哮喘小鼠胸腺活化调节趋化因子及其受体的表达

哮喘小鼠胸腺活化调节趋化因子及其受体的表达
目的探讨胸腺活化调节趋化因子(TARc)及其受体CCR4在哮喘小鼠气道炎症中的作用。

方法清洁级健康雄性Balb／c小鼠20只随机分成两组，分别为对照组、哮喘组。

以卯清白蛋白(OV A)致敏和激发建立小鼠哮喘模型。

末次激发24 h后留取血液、支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织。

BALF行细胞计数及分类；应用酶联免疫吸附试验(ELIsA)法测定BALF和血清中TARC和白介素(IL)－4蛋白的浓度；光镜观察肺组织病理变化；逆转录一聚合酶链反应(RT－PcR)法测定肺组织中TARc mRNA、ccR4 mRNA的表达；采用免疫组织化学法测定肺组织中TARc蛋白的表达。

结果哮喘组BALF和血清中TARc的浓度[分别为(458.36±114.98)pg／ml、(145.56±28.38)pg／m1]均显著高于对照组[分别为(5.06±2.38)pg／ml、(73.79±29.27)pg／mi](P＜0.01)；哮喘组BALF和血清中IL-4浓度[分别为(35.46±12.47)pg／m1、(3.82±1.12)pg／m1]均显著高于对照组[分别为(3.83±1.57)pg／ml、(0.88±0.33)pg／ml] (P＜0.01)；肺组织中TARc mRNA及其受体ccR4 mRNA的表达，哮喘组[分别为(1.12±0.08)、(0.9l±0.13)]显著高于对照组[分别为(0.53±0.12)、(0.62±0.10)](P＜0.01)；免疫组化显示TARc蛋白主要表达于支气管上皮细胞，哮喘组表达量(0.103±0.015)显著高于对照组(0.045±0.007)(P＜0.01)。

结论TARC及其受体ccR4在哮喘小鼠肺组织中表达增加，参与哮喘气道炎症的发病过程，气道上皮细胞是TARc重要的来源细胞。

标签：胸腺活化调节趋化因子；ccR4；哮喘；小鼠；气道炎症
研究显示，CD4+T淋巴细胞在支气管哮喘(哮喘)的病理生理中起重要作用。

Th2细胞分泌的细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等促进IgE的合成及嗜酸性粒细胞(EOS)在气道聚集、脱颗粒、释放嗜酸粒细胞阳离子蛋白等导致气道炎症和气道高反应，同时伴有气道黏液高分泌，因此Th2细胞募集至肺是启动和扩大气道炎症发生发展的直接因素。

但Th2细胞从血液迁移到气道炎症部位的机制目前尚未完全清楚。

胸腺活化调节趋化因子(thymus and activation-regulated chemokine，TARC)是发现的一个新的CC趋化因子，其特异性受体为CCR4，具有趋化Th2细胞从外周血募集至炎症部位的作用。

本研究通过建立哮喘小鼠模型，研究TARC及其受体CCR4在哮喘中的表达情况，以深入揭示TARC及CCR4在哮喘气道炎症中的作用机制。

1材料与方法
1．1 实验动物及材料
清洁级健康雄性Balb／c小鼠20只，4－6周龄，体重18－22 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。

卵清白蛋白(OV A)V级(sigma，USA)；小鼠TARC ELISA试剂盒(R&D，USA)；IL-4ELISA试剂盒(Bender Medsystems)；山羊抗小鼠TARC多克隆抗体(santa Cruz，USA)；RT-PCR试剂盒(Fermentas，USA)；Trizol 抽提试剂(Invitrogen，USA)；TARC、CCR4和GAPDH引物(上海生物工程有限公司)。

空气压缩雾化器(PARI BOY N038，GERMAN)；酶标仪(ELX
808IUBio-TEK，USA)；PCR仪(Biometra，GERMAN)。

1．2动物分组及模型复制
采用随机表法将小鼠分成两组，每组10只，分别为对照组、哮喘组。

第1天和第14天腹腔注射0.5％OV A／A1(OH)3混合液0.2 ml，内含OV A0.1 mg和Al(OH)310 mg，致敏，各1次。

第25天开始将哮喘组动物置于自制密闭有机玻璃箱(30 em×30 cm×30 cm)中，使用空气压缩雾化器向箱内小鼠喷雾1％OV A液激发，每天1次，每次持续30 min，连续1周。

