荧光原位杂交技术解析发酵产氢细菌群落结构
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术原理
荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）
是一种用于检测和定位靶标DNA序列的方法。
其原理是利用
荧光标记的DNA探针与靶标DNA特异性结合，通过荧光显
微镜观察细胞核内荧光信号的强度和位置，从而确定目标
DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术的步骤包括标记DNA探针、固定细胞样品、使细胞核开放透明化、探针与目标DNA杂交、洗涤去掉无特
异连接的探针、显微镜观察和分析。
在标记DNA探针的过程中，将目标DNA序列特异性引物和
荧光标记的核苷酸引物结合，通过聚合酶链反应使DNA探针
荧光标记。
标记DNA探针可以选择性地与目标DNA序列进
行互补结合。
固定细胞样品后，可以通过化学方法将细胞膜破裂并使细胞核透明化，使DNA探针能够更好地进入细胞核。
随后将标记好
的DNA探针加入样品中，在适当的温度下进行DNA杂交反应。
如果目标DNA序列在细胞核中存在，则DNA探针与目
标DNA序列结合，形成探针-目标DNA复合物。
在杂交反应后，需要进行洗涤步骤以去除无特异连接的DNA
探针。
这样可以提高荧光信号的特异性和强度。
最后，利用荧光显微镜观察样品中的荧光信号。
荧光探针与目标DNA序列结合后会发出特定颜色的荧光信号，可以通过观
察荧光信号的位置和强度来确定目标DNA序列在细胞核中的位置和数量。
荧光原位杂交技术可以应用于医学诊断、基因定位等领域，成为研究细胞遗传学和基因组学的重要工具。
分子病理学技术之荧光原位杂交
分子病理学技术之荧光原位杂交分子病理学技术之荧光原位杂交分子病理学是病理学的一个重要分支，其在疾病的诊断、靶向治疗及预后预测等方面的作用日益凸显。
分子病理学技术主要包括三大类：1.荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)；2.测序技术（包括Sanger测序、二代测序等）；3.基于PCR的技术（包括PCR、RT-PCR、实时定量PCR及数字PCR等）。
虽然以上每一类技术都有其特定的检测特点及范围，但作为与病理形态学联系最为紧密的FISH技术，迄今为止，在淋巴瘤、白血病、乳腺癌、胃癌等疾病的临床应用中，依然无法替代。
FISH是一种基于核酸双链互补的原则，将荧光标记的核酸探针与细胞核内靶DNA进行杂交，通过荧光显微镜观察荧光信号来判断靶DNA数目和结构变化的技术。
其基本原理是：核酸变性-退火-复性。
该技术有很高的敏感性和特异性，可用于检测淋巴瘤、白血病及其它各种实体瘤细胞的染色体/基因数目和结构的变化，包括染色体易位、非整倍体变化，基因缺失、扩增等分子遗传学改变，为临床病理工作中疾病的诊断、分类、靶向治疗及预后预测提供准确的分子遗传学信息。
对医院来说，FISH是分子检测领域技术和设备要求门槛最低的平台，只需一台杂交仪和一台荧光显微镜即可开展。
不像PCR需要认证的实验室，也不像二代测序需要强大的数据分析能力。
然而，'第三类体外诊断试剂管理条例'对于FISH探针的限定，曾经在一定程度上有碍这一技术的应用。
近来，国家明文发布，对于非明确诊断意义或临床指导用药的体外诊断试剂，不再按第三类体外诊断试剂进行管理，这也就意味着许多FISH探针不再需要'第三类体外试剂'的报证即可在医院病理科应用，这对临床来说绝对是巨大的好消息！目前除了HER2 及ALK等少数探针外，绝大部分探针均无需'三类证'，这对于满足临床对FISH技术的迫切需求具有重大意义。
荧光原位杂交
荧光原位杂交
• FISH技术包括下列几个步骤：
• 1）探针的制备和标记 • 2）探针及标本变性 • 3）杂交 • 4）洗脱 • 5）杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） • 6）封片 • 7）荧光显微镜观察FISH结果
荧光原位杂交
探针的制备和标记
• 探针是一段带有荧光色素或（半）抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个核苷酸之间，但以250~650个核 苷酸杂交效果最好
下。 （8） 取出玻片，自然干燥。 （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻
片。
荧光原位杂交
封片 • 可采用不同类型的封片液。如果封片液中
不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作 用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发， 可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻 片标本可以在-20～-70oC的冰箱中的暗盒 中保持数月之久。
5～10min，使双链DNA探针变性。 2）标本变性 • ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片
2～3h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中 退色后再烤片）。 • ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70 ％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 • ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90 ％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然 后空气干燥。
洗脱
此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 （1） 杂交次日，将标本从37oC温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻 片揭掉。 （2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50oC的体积分数50 ％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。
（3） 在已预热42～50oC的1×SSC中洗涤3次，每次5min。
荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用_呼庆
第24卷第5期2004年5月生 态 学 报AC TA ECOLOGICA SIN ICAV o l.24,N o.5M ay ,2004荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用呼 庆,齐鸿雁*,张洪勋(中国科学院生态环境研究中心环境生物技术研究室,北京 100085)基金项目:国家“十五”科技攻关重点资助项目(2001BA903B)收稿日期:2003-10-21;修订日期:2004-01-10作者简介:呼庆(1977～),男,内蒙古呼和浩特市人,博士生,主要从事环境微生物分子生态学研究.*通讯作者Author fo r co rrespond ence 。
