人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测标准操作规程(PCR-反向斑点杂交法)

人乳头瘤病毒（HPV）基因分型检测标准操作规程
1.目的：规范人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围: PCR实验室。

3.职责:
3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献:
4.1《中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒说明书》
4.2 中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增荧光检测系统DA7600型使用说明书
5. 内容：
5.1 检测方法：PCR-反向斑点杂交法。

5.2 实验原理：选取人乳头瘤病毒（HPV）基因组保守序列为扩增靶序列，设计通用引物和特异型别探针（包括16种中高危型和3种低危型HPV）,将RNA逆转录为cDNA后，利用生物素标记的通用引物对cDNA进行PCR 扩增，得到的产物与固定在膜上的特异型别探针按照碱基互补配对的原理杂交。

若PCR产物和探针完全配对，则膜条上相应探针位置捕获到标有生物素的PCR产物，并和亲和素–辣根过氧化物酶偶联，再与四甲基联苯胺（TMB）反应呈现较强的深蓝色，若与探针不完全配对，则经严格杂交和洗涤后膜条上相应探针位置不能捕获到标有生物素的PCR产物，结果无显色反应或显很淡的背景色。

5.3 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.3.1 标本类型：尿道分泌物、宫颈脱落细胞、疣体细胞等。

5.3.2 标本采集：
5.3.2.1 道分泌物：在无菌条件下，用棉拭子伸入尿道内,旋转数周并停留片刻后取出。

5.3.2.2 宫颈脱落细胞:在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm,旋转数周并停留片刻后取出。

5.3.2.3 疣体细胞: 用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮细胞。

5.3.3 标本保存：采集的标本置于盛有1ml生理盐水的小试管中，2～8℃保存。

5.3.4 运送条件：标本长途运送时采用冰壶。

5.3.5 标本拒收标准：污染标本。

5.4 设备和试剂:
5.4.1 设备：DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

5.4.2 试剂：
5.5.2.1 试剂品牌：《中山大学达安基因股份有限公司人乳头瘤病毒（HPV）反向点杂交（RDB）基因分型试剂盒》
5.5.2.2 试剂批准文号：国药准字 3401298。

5.5.2.3 试剂组成： DNA 提取液（500μL/管）1 管；HPV PCR反应管，单管单人份10管，HPV 阳性质控品(HPV16型)（50μL/管）1管，阴性质控品（50μL/管）1管，杂交液Ⅰ浓缩液（50ml/瓶）1瓶，杂交液Ⅱ浓缩液（30ml/瓶）1瓶，溶液Ⅰ（100μL/管）1管，溶液Ⅱ浓缩液（25ml/瓶）1瓶，溶液Ⅲ（1ml/管）2管，溶液Ⅳ（100μL/管）1管，杂交膜条（10人份/袋）1袋。

5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，10人份/盒。

5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。

5.6 质控程序：
5.6.1 质控品：
5.6.1.1 质控品品牌：随试剂盒，由厂家提供。

5.6.1.2 保存条件：置于-20℃冰箱中保存，也可以保存于-70℃，应避免反复冻融。

5.6.1.3 保存期限：保存于-20℃，保存期为1个月；保存于-70℃，保存期为2年。

5.6.2 质控频率：每天一次。

5.6.3 质控操作步骤：与临床标本同步处理。

5.6.4 质控结果分析：
5.6.4.1 显色反应控制点：应显色为边缘清晰的蓝色圆点, 则杂交过程正常。

否则需要重新检查杂交过程。

5.6.4.2 IC位点：应显色为边缘清晰的蓝色圆点, 表示DNA抽提和PCR过程正常。

不显色或显色强度很弱表示DNA抽提或PCR过程不成功，或未采集到宫颈或疣体脱落细胞，该样品应重复实验或重新采样。

5.6.4.3 阳性质控品：杂交膜条上除显色反应控制点和IC位点外, 只有HPV16分型位点显色为边缘清晰的蓝色圆点。

其它位点不显色。

5.6.4.4 阴性质控品：除显色反应控制点和IC位点外，其他位点不显色。

5.6.4.5 以上各项需同时满足，否则全部试验应重新进行。

5.7 操作过程：
5.7.1 标本与质控品的处理：
5.7.1.1 打开或恒温水浴箱或干式恒温器，设定温度100℃。

5.7.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、阴性质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。

5.7.1.3 样本的处理：转动宫颈刷或棉拭子,将宫颈刷或棉拭子上的细胞洗脱于1ml生理盐水中,洗脱液转至1.5ml 离心管中,12,000rpm离心5min。

弃上清,加50μL DNA提取液打匀 (提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。

如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截)。

100℃保温10±1min。

12,000 rpm离心5min,4℃待用。

5.7.1.4 阴、阳性质控品的处理：分别取阳性质控品及阴性质控品各50μL，加等量DNA提取液打匀。

100℃保温10±1min。

5.7.1.5 12,000rpm离心5min,4℃保存备用（如需长期保存请放置-20℃）。

5.7.2 PCR扩增：
5.7.2.1 取PCR反应管若干,分别加入处理好的样品、阴阳性质控品各5μL，2,500rpm瞬时（3s）离心，将各反应管放入PCR仪，所有设置完成后,按“OK”。

5.7.2.2 扩增条件：93℃ 3min预变性，然后按93℃40s → 55℃40s → 72℃40s扩增，共40个循环，最后72℃延伸7min。

5.7.3 杂交操作：
5.7.3.1 杂交前试剂配制
5.7.3.1.1 杂交液Ⅰ：将杂交液Ⅰ浓缩液50℃水浴溶解，充分摇匀后用双蒸水稀释而成（杂交液Ⅰ浓缩液与双蒸水体积比为1:4）。

