松浦镜鲤口灌甲砜霉素对嗜水气单胞菌的PK_PD模型分析_杨洪波

文章编号：１００５－３８３２（２０１３）０２－００４９－０６Vol.26，No.2Apr.2013第２６卷第２期２０１３年４月水产学杂志CHINESE JOURNAL OF FISHERIES收稿日期：２０１２－１１－０１基金项目：行业专项（２０１２０３０８５）；十二五支撑计划（２０１２ＢＡＤ２５Ｂ０２）．作者简介：杨洪波（１９８７－），女，硕士研究生，研究方向鱼类病害．通信作者：卢彤岩（１９６８），女，研究员，从事鱼类病害研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｔｏｎｇｙａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ随着氯霉素在全世界食用动物中的禁用［１－３］，甲砜霉素（Ｔｈｉａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，简称ＴＡＰ）在兽医领域的应用日趋增多，在畜禽疾病防控中起重要作用。

ＴＡＰ为酰胺醇类抗生素，应用范围和抗菌谱与氯霉素基本相同，具有广谱抗微生物作用［４］，但是毒性有所降低［５］，目前主要用人工方法合成。

ＴＡＰ抗菌穿透力强，吸收快，不易产生耐药性，药物吸收后广泛分布于血液和各组织中［７］，广泛代替被禁用的氯霉素而松浦镜鲤口灌甲砜霉素对嗜水气单胞菌的ＰＫ－ＰＤ模型分析杨洪波１，２，王荻１，卢彤岩１（１．中国水科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨１５００７０；２．上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）摘要：本文采用体内药动学和体外药效学相结合的方法，应用Ｅｘｃｅｌ２００７、药动学３ｐ９７软件和ｋｉｎｅｔｉｃａ４．４软件进行数据处理和分析，研究了鲤鱼血清中甲砜霉素抗嗜水气单胞菌Aeromonas hydropila 的活性，为甲砜霉素在水产动物疾病预防和治疗细菌性败血症提供理论依据。

研究结果表明：给鲤单剂量口灌３０ｍｇ·ｋｇ－１剂量的甲砜霉素后，药物在鲤体内吸收迅速，达峰快，消除缓慢。

１．３６１ｈ血药达峰（Ｔｐｅａｋ），峰浓度（Ｃｍａｘ）为３９．８２５μｇ·ｍＬ－１，吸收速率（Ｋａ）为２．５８ｈ，分布半衰期Ｔ１／２（ｋａ）为７．３１７ｈ，滞后时间（ＴＬ）为０．２３４ｈ，消除半衰期Ｔ１／２（ｋｅ）为７７．２９２ｈ。