正常对照组致敏和激发均以生理盐水替代OV A。

1．3标本的留取
末次激发24 h后，用10％水合氯醛(400mg／kg)腹腔注射麻醉，用镊子摘眼球取血，血液凝固后以2000 r／min速度离心20 min，吸取血清分装，-80℃保存待检。

颈前暴露气管，做一横形切口，插入20 G留置针管，夹住左肺门根部，右肺行支气管肺泡灌洗，用1.5 mL PBS缓冲液分3次灌洗，回收率在80％以上，收集于离心管中，置于冰块中。

BALF离心(2000 r／min，4℃)10 min后，取上清液－80℃保存备用，沉淀用PBS重悬，用于细胞计数和分类。

肺组织标本的制备采用高温(180℃)灭RNA酶的剪刀和镊子取左肺组织，于靠近左肺门处切取肺组织厚约2－3 mm作冰冻切片免疫组化用，余肺肺组织备RNA抽提，分别包好后迅速丢入液氮速冻后，保存在－80％冰箱。

右肺灌洗后注入4％多聚甲醛固定，常规脱水，透明，浸蜡包埋，制作蜡块备检。

1．4 BALF中细胞计数
将BALF沉渣用PBS重悬，计数细胞总数使用1％－2％的冰醋酸稀释液，细胞分类计数使用瑞氏染色液，EOS绝对值计数用伊红染液。

1．5 BALF和血清中TARC和IL-4浓度的检测
采用ELISA法测TARC和IL-4的浓度，按试剂盒说明书具体操作。

1．6支气管TARC蛋白表达的检测
使用免疫组化sP法检测。

一抗稀释度1:150，3，3．二氨基苯联胺(DAB)显色，苏木素复染，阳性细胞呈棕黄色。

每张切片随机选择至少5个高倍视野，在高倍光镜(×400)测量阳性部位的吸光度，取其平均值代表该小鼠的表达水平。

1．7肺组织TARC mRNA、CCR4 mRNA表达的
检测
肺组织总RNA提取及逆转录过程，按试剂盒的说明书进行操作，cDNA于
一20℃保存备用。

PCR扩增引物序列如下：(1)TARC：5’-CAGGAAGq37GGTGAGCTGGTATA-3’，5’-TYGTGTI’CGCCTGTAGTGCATA-3；(2)CCR4：5’-CGACGATYCCAAAGATGA-3’，5’-TCCAAACAGACCCAACAA-3’；
(3)GAPDH：5’-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3’，5’-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3’。

反应体系为：cDNA lμl，10*PCR buffer 2.0μl，25 mol／L MgCl，1.2 μl，10 mmol／L dNTP mix 0.5μl，TARC(CCR4或GAPDH)上下游引物各0．5 μl，Taq酶(5 U／μd)0.2μl，去离子水补足至20μl。

混匀离心15 s后置PCR仪中。

扩增条件：94℃5 min；94℃1 min，退火温度30 s，72℃1 min，共35个循环；72℃10 min，共1个循环；4℃保存。

退火温度TARC 为54℃，CCR4为56℃，GAPDH为54℃或56℃。

PCR产物观察：取PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，用SmartView凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增带灰度值，以目的基因扩增带灰度值与内参照GAPDH 扩增带灰度值之比，作为其mRNA表达的水平。

1．8统计学处理
全部数据经SPSS 11.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。

两组比较采用成组设计资料的t检验。

两变量的相关分析用Pearson直线相关分析法。

以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果
2．1 症状比较
致敏阶段，在第二次致敏后，哮喘组小鼠出现毛发竖起，俯伏不动，对照组无上述症状。

激发阶段，哮喘组小鼠表现为烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐和二便失禁等症状，严重者呼吸节律不齐，俯伏不动、四肢瘫软，甚至死亡(激发第3天死亡1只)；对照组无上述症状。

2．2 BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞(EOS)计数
哮喘组BALF中细胞总数、EOS绝对数及EOS百分比均高于对照组，两组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.01)，见表1。

表1两组BALF细胞总数、EOS绝对计数及百分数
的比较(x±s)
注：实验过程中因各种原因小鼠死亡或标本不合格，故鼠数与分组数不一致
2．3肺组织病理改变
对照组肺组织HE染色见支气管形态规则，上皮完整，支气管周围未见炎性细胞浸润；哮喘组支气管周围、肺间质和肺泡腔内可见炎性细胞浸润，支气管上皮断裂，细小支气管内可见黏液栓和炎性渗出物。