室温储存，使用前需充分溶解混匀。

5.7.3.1.2 杂交液Ⅱ：将杂交液Ⅱ浓缩液50℃水浴溶解，充分摇匀后用双蒸水稀释而成（杂交液Ⅱ浓缩液与双蒸水体积比为1:4）。

室温储存，使用前需充分溶解混匀。

5.7.3.1.3 溶液Ⅱ：将溶液液Ⅱ浓缩液用双蒸水稀释而成（溶液Ⅱ浓缩液与双蒸水体积比为1:4）。

2-8℃储存，使用前需充分溶解混匀。

5.7.3.1.4 膜条准备：用镊子镊取RDB膜条并编号，对应将膜条放入15ml离心管中，往离心管中加入杂交液Ⅰ，淹过膜条即可，备用。

5.7.3.2 杂交过程
5.7.3.2.1 杂交液Ⅰ与杂交液Ⅱ预热至45℃，备用；打开水浴摇床，待温度稳定至45℃。

5.7.3.2.2 将PCR产物98℃,8分钟变性，立即置于冰水混合物中2分钟以上。

5.7.3.2.3 将PCR产物加入已备好的离心管中（注意编号对应），振荡混匀，然后放入45℃水浴摇床中1.5小时以上。

5.7.3.3 洗膜：
5.7.3.3.1 将膜条从45℃水浴中取出，转入装有30ml杂交液Ⅱ的离心管中，再加入50μL溶液Ⅰ（POD），配制成混合液，45℃水浴水浴振荡10分钟（杂交液Ⅱ45℃预热30分钟以上），最多可同时洗10张膜条。

5.7.3.3.2 弃混合液，加入40ml杂交液Ⅱ，室温振荡10min。

5.7.3.4 显色：
5.7.3.4.1 按下表新鲜配制显色液。

5.7.3.4.2 将膜条从装有杂交液Ⅱ的离心管中取出，放入装有新鲜配制显色液的离心管中，于室温下避光显色3～10min 后取出观察结果，并记录。

5.7.3.5 结果分析：
5.7.3.5.1 RDB 膜条上各型HPV 探针排列如下：
5.7.3.5.2 阳性判定标准：杂交膜上相应位点呈边缘清晰的蓝色圆点。

5.7.3.5.3 阴性判定标准：杂交膜上相应位点无边缘清晰的蓝色圆点。

5.7.3.6 膜条的保存：实验结束后膜条应放在封口袋内封口保存并扫描至电脑存档，以便于以后查询结果。

5.7.3.7 临床意义:用DNA 反向斑点杂交技术，可以快速准确的从临床尖锐湿疣脱落细胞、宫颈脱落细胞和宫颈粘液标本中检测出19种广泛分布的HPV 基因亚型，包括16种中高危型HPV （16,18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，亚型CP8304型）和3种低危型HPV （6,11
，43型），为临床诊断尖锐湿疣和子宫颈癌提供依据。

5.8 安全防护措施：
5.8.1 试剂处理：
5.8.1.1 使用或更换试剂时，务必戴手套；不要用身体直接接触试剂，以免损伤皮肤。

5.8.1.2 如果皮肤接触了试剂，立即用大量清水冲洗并消毒。

5.8.1.3 如果眼睛接触了试剂，立即用喷淋器冲洗，并紧急就医。

5.8.2 仪器使用：
5.8.2.1 仪器运转中不要触摸加样机构、试剂分注机构、搅拌机构、反应容器清洗机构等可动部分。

5.8.2.2 仪器通电时不能打开仪器上面、背面、侧面的盖板，不能触摸光源灯的玻璃面。

5.8.3 生物安全防护：参见《生物安全防护手册》。

5.9 注意事项：
5.9.1 PCR实验室应于杂交室分开：PCR实验室应分别在样本处理区，PCR加样区，扩增区和电泳房分别进行。

各区应相对分隔。

人和实验室用品从样本区到PCR加样区到扩增区到杂交室单向流动，PCR试剂盒不可存放于杂交区。

5.9.2 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。

如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。

5.9.3 PCR反应使用的小塑料管，吸头等应高压灭菌并一次性使用。

5.9.4 标记并核对DNA扩增管与膜条的编号，使之一一对应。

5.9.5 杂交全过程需避免用手接触膜条，应用镊子夹取膜条边角进行操作。

5.9.6 室温低于20摄氏度时，杂交液Ⅰ，Ⅱ中的SDS易结晶析出，使用时需温浴使之溶解。

5.9.7 如果显色反应控制点颜色显得较浅，可以适当延长显色时间。

6.相关记录表格：
6.1 LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR实验室实验、交接班记录表》
6.2 LAB-SOP-PCR-015-T01-001《PCR实验室迟发报告登记表》
6.3 LAB-SOP-PCR-014-T01-001《PCR实验室不合格标本登记表》
6.4 LAB-SOP-PCR-025-T01-001《PCR实验室DA－7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》
本SOP文件颁发部门：质管部
本SOP文件分发部门：PCR实验室
本SOP文件编写人: 编写日期：年月日
本SOP文件审核人：审核日期：年月日
本SOP文件审批人: 执行日期：年月日。