在半效应室内，ＥＣ５０为１５．６２ｈ。

ＰＫ－ＰＤ同步模型参数ＡＵＣ／ＭＩＣ血清为３５．３７ｈ，Ｃｍａｘ／ＭＩＣ血清为２４．８９。

通过抑制效应ＳｉｇｍｏｉｄＥｍａｘ模型得到８．５２～４７．９４ｍｇ·ｋｇ－１为临床使用甲砜霉素（ＴＡＰ）防治鲤鱼细菌性败血症的给药剂量。

建议甲砜霉素在预防和治疗细菌性败血症的最佳给药方案为：药饵的治疗剂量为４７．９４ｍｇ·ｋｇ－１，预防剂量为８．５２ｍｇ·ｋｇ－１。

关键词：鲤鱼血清；甲砜霉素；嗜水气单胞菌；体外药效学中图分类号：Ｓ９４８文章标识码：ＡPharmacodynamic Effect of Thiamphenicol in Serum of Songpu Mirror Carp onAeromonas hydropila in vitro Pharmacokinetic ModelＹＡＮＧＨｏｎｇ－ｂｏ１，２，ＷＡＮＧＤｉ１，ＬＵＴｏｎｇ－ｙａｎ１（１．ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＲｉｖｅｒＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５００７０，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｉｓｈｅｒｉｅｓａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１３０６，Ｃｈｉｎａ）Abstract:Ｔｈｅａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉｕｍAeromonas hydropila ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｉａｍｐｈｅｎｉｃｏｌｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｉｎｓｅｒｕｍｏｆｓｏｎｇｐｕｍｉｒｒｏｃａｒｐ（Cyprinus carp Ｌ．）ｆｅｄｔｈｉａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ（ＴＡＰ）ｂｙｏｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｂｙｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｍｏｄｅｌｖｉａＥｘｃｅｌ２００７，３ｐ９７ａｎｄｋｉｎｅｔｉｃａ４．４ｔｏｐｒｏｖｉｄｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＴＡＰｉｎｄｉｓｅａｓｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＴｈｅＴＡＰｗａｓｓｈｏｗｎｔｏｂｅａｂ－ｓｏｒｂｅｄｑｕｉｃｋｌｙ，ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄｓｌｏｗｌｙａｎｄｔｏｈａｖｅａｐｅａｋｒａｐｉｄｌｙｉｎＳｏｎｇｐｕｍｉｒｒｏｒｃａｒｐｓｉｎｇｌｅｏｒａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｔａｄｏｓｅｏｆ３０ｍｇｋｇ－１ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ．Ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅ１．３６１ｈｆｏｒＴｐｅａｋ，３９．８２５μｇ·ｍＬ－１ｆｏｒＣｍａｘ，２．５８ｈｆｏｒＫａ，７．３１７ｈｆｏｒＴ１／２（ｋａ），０．２３４ｈｆｏｒＴＬａｎｄ７７．２９２ｈｆｏｒＴ１／２（ｋｅ），ａｎｄ．１５．６２ｈｆｏｒＥＣ５０ｗａｓ．ＰＫ－ＰＤｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｅｒｅ３５．３７ｉｎＡＵＣ／ＭＩＣａｎｄ２４．８９ｉｎＣｍａｘ／ＭＩＣ．ＳｉｇｍｏｉｄＥｍａｘｍｏｄｅｌｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＴＡＰｄｒｕｇｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄａｔａｄｏｓｅｏｆ８．５２￣４７．９４ｍｇ·ｋｇ－１．Ｉｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｄｏｓｅｂｅ４７．９４ｍｇ·ｋｇ－１ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｆｏｒｔｈｅｒａｐｙａｎｄ８．５２ｍｇ·ｋｇ－１ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｆｏｒｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｓｅｐｓｉｓｗｈｅｎｔｈｅＴＡＰｉｓａｄｄｅｄｉｎｔｏｄｉｅｔ．Key words:ｔｈｉａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ；ｓｏｎｇｐｕｍｉｒｒｏｒｃａｒｐ；Aeromonas hydropila ；ｉｎｖｉｔｒｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｍｏｄｅｌ用于水产动物疾病防控［６］。

在临床预防和治疗疾病过程中，抗菌药物会出现耐药性，影响多种疾病的治疗效果。

因此，在临床上应用时，应确定合理的抗菌药物给药方案，这不仅治疗效果良好，还可避免细菌暴露在亚致死浓度水平，减少了耐药性的产生，更好地延长现有抗菌药物的使用寿命［８］。

传统给药方案一般是根据抗菌药物体内药物代谢动力学特征和体外最小抑菌浓度（ＭＩＣ）综合考虑来确定，通过体内药物浓度超过ＭＩＣ的时间来确定给药间隔，这种方法在大多数情况下有效，但由于未将血清、机体免疫和药物在机体内浓度的动态过程等因素考虑在内，结果往往与药物在机体内的实际抗菌效果存在差异［９］。

松浦镜鲤（Cyprinus carpio）是中国水科院黑龙江水产研究所在德国镜鲤选育系Ｆ４代基础上培育的新品种，具有繁殖力高、抗寒力强、背部较高而厚、体表基本无鳞、体型好，及生长快等特点［１０］，在我国北方广泛养殖。

本实验采用体内药动学和体外药效学相结合的方法，研究鲤血清中甲砜霉素抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydropila）的活性，为甲砜霉素在水产动物疾病预防和治疗细菌性败血症提供理论依据。

１材料与方法1.1药品及培养基ＴＡＰ标准品：含量９８．９％ＴＡＰ原粉，购自浙江海翔药业股份有限公司（批号Ｐ－０４７－ＷＳ１１０６２１０１）。

乙酸乙酯、正己烷和甲醇为色谱纯试剂，由ＭｅｒｃｋＫＧａＡ公司生产，其他试剂盒药品均为分析纯。

液体培养基为胰蛋白胨大豆肉汤培养基（ＴＳＢ），产品编号为ＨＢ０１７７；固体培养基为胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ＴＳＡ），产品编号为ＨＢ４１１４，均由青岛高科园海博生物技术有限公司生产。

