酶底物法与多管发酵法测定水中粪大肠菌群的对比分析

地震等自然灾害过后水体会被大量微生物所污染,特别是被粪便污染。

如水体中含有肠道病原菌株,人饮用后会暴发严重疾病。

粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,是水体受人畜粪便污染的最直接指标。

对于粪大肠菌群检测的方法主要为滤膜法和多管发酵法,但试验过程较为繁琐,因此亟需
一种快速简便的检测方法。

酶底物法也可用来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌,操作方便,检测时间
短,无需确认试验。

但该方法尚未正式列入国家标准,因此,该文通过与多管发酵法相比较,对酶底物法进行验证分析。

1材料与方法1.1试验材料
仪器及试剂:乳糖蛋白胨;EC 肉汤;灭菌锅;科立得TM (Colilert R )试剂(美国爱德士生物科技股份有限公司);酒精灯;100mL 无菌取样瓶(里面装有1.5%硫代硫酸钠去除水样中的余氯);3mm 接种环;无菌培养定量盘(97孔);封口机(带97孔定量盘橡胶托垫);97孔阳性标准比色盘;培养箱。

1.2试验方法1.2.1
多管发酵法。

参考《生活饮用水标准检验方法(GB/
T5750.12-2006)》和《水和废水监测分析方法(第四版)》,将水样分别接种到发酵管中,发酵管中盛有乳糖蛋白胨,在(37±0.5)℃条件下培养(24±2)h ,如果试管产酸或产气,说明试验呈阳性(初发酵试验),将呈阳性结果的发酵管轻微振荡,用灭菌棒或3mm 接种环将培养物转接至EC 培养液中,在(44.5±0.5)℃水浴下培养(24±2)h ,如果发酵管产气即可确认呈阳性(复发酵试验)。

1.2.2酶底物法。

将科立得TM (Colilert R )试剂加入100mL 装有水样的取样瓶中,待试剂完全溶解后,倒入无菌培养定量盘(97孔)中,对其进行封装,然后置于(44.5±1)℃恒温培
养箱中培养24h 。

取出后与97孔阳性标准比色盘进行比较,如果为阳性反应,则黄色孔颜色较标准比色盘深,如果有疑虑,可将可疑阳性的试管继续培养4h ,然后观察,之后出现的颜色反应无效。

2结果与分析
用单因素方差分析和卡方检验进行统计[1],比较检出率、阳性率等。

用t-检验、泊松(Pearson )相关系数衡量其相关性。

2.1试验数据的可信度检验
用标准菌株IDEXX-QC (大肠埃希氏菌,MPN 值/100mL 在113~1210之间)的纯培养稀释液,分别用酶底物法和多管发酵法进行培养,经显微镜初略记数表明,多管发酵法和酶底物法定性准确,标准菌株检验未出现假阴性或假阳性。

查MPN 表得知,2种方法的测定结果均在质控范围内,测定结果准确可靠,见表1。

对2组数据进行配对t 检验,t 0.05(n-1)=2.571>1.514-1,表示酶底物法和多管发酵法在测定标准菌株上无统计学意义上的差异。

2.2水样监测结果比较
2.2.1地表水测定结果比较。

为保证试验结果的方便统计和精确,采取地表水、水源水水样进行检测,要求水样有一定的阳性检出率,同时水样的MPN 值应尽量控制在100MPN/100mL 以下,原因是MPN 值本身为统计得出,结果越大差异性就越大。

如样品中菌数大于2400,由于样品稀释造成的分配不均导致的差异会比不稀释的样品大很多[2]。

(下转第176页)
摘要通过测定各类水质,对酶底物法与多管发酵法用于水中粪大肠菌群检测进行了方法验证与分析,结果表明:两者在结果一致性方面无统计学意义上的显著性差异。

在置信度95%的情况下差异可以被接受,且满足环境监测要求。

酶底物法可以作为评价水质微生物污染的标准方法。

关键词粪大肠菌群;酶底物法;多管发酵法中图分类号X832.2文献标识码A 文章编号1007-5739(2015)20-0162-01
Comparison of Detection of Coliform Group in Water by Enzyme Substrate Technique and Multipletube Fermentation
Technique
YANG Hong LIU Jin-guan GUO Yu-min
(Tianjin Environment Monitoring Center ,Tianjin 300191)
Abstract Through the detection of coliform group for various types of water by enzyme substrate technique and multipletube fermentation technique ,there were no significant differences between the two methods.95%confidence interval of the difference could be accepted and met the requirements of environmental monitoring.Enzyme substrate technique could be used as a standard method of water quality assessment of microbial contamination.
Key words coliform group ;enzyme substrate technique ;multipletube fermentation technique
酶底物法与多管发酵法测定水中粪大肠菌群的对比分析
杨虹
刘金冠郭玉敏
(天津市环境监测中心,天津300191)
作者简介杨虹(1966-),女,天津人,工程师,从事环境监测与分析工
作。

收稿日期2015-09-06
方法
测定值(MPN 值/100mL )123456多管发酵法630700630940630700酶底物法435665691829594689d i 195
35-6111136
11
d S d
t =d ⎺S d /n
√=1.514t 0.05(6-1)=2.571>t
54.588.2
表1质控样品测定结果比较
162
. All Rights Reserved.
(上接第162页)
取40份地表水样品进行试验,分别用酶底物法和多管
发酵法进行检测。

