改：无缝克隆

重组DNA新方法：无缝克隆
1、传统的重组DNA技术
基本过程：
目的DNA克隆、质粒提取→双酶切→电泳分离及凝胶回收酶切片段→连接。

传统的方法弊端
•耗时、费力，操作步骤多，一般3天左右•外源基因插入受酶切位点限制
•效率低
•不能对多个基因片段进行连接
2、无缝克隆（seamless cloning/in fusion cloning)
•PCR引物由载体末端目的基因末
端构成，各15-20bp。

•通过酶去除PCR产物和载体同源片段
的一股链，暴露出相互配对的单链
序列，同源配对形成环状重组体。

反应条件无缝克隆反应体系1、DNA 外切酶
2、高保真DNA 聚合酶
3、耐热的DNA 连接酶
50℃ 保温15min
反应酶系
无缝克隆过程
•T5外切酶消化DNA片段(5’-3’)形成单链突出部分
•退火，可使互补序列配对连接•PCR扩增填补缺口及DNA连接•形成连接的重组DNA
无缝克隆重要环节
载体线性化：2种方式
高保真pfu酶
PCR扩增
酶切
引物设计
•正向引物：
线性载体正向15-25nt序列+基因正向引物（20-25nt)•反向引物：
线性载体反向15-25nt序列+基因反向引物（20-25nt)
引物设计
3、多片段同步克隆
案例
将IL-2分泌信号序列与CD101胞外域序列和鼠IgG3的可结晶片段进行融合，构建无缝融合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc。

3、多片段同步克隆
多片段连接应用实例
•引物设计并扩增IL-2 信号肽，CD101和鼠IgG3
无缝克隆的优点
•简便、快速、高效的克隆技术•不附加任何多余序列
•不受限制性内切酶位点限制
•时间短（仅需15min)
•操作流程更加简便
•可以同时克隆两个或多个DNA片段。