1.2实验动物及菌株实验用松浦镜鲤平均体重为８４．８４±１７．４５ｇ，由黑龙江省呼兰冷水性鱼类试验站提供，在鱼缸中暂养７ｄ后，选择规格相近、体质健康的鱼体进行试验。

给药前鲤停饲２４ｈ，以便给药，实验期间不投喂，实验期间不投喂饵料，水温控制在２０±０．２℃。

实验在方形自动循环水鱼缸中进行，鱼缸规格为长１１０ｃｍ，宽和高均为５５ｃｍ，实验期间持续给氧，保持溶氧浓度大于６．００ｍｇ·Ｌ－１。

实验用嗜水气单胞菌分离自黑龙江某淡水养殖场患病鲤的肝脏组织。

该菌株为本实验室分离鉴定后保存的菌株，编号Ｈ２。

1.3仪器液相色谱－质谱联用仪为（Ｗａｔｅｒｓ生产），ＳＩＧ－ＭＡ３Ｋ１５离心机，Ｔ－２１４电子天平（购自北京赛多利斯仪器系统有限公司），ＦＪ２００－Ｓ调速混匀器（上海标准模型厂制造），ＬＭＱ．Ｃ－３２６０全自动立式灭菌器，全自动新型生化培养箱、恒温培养振荡器。

1.4给药方案及试样采集实验用鲤１４０尾，随机分成１４组，每组１０尾。

以３０ｍｇ·ｋｇ－１的剂量单剂量口灌ＴＡＰ，在给药前采取空白的血样，给药后分别于０．２５、０．５、０．７５、１、２、４、６、８、１２、２４、３６、４８，及７２ｈ采集鲤的血样。

每个时间点分别取５尾实验鱼的血样，注射器用３‰肝素钠润洗后，从鱼尾静（动）脉进行采血。

采集的血液于４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，分离血浆，采集样品全部放入－８０℃超低温冰箱冷冻保存，待测定血药浓度；另取鱼５尾，用未经润洗的注射器从尾静（动）脉采血。

将采集的血液放入灭过菌的５ｍＬ聚丙烯离心管中，在４℃冰箱中，静置，待血清析出后，以４０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ。

另取一只无菌的５ｍＬ聚丙烯离心管，将血清移入其中，全部血清样品放入－２０℃冰箱冻存，备用。

1.5TSB培养基和TAP对嗜水气单胞菌的MIC 测定采用改进的试管二倍稀释法测定ＴＡＰ在ＴＳＢ培养基中对嗜水气单胞菌Ｈ２的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）［１１］。

先将药物浓度配制成１２８μｇ·ｍＬ－１，使用时先稀释１０倍，再加入第一管，其他操作程序不变。

本实验中使用的菌液浓度为１×１０７ＣＦＵ·ｍＬ－１。

培养２４ｈ后，以能抑制细菌生长的最小药物浓度为ＭＩＣ。

相同过程重复操作３次。

1.6血清中TAP对嗜水气单胞菌H2抗菌活性的测定实验在无菌条件下进行。

首先将空白血清样本和给药后采集的全部血清样本从－２０℃冰箱中取出，在４℃冰箱中解冻，解冻后用针孔过滤器过滤血清样品除菌，过滤器孔径为０．２２μｍ，取１ｍＬ除菌血清加入１０μＬ对数期的嗜水气单胞菌培养物，使嗜水气单胞菌在血清中的数量大约为６×１０７ＣＦＵ·ｍＬ－１，将加入嗜水气单胞菌的血清放入２８℃的恒温培养振荡器中，并与培养后０、３、６、９、１２，及２４ｈ取稀释后样品３０μＬ进行涂板，将培养皿放入恒温培水产学杂志第２６卷·５０·养箱中２８℃培养，培养２４ｈ后进行菌落计数，确定血清中活菌数的变化［１２］。

1.7测定血浆中TAP的含量采用液相色谱－串联质谱（ＬＣ－ＭＳ）法进行测定，使用Ｅｘｃｅｌ２００７和药动学３ｐ９７软件处理和分析鲤血浆药动数据。