time consuming solvent extraction step, an analytical application to evaluate the performance of a direct analysis by laser induced fluorescence spectroscopy of ECDs traces in tap water and in raw water is presented. Good detection limits have been obtained, i.e.: 0.35 µg.L−1 of chlorophenol in tap water, which are always lower than the reported Predictive Non Efficient Concentration (PNEC).
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(三)溶液酸度：pH值对荧光光谱、荧光效率 及荧光强度有较影响，严格控制溶液的 pH值，提高实验结果的灵敏度和准确性。
(四)外表活性剂：在外表活性剂的胶束溶液 中进行测定。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(五)散射光的影响 散射光：因碰撞使运动方向改变而向不同角 度散射的光为。 瑞利散射光〔Rayleigh scattering light 〕： 粒子碰撞时，无能量交换，运动方向发生改 变，波长与激发光相同的散射光。 拉曼散射光〔Raman scattering light〕：光 子和物质分子碰撞时，能量和光子运动方向 都发生改变，波长与激发光不同的散射光。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
2.荧光光谱的特征：〔1〕荧光波长比激发光波长长 〔2〕荧光光谱与激发光谱无关。只有强度改变。因 此荧光光谱只有一个谱带。 〔2〕激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
➢Food Science and Biotechnology, 2021, Volume 20, Number 4, Pages 1005-1011
特点：灵敏度高，检测下限比分光光度法低 2~4个数量级。但应用范围不如分光光度法广 泛。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
3.磷光：由三线态的最低振动能级以光的形式放 出能量返回基态的各振动能级，其发光现象称为 磷光。 4.荧光与磷光的比较： 发光机制不同：单线态至单线态跃迁→荧光
三线态至单线态跃迁→磷光。 激发分子寿命：荧光→ 约10-9~10-6s
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2、分子结构与荧光的关系 〔1〕跃迁类型： π-π、n-π弱； π-π*强光。 〔2〕共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共 轭双键脂肪烃π-π激 〔3〕分子的刚性平面：效应增加，可使荧光 效率增大。 〔4〕取代基效应： ①给电子基：荧光效率提高。 ②吸电子基：荧光减弱熄灭 ③对π电子共轭体系作用小，对F无影响
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
2.磷光与荧光比较： 磷光辐射波长比荧光长； 磷光寿命比荧光长； 磷光的寿命和辐射强度受重原子和顺磁性
离子影响较大。
3.低温磷光分析： 为减少无辐射跃迁能量损失， 保持磷光强度， 采用低温磷光分析。但制冷设备 和制冷剂昂贵，操作麻烦，需除氧。目前，仪器 已有很大改进。
(五) 分子荧光及磷光分析法的应用
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
3.胶束增稳定磷光分析(micelle stabilized RTP)：将发光物质 保护或 缔结在外表活性剂的混合胶束中。
4.环糊精诱导室温磷光法(cyclodextrin induce RTP)：在环糊 精溶液中进行磷光测定的方法。发磷光物质进入环糊 精空腔，形成稳定的包合物，使磷光增强。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
(三) 激发光谱与荧光光谱 1.光谱的形成 激发光谱〔excitation spectrum〕 ：固定λem，改 变λex，测定F，作图F-λex ，得该荧光物质的激 发光谱 荧光光谱〔fluorescence spectrum〕 ：定λex，改 变λem，测定F，作图F-λem ，得荧光发射光谱， 简称荧光光谱
四．荧光分析方法 (一) 常规荧光分析法 (二) 同步荧光分析 (三) 胶束增敏荧光分析：由于胶束溶液对荧 光有增溶、 增敏和增稳作用，采用胶束溶液 作为荧光介质可大大提高荧光分析法的灵敏 度和稳定性。 (四) 其它荧光分析法
Spectroscopic Properties and Laser Induced
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
3.应用 a.定性分析：激发和荧光光谱的形状、位置等与标准
物质光谱比较； b.定量分析：激发和荧光光谱中的最大激发波长λex
和最大荧光波长λem，选择最正确光谱条件进 行定
量分析。
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
(四) 荧光强度与溶液浓度关系
〔1〕荧光方向：荧光可在各方向观察到， 因激发光可局部透过溶液，为减小干扰， 在与透射垂直方向观测。 〔2〕选两个不同波长光：λ激、λ荧 〔3〕定量关系： IF=2.3 ФI0abC IF=K’C (abc≤0.05) 定量分析根底
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
3.样品池：石英材质，四面透光。玻璃吸收323nm 以下紫外光。 4.检测器：荧光弱，检测器灵敏度要高。光二极 管阵列检测器。 5、仪器的类型 1〕荧光光度计：滤光片荧光计。溴钨灯，滤光片 ，光电管。 2〕荧光分光光度计：氙灯，光栅，狭缝，光电倍 增管。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
磷光→10-3~10s
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
(二) 物质结构与荧光的关系 物质结构与荧光的发生关系密切
1.荧光物质的必要条件 ①分子在UV-Vis有较强吸收的特定结构。 ②分子有较高的荧光效率〔 Fluorescence efficiency〕。 ③荧光效率： Ф=IF/Ia
IF发射荧光的量子数; Ia吸收激发光的量子数
2、生物与有机化合物的分析
Study of Scavenging Activity of Sorghum Pigment to Hydroxyl Free Radicals by Fluorimetry， Spect roscopy and Spect ral Analysis， Vol1 27 ,No13 ,pp547-551 March , 2007
磷光分析可得到激发光谱发射光谱磷光效率等不同特征信息谱发射光谱磷光效率等不同特征信息用以鉴定未知样品并根据物质所发射的磷光强度进行含量测定