E-mail :qih y @Foundation item :th e National “Ten th F iv e-year Plan ”Key Techn ologies R &D Prog rame(No.2001BA903B)Received date :2003-10-21;Accepted date :2004-01-10Biography :HU Qing,Ph.D.candidate,mainly engaged in molecular ecology of environmental microorganism.摘要:综述了荧光原位杂交技术(fluor escence in situ h ybridization FIS H)在微生物生态学领域的各种应用,同时就其发展过程、原理及种类做了介绍。
关键词:荧光原位杂交;微生物生态;16Sr RN A;探针Fluorescence in situ hybridization (FISH )and its applications in microbial ecologyHU Qing ,QI Hong -Yan *,ZHAN G Hong -Xun (Environmental Biotechnolog y Lab .,Res earch Center for Ec o -envir onmentalSciences ,Ch ines e Acad emy of Sciences ,B eijin g 100085,Ch ina ).Acta Ecolog ica Sinica ,2004,24(5):1048～1054.Abstract :During r ecent y ears,molecular tech niques such as PC R and denaturing g radient g el electro pho r esis (D GG E)o r DN A sequencing hav e rev olutio nized all fields of micr obio lo gy ,a nd sensitiv e detectio n and ex act identifica tio n o f bacteria a re po ssible.Fluo rescence in situ hy bridization (F ISH)using 16Sr RN A pro bes do es no t rely o n PCR amplificatio n,a nd as such prov ides a useful complementa ry tech nique to DG GE for the ana ly sis of o rg anisms.Because of FI SH allo wing nucleic acid sequences to be exa mined inside cells witho ut a ltering the cell 's mo rpho lo g y o r the integ rity o f its v arious compar tments and pr oviding info r matio n abo ut number,spatial distributio n and cellular env ironment,it has beco me a po w erful too l fo r phylog enetic,eco lo gic,diag no stic and enviro nmenta l studies in micr obio lo gy.Fluo rescence in situ hy bridization ca n detect nucleic acid sequences by a fluor escently labeled pr obe that hybridizes specifically to its complementa ry ta rge t sequence within the intact cell .Its g ener al procedure in FISH a na ly sis ofmicr oo rg anisms is as follow s :(1)fix ation of the specimen ;(2)pr epa ration of th e sam ple ,possibly including specificpret reatment steps ;(3)hy bridization w ith the respectiv e pro bes fo r detecting the respectiv e tar ge t sequences ;(4)w ashing steps to r emov e unbound pr obes ;(5)mounting ,v isualization and documentatio n of r esults .Because F ISH g iv es a detailed picture of the micro envir oments without any selectiv e purificatio n o r amplificatio n steps ,ther e is a la rg e sco pe o f FISH applica tio ns .It ha s bee n ex tensiv ely used in the field of envir onmental micr oo rg anisms div e rsity such a s the inv estiga tio n o f micro bia l communities o f aqua tic ha bitats and soil ha bitats.M o st o bliga te mic ro bia l symbio nts a re as-y et uncultur ed.U sing the 16Sr RN A approa ch ,they can be identified and ph ylog ene tica lly ing different FI SH stra teg ies,bacte rial endo symbio nts w er e detected in many micro or ganisms.Po pulation analysis by F ISH has prov en par ticula rly useful fo r descriptio n o f the no rma l flo ra o r that o f mixed micro bia l infectio ns.This has been sho wn fo r medicine resea rch such as ora l cavity ,g astro -intestina l flo ra,respira