第五章 双水相萃取技术
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第五章 双水相萃取技术
(Aqueous Two Phase Extraction)
• 双水相萃取 (aqueous two-phase partitioning) 是 1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相 混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的 Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生 物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体 系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞 内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相 体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。 在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提 取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃 取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细 胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步 向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物 学研究和生物工程方面的巨大应用前景。
2 双水相中的分配平衡
与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1 表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下下相和上相 中溶质的总浓度。
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的 各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生 物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:
• 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一 种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合 物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓 度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。 • 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白 或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比 例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋 白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的 缺点。
该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间 电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响， 同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位 的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。
双水相萃取的基本特点
• (1) 体系有生物亲和性。两相中的水分含量通 常高达65%～90% ，所用的PEG、dextran等高 聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核 酸等生物活性物质无毒害，甚至还有稳定保护 作用，而且相界面张力比水-有机或有机-有机 两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于 生物活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有 的生物活性物质亲水性很强，不溶于有机溶剂， 有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质 的分离中发挥其效能。
实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解 质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数 ≠1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配 平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导 溶质的分配系数表达式为: lnm=lnmo+∆φFZ/RT 因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数 成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的 相间电位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机 盐而异.
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
葡聚糖 聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合 物 聚丙二醇 聚乙烯吡咯烷酮 高分子电解质/非离子型聚合物 高分子电解质/高分子电解质 聚合物/ 低分子量化合物 羧甲基纤维素钠 葡聚糖硫酸钠 葡聚糖 聚乙二醇 羧甲基纤维素钠 丙醇 磷酸钾 聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵 聚乙烯醇 聚乙二醇
利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为 等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间 呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏 水性，用HFS (hydrophobic factor of solutes)表示 lnm0=HF× HFS × 一般形式 lnm=HF(HFS+∆HFS)+ ∆φFZ/RT
• (6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和 萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的 理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和 萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的 配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合 物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃 取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的 那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入 另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激 酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等 粒子的提取。
• (5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双 水相体系中可将发酵生产过程中的生物 转化与下游处理的第1步相结合，即生物 反应在其中一相中进行，同时生成的反 应产物被连续萃取到另一相中。不仅解 决了产物反馈抑制作用造成的产量低的 问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲 液中更稳定，活性更大。因为生物反应 和生物产物的提取同时进行，尤其适于 连续生产。
• 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran， Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇 和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水 相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该 双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚 合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可 形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷 酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相 萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相 富含无机盐。
2）疏水作用
一般蛋白质表面均存在疏水区，疏水区占总表面 积的比例越大，疏水性越强。所以，不同蛋白质具有 不同的相对疏水性。在pH为等电点的双水相中，蛋 白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。 同时，疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统 疏水性的影响。因此，有必要确定双水相系统的疏水 性尺度，以便在萃取操作时调整和设计蛋白质的分配 系数。PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相 (PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子 HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性 已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物 亲和作用对溶质分配系数的贡献。
1）静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响， 利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式： lnm=-Mλ/RT m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表 面 性 质 和 成 相 系 统 有 关 的 常 数 ; R- 气 体 常 数 ， J/(mo1．K)；T-绝对温度，K。 因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间 呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不同溶 质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶 质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为 式中的λ随双水相系统而异。
• (2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够 在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高 产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按 比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续 生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。 • (3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类 和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质 在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进 而达到目的产物的最佳萃取条件。 • (4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加 入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然 后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间， 又避免了胞内酶的损失。