3荧光磷光 仪器分析选修课课件
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
荧光〔fluorescence〕:物质受紫外光或可见光 照射时，吸光后能发射出不同波长和强度的光。 当停止照射时，发出的光很快消失〔约108s〕。 而能持续一段时间〔约10-3~10s〕的光称为磷 光。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
五．磷光分析法 (一) 概述 磷光〔phosphorescence〕是20世纪40年代发 现，50年代应用于分析化学。磷光分析，可 得到激发光谱、发射光谱、磷光效率等不同 特征信息，用以鉴定未知样品，并根据物质 所发射的磷光强度进行含量测定。
(二) 磷光的产生及低温磷光分析 1.磷光产生：激发态分子由第一电子激发三 重态以无辐射跃迁降至 基态的各振动能级， 就产生磷光。
(四) 磷光强度与溶液浓度的关系 1.磷光强度与浓度的关系：
与荧光相似。当磷光物质浓度很小时，磷光强 度与磷光物质的浓度成正比。 2.磷光定量分析依据： P=K’C P-磷光强度；C-浓度。 3.磷光分析仪器：与荧光分析仪相似，只是附加 一个机械切光器，为磷光镜。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(三) 室温磷光分析 (room temperature phosphorescence, RTP)
1.室温磷光分析优点：不用制冷设备、制样简单、灵敏度高、 选择性好，有利于分析自动化，因此，开展很快。
2.固体基质室温磷光法(solid-surface RTP)：将发光物质固定 在固体基质上。
➢Structural characteristics, fluorescence quenching, and antioxidant activity of the arabinogalactan protein-rich fraction from senna (Cassia angustifolia) leaves
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
二．环境条件对荧光强度的影响 (一)温度： 温度升高，外转换去活的几率增 加。荧光效率和荧光强度 减小，降温测定。 (二)溶剂：同一物质，不同溶剂中光谱位置
和荧光强度有差异。 荧光强度随溶剂粘度减小而减小； 溶剂使物质的电离状态改变，荧光峰波长和
荧光强度都有较大变化； 荧光波长随溶剂极性增大而长移。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(六)荧光熄灭Байду номын сангаас荧光物质分子与溶剂分子的相互 作用引起荧光强 度下降或荧光强度与溶液浓 度不成线性关系的现象。
(七) 激发光源：激发光波长不同，光强度不同， 使摩尔系数不同，导致溶液的荧光强度不同 而影响测定。
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
三．仪器与技术 组成：激发光源、单色器、样品池、检测器等
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
1.激发光源：能发出强度较大，连续稳 定的光源。有：溴钨灯 氢灯 高压汞灯 氙弧灯 2.分光系统： 第一单色器〔激发单色器〕：位于光源 与液槽间，滤去非选择波长的激发光。 第二单色器〔发射单色器〕：位于液槽 与检测器之间，滤去反色光，散色光和 杂质产生的荧光。
Fluorescence Determination of Some
Endocrine Disrupting Compounds
• Journal of Fluorescence, 2021, Volume 21, Number 3, Pages 843-850
• Abstract This work presents spectroscopic properties of some Endocrine Disrupting Compounds (EDCs), frequently found in food and in natural water. Studied molecules belong to the groups of phenolic and phthalate EDCs. In a first part, we have examined their absorption and fluorescence properties. Fluorescence emission wavelengths are about 300 nm for phenolic compounds and 360 nm for phthalate compounds; main excitation wavelengths being comprised between 210 nm and 230 nm. Fluorescence lifetimes measured are short (about 4 ns) and the fluorescence quantum yield has been determined. In a second part, to avoid the time consuming solvent extraction step, an analytical application to evaluate the performance of a direct analysis by laser induced fluorescence spectroscopy of ECDs traces in tap water and in raw water is presented. Good detection limits have been obtained, i.e.: 0.35 µg.L−1 of chlorophenol in tap water, which are always lower than the reported Predictive Non Efficient Concentration (PNEC).
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(三)溶液酸度：pH值对荧光光谱、荧光效率 及荧光强度有较影响，严格控制溶液的 pH值，提高实验结果的灵敏度和准确性。
(四)外表活性剂：在外表活性剂的胶束溶液 中进行测定。
分子光谱分析法——分子荧光和磷光分析法
(五)散射光的影响 散射光：因碰撞使运动方向改变而向不同角 度散射的光为。 瑞利散射光〔Rayleigh scattering light 〕： 粒子碰撞时，无能量交换，运动方向发生改 变，波长与激发光相同的散射光。 拉曼散射光〔Raman scattering light〕：光 子和物质分子碰撞时，能量和光子运动方向 都发生改变，波长与激发光不同的散射光。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
分子光谱分析法 ——分子荧光和磷光分析法
2.荧光光谱的特征：〔1〕荧光波长比激发光波长长 〔2〕荧光光谱与激发光谱无关。只有强度改变。因 此荧光光谱只有一个谱带。 〔2〕激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。