地表水、水源水检测结果(MPN值/100mL)
40组数据(多管发酵法,酶底物法)分别为(12,14)(8,12)
(34,58)(26,42)(94,78)(8,14)(11,20)(26,20)(33,31)
(49,26)(49,36)(79,108)(20,23)(34,49)(22,30)(43,38)
(12,19)(63,17)(17,26)(13,34)(21,41)(26,10)(33,44)
(34,51)(23,10)(49,59)(26,26)(79,34)(11,36)(26,77)
(110,84)(34,54)(26,34)(34,20)(11,24)(23,60)(14,24)
(21,27)(49,44)(43,27),见图1。

据计算,2种方法泊松相关系数为0.62,表示中等程度
相关。

对2组数据进行配对t检验,d为3.30;S d为20.0;
t=d⎺
S d/n√为1.044,t0.05(n-1)=2.021>1.044,表示酶底物法和
多管发酵法在测定地表水粪大肠菌群上无统计学差异。

部分研究认为,这种差异是否显著取决于该菌群的组成[3],粪
大肠菌群主要组成为埃希氏菌属,大肠埃希氏菌与人类密切
相关。

2种检测方法对埃希氏菌属的检出灵敏度基本一致,
而对肠杆菌属的检出灵敏度,酶底物法高于多管发酵法。

2.2.2污水测定结果比较。

取40份污水样品(包括生活污
水、工业废水、医院废水等),分别用酶底物法和多管发酵法
检测。

污水检测结果(MPN值/100mL)40组数据(多管发酵法,
酶底物法)为:(220,24)(130,10)(1700,483)(490,95)(230,573)
(8,52)(130,436)(330,383)(230,30)(2,1)(790,411)(49,364)
(80,20)(20,20)(350,865)(490,860)(170,31)(130,30)
(3500,482)(35,66)(230,148)(50,41)(20,10)(50,226)
(20,10)(160,450)(20,26)(49,38)(11,100)(26,77)
(1100,2420)(220,121)(9200,6294)(34,90)(1400,1986)
(170,326)(14,24)(350,205)(1600,1300)(43,110),见图2。

根据计算,2种方法的泊松相关系数为0.90,表示中等
程度相关。

对2组数据进行配对t检验,d为115;S d为751;
d⎺
S d/n√为0.968,t0.05(n-1)=2.021>0.968,表示酶底物法和多
管发酵法在测定污水粪大肠菌群上无统计学意义上的差
异。

大量试验也表明,多管发酵法与固定底物酶底物法检测
结果虽然有一定差异,但偏差极小,几乎可以等效。

2.3检出限比较
多管发酵法的最低检出限为每100mL水样可检测出2
cfu的总大肠菌群。

而酶底物法可以在24h同时检测出总大
肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群(粪大肠菌群),它
可以在100mL水样中抑制2百万个杂菌干扰,最低检出限
为每100mL水样可检测出1cfu的总大肠菌群、大肠埃希
氏菌、耐热大肠菌群(粪大肠菌群)[4-5]。

3结论与讨论
综上所述,多管发酵法与酶底物法在结果一致性方面无
统计学意义上的显著性差异。

在置信度95%的情况下差异可
被接受,且满足环境监测要求。

酶底物法可作为评价水质微
生物污染的标准方法。

酶底物法大大减少了工作量,与多管
发酵法比较,操作误差较小,可准确判断水样中的微生物污
染状况。

该方法检测技术更快速、简便、特异、灵敏,不仅适
合实验室使用,更适合应急突发事件中的现场及大批量水
样品中微生物检测,且酶底物法用密封培养技术,在检测医
院污水时可减少人员接触而降低检测人员的致病风险[6-7]。

4参考文献
[1]SCHETS FM,NOBEL PJH,STRATING S,et al.EU drinking water directive
reference methods for enumeration of total coliforms and Escherichia coli
compared with alternative methods[J].Letters in Applied Microbiology,
2002,34:227-231.
[2]ISO17994:Water quality-Criteria for establishing equivalence between
microbiological methods[M].First edition,2004.
[3]王晋宇,赵旭坤,郭志宇.酶底物法与多管发酵法检测总大肠菌群差
异分析[J].中国给水排水,28(20):139-141.
[4]高瑞坤,汤琳,傅强.水中粪大肠菌群快速检测方法固定底物酶底物
法与多管发酵法的比较[J].中国环境监测,2008,24(4):39-41.
[5]马原,刘虹.几种粪大肠菌群检测方法的比较[J].黑龙江环境通报,
2011,34(3):43-45.
[6]潘力军,高新岗,王友斌.医疗机构污水粪大肠菌群快速检测方法研
究初探[J].中国卫生检验杂志,2010,20(8):2091-2092.
[7]赵春霞,历以强,梅卓华.酶底物法检测地表水粪便污染的适用性探
讨[J].环境监测与预警,2009,1(2):25-27.
序号
图1地表水2种方法检测结果比较
10000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
序号
图2污水2种方法检测结果比较[2]杨贵羽.土壤水变动下冬小麦根、冠生长动态模型的建立及根、冠动
态特性分析[D].北京:中国农业大学,2013:3-18.
[3]ARAYA A,STROOSNIJDER L,HABTU S,et al.Risk assessment by sowing
date for barley(Hordeum vulgare)in northern Ethiopia[J].Agricultural
and Forest Meteorology,2012,154/155(15):30-37.
[4]DO N,KANG S.Assessing drought vulnerability using soil moisture-based
water use efficiency measurements obtained from multi-sensor satellite
data in Northeast Asia dryland regions[J].Journal of Arid Environments,
2014,105:22-32.
[5]KUKLIK V,HOANG T D.Soil moisture regimes undeer point irrigation[J].
Agricultural Water Management,2014,134(1):42-49.
[6]DOBRIYAL P,QURESHI A,BADOLA R.A review of the methods avail-
able for estimating soil moisture and its implications for water resource
management[J].Journal of Hydrology,2012,458/459(21):110-117. 176。