2．4 BALF和血清中TARC和IL-4浓度变化
哮喘组BALF和血清中TARC、IL-4浓度均高于对照组，两组比较差异具有统计学意义(尸<0.01)，见表2。

表2两组BALF和血清TARC、Ⅱ-4的浓度(x±s，pg／ml)
注：实验过程中因各种原因小鼠死亡或标本不合格，故鼠数与分组数不一致2．5肺组织TARC蛋白、TARC mRNA及CCR4mRNA表达的变化
免疫组化显示TARC蛋白主要表达于支气管上皮细胞，对照组TARC蛋白呈阴性或弱阳性表达，哮喘组TARC蛋白呈棕黄色强阳性表达；哮喘组TARC mRNA及cCR4 mRNA表达的强度显著高于对照组。

哮喘组TARC蛋白、TARC mRNA及CCR4 mRNA的表达量均显著高于对照组(P＜0.01)。

2．6相关性分析
BALF和血清中TARC浓度与EOS绝对值均呈正相关(分别为r=0.867、r=0.765，P＜0.01)；BALF和血清中TARC浓度与IL-4浓度均呈正相关(分别为r=0.931、r=0.831，P＜0.01)；肺组织TARC mRNA与CCR4 mRNA呈正相关(r=0.836，P＜0.01)；肺组织CCR4 mRNA与BALF中IL-4水平呈正相关(r=0.901，P＜0.01)。

3讨论
TARC又称趋化因子配体17(CCL17)，主要表达于胸腺，也表达于肺、结肠、小肠等；由胸腺细胞、巨噬细胞、树突状细胞、支气管上皮细胞及皮肤角质形成细胞等产生。

基因定位于染色体16q13，长度为2176 bp，小鼠与人的TARC氨基酸序列同源性达64％。

TARC的高亲和力受体为CCR4，属7个跨膜区的G蛋白偶联受体，选择性高表达于Th2细胞。

研究发现对哮喘患者进行变应原激发后，BALF及气道中TARC表达及其CCR4+T淋巴细胞明显增高，而在非变应性肺疾病如慢性阻塞性肺病气道中T淋巴细胞表达为CXCR3，而无CCR4的表达；Schuh等研究显示CCR4基因敲除(cCR4－／－)可明显降低变应性小鼠的气道高反应及EOS浸润，提示TARC及CCR4参与哮喘的发生发展。

本实验结果表明，哮喘小鼠血清和BALF中TARC 的浓度、肺组织TARC mRNA和CCR4mRNA表达均明显高于对照组，提示哮喘小鼠肺组织TARC及CCR4表达增高，并且其表达水平与IL－4浓度均呈显著正相关。

CCR4是TARC高亲和力受体，高表达于Th2细胞，IL－4是Th2细胞分泌的主要细胞因子。

提示TARC可能通过CCR4在气道炎症细胞募集和免疫应答中起重要作用。

Borchers等体外研究发现TARC对小鼠EOS有较强的趋化性，提示TARC可能还参与对EOS的募集。

在特应性皮炎患者，血清TARC水平还可作为其严重度及疗效评估的客观指标。

本研究结果也显示BALF和血清中TARC浓度与BALF中EOS绝对值显著正相关，提示血清TARC浓度也可反映气道炎症细胞浸润的程度，并且在临床上有可能作为评估病情及疗效的指标。

Belpefio等在肺纤维化小鼠模型中发现TARC表达增高，并且用免疫组化法显示小鼠及人的支气管上皮细胞是产生TARC的主要来源细胞。

本实验结果亦显示TARC主要表达于支气管上皮细胞，哮喘小鼠的表达明显增高。

ELISA结果还显示对照组血清TARC浓度明显高于BALF浓度，而哮喘小鼠BALF中TARC 浓度显著高于血清浓度，提示正常情况下支气管上皮细胞基本不分泌TARC，但哮喘发作时，支气管上皮细胞则分泌大量TARC。

以上结果表明，支气管上皮细胞是TARC的主要来源细胞；哮喘发作时TARC分泌增多，促使，Th2细胞募集至炎症部位，引起IL-4分泌增加，而IL-4又促进TARC的分泌，从而启动和扩大气道炎症的发生发展。

因此通过趋化因子及其受体来抑制Th2细胞在肺内炎症部位的募集已成为一种新的研究热点。

相信随着进一步对趋化因子的深入研究，以TARC及CCR4为靶目标的针对性措施有望成为气道炎症性疾病一种新的治疗途径。