双水相萃取的优点
• 操作条件温和，在常温常压下进行。 • 两相的界面张力小，一般在10-4N/cm量级， 两相易分散。 • 两相的相比随操作条件而变化。 • 上下两相密度差小，一般在10g/L。因此两 相分离较困难，目前这方面研究较多。 • 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。
二、双水相萃取的原理
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是 胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗 粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产 品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会 变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机 相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问 题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的 商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、 快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(又 称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
一、双水相萃取的基本特性
• 2 种天然的或合成的亲水性聚合物的水溶液相互 混合时，最常见的现象是，由于2 种聚合物间存 在较强的斥力或空间阻碍，使2者无法相互渗透， 不能形成均一相，故达到平衡后形成两相，这2 种聚合物分别位于互不相溶的两相中，即形成 聚合物/聚合物双水相体系。另外，某些聚合物 溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下， 由于盐析作用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸盐和硫酸 盐。除高聚物、无机盐外，能形成双水相体系 的物质还线 b 两相区 系线 双节线 双节线 均相区 均相区
两相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体 积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
lnmaa=HF(RH+B)
其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)，是 通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水 性最小的甘氨酸的RH＝0。
B = lnmGly/HF
所以，pH＝pI时氨基酸在双水相系 统中的分配系数与其RH值呈线性关 系，直线的斜率就是该双水相系统 的HF值。
• 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂 的相互作用： 的相互作用：
– – – – – 氢键 电荷力 疏水作用 范德华力 构象效应
1 双水相系统
聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种 聚合物的不相溶性 高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相 对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合 过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子 的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到 平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这 种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚 合 物 的 不 相 容 性 。 图 a 和 b 分 别 为 PEG/Dx 和 PEG/KPi系统的典型相图
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连 续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍， 与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还 是成本上都要优越得多。比传统的分离方法(如盐析或有机溶剂 沉淀等)相有很大的优势，因此已被广泛地应用在生物化学、细 胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病 毒等产品的分离纯化和分析等。用此法提纯的酶已达数十种， 其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十 千克湿细胞规模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。
• 常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖 (dextran) 体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran 体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、 细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提 纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性 更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。 • 物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和 离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配 情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗 粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白 质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要 参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子 质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、 温度等。
(Aqueous Two Phase Extraction)
• 双水相萃取 (aqueous two-phase partitioning) 是 1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相 混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的 Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生 物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体 系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞 内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相 体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。 在提纯有生理活性的生物物质方面，与其他提 取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃 取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、细 胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步 向工业化生产迈进，展现了在食品工业、生物 学研究和生物工程方面的巨大应用前景。
2 双水相中的分配平衡
与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1 表示。为简便起见，用c1 和c2分别表示平衡状态下下相和上相 中溶质的总浓度。
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的 各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生 物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:
• 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一 种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合 物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓 度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。 • 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％~95％)，活性蛋白 或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比 例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋 白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的 缺点。
该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间 电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响， 同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位 的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。
双水相萃取的基本特点
• (1) 体系有生物亲和性。两相中的水分含量通 常高达65%～90% ，所用的PEG、dextran等高 聚物或磷酸盐、硫酸盐等无机盐对蛋白质、核 酸等生物活性物质无毒害，甚至还有稳定保护 作用，而且相界面张力比水-有机或有机-有机 两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于 生物活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有 的生物活性物质亲水性很强，不溶于有机溶剂， 有机溶剂萃取等分离技术难以在生物活性物质 的分离中发挥其效能。
实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解 质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数 ≠1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配 平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导 溶质的分配系数表达式为: lnm=lnmo+∆φFZ/RT 因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数 成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的 相间电位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机 盐而异.
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
葡聚糖 聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合 物 聚丙二醇 聚乙烯吡咯烷酮 高分子电解质/非离子型聚合物 高分子电解质/高分子电解质 聚合物/ 低分子量化合物 羧甲基纤维素钠 葡聚糖硫酸钠 葡聚糖 聚乙二醇 羧甲基纤维素钠 丙醇 磷酸钾 聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵 聚乙烯醇 聚乙二醇
利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为 等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间 呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏 水性，用HFS (hydrophobic factor of solutes)表示 lnm0=HF× HFS × 一般形式 lnm=HF(HFS+∆HFS)+ ∆φFZ/RT
• (6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和 萃取专一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的 理化性质相近，造成其萃取专一性不高。亲和 萃取就是将一种和目标蛋白质有很强亲和力的 配基与一种成相聚合物共价结合，该成相聚合 物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃 取时，目标蛋白质专一性地进入结合有配基的 那种成相聚合物所在相中，其它杂蛋白则进入 另一相。此技术已用于乙醇脱氢酶、丙酮酸激 酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、膜等 粒子的提取。
• (5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双 水相体系中可将发酵生产过程中的生物 转化与下游处理的第1步相结合，即生物 反应在其中一相中进行，同时生成的反 应产物被连续萃取到另一相中。不仅解 决了产物反馈抑制作用造成的产量低的 问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲 液中更稳定，活性更大。因为生物反应 和生物产物的提取同时进行，尤其适于 连续生产。
• 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran， Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇 和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水 相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该 双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚 合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可 形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷 酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相 萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相 富含无机盐。
2）疏水作用
一般蛋白质表面均存在疏水区，疏水区占总表面 积的比例越大，疏水性越强。所以，不同蛋白质具有 不同的相对疏水性。在pH为等电点的双水相中，蛋 白质主要根据表面疏水性的差异产生各自的分配平衡。 同时，疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统 疏水性的影响。因此，有必要确定双水相系统的疏水 性尺度，以便在萃取操作时调整和设计蛋白质的分配 系数。PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相 (PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子 HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性 已知的氨基酸在其等电点处的分配系数maa测算
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物 亲和作用对溶质分配系数的贡献。
1）静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响， 利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式： lnm=-Mλ/RT m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表 面 性 质 和 成 相 系 统 有 关 的 常 数 ; R- 气 体 常 数 ， J/(mo1．K)；T-绝对温度，K。 因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间 呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不同溶 质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶 质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为 式中的λ随双水相系统而异。
• (2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够 在较少的溶液量和较短的操作时间内获得较高 产量的产品。另外，操作能够容易、精确地按 比例放大，非常适合大规模应用，可进行连续 生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。 • (3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类 和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质 在两相间的分配，所以操作容易进行控制，进 而达到目的产物的最佳萃取条件。 • (4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加 入PEG和无机盐后再通入珠磨机进行破碎，然 后用离心机分相。既节省了萃取设备和时间， 又避免了胞内酶的损失。
双水相萃取的优点
• 操作条件温和，在常温常压下进行。 • 两相的界面张力小，一般在10-4N/cm量级， 两相易分散。 • 两相的相比随操作条件而变化。 • 上下两相密度差小，一般在10g/L。因此两 相分离较困难，目前这方面研究较多。 • 易于连续操作，处理量大，适合工业应用。
二、双水相萃取的原理
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是 胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗 粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产 品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会 变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机 相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问 题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的 商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、 快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(又 称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
一、双水相萃取的基本特性
• 2 种天然的或合成的亲水性聚合物的水溶液相互 混合时，最常见的现象是，由于2 种聚合物间存 在较强的斥力或空间阻碍，使2者无法相互渗透， 不能形成均一相，故达到平衡后形成两相，这2 种聚合物分别位于互不相溶的两相中，即形成 聚合物/聚合物双水相体系。另外，某些聚合物 溶液和一些无机盐溶液相混时，在一定浓度下， 由于盐析作用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸盐和硫酸 盐。除高聚物、无机盐外，能形成双水相体系 的物质还线 b 两相区 系线 双节线 双节线 均相区 均相区
两相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体 积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
lnmaa=HF(RH+B)
其中，RH为氨基酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)，是 通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水 性最小的甘氨酸的RH＝0。
B = lnmGly/HF
所以，pH＝pI时氨基酸在双水相系 统中的分配系数与其RH值呈线性关 系，直线的斜率就是该双水相系统 的HF值。
• 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂 的相互作用： 的相互作用：
– – – – – 氢键 电荷力 疏水作用 范德华力 构象效应
1 双水相系统
聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种 聚合物的不相溶性 高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相 对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合 过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子 的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到 平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这 种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚 合 物 的 不 相 容 性 。 图 a 和 b 分 别 为 PEG/Dx 和 PEG/KPi系统的典型相图
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连 续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍， 与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还 是成本上都要优越得多。比传统的分离方法(如盐析或有机溶剂 沉淀等)相有很大的优势，因此已被广泛地应用在生物化学、细 胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病 毒等产品的分离纯化和分析等。用此法提纯的酶已达数十种， 其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十 千克湿细胞规模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。
• 常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖 (dextran) 体系和PEG/磷酸盐体系。PEG/dextran 体系一般用于小规模地分离生物大分子、膜、 细胞等，PEG/无机盐体系主要用来大规模地提 纯酶，这是因为PEG/无机盐体系的萃取专一性 更高，葡聚糖价格昂贵的缘故。 • 物质在两相中的选择性分配是疏水键、氢键和 离子键等相互作用的结果，可溶性物质的分配 情况可由分配系数K来表征，细胞这些更大颗 粒的分配情况则由分配比P来表征。影响蛋白 质及细胞碎片在双水相体系中分配行为的主要 参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子 质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH值、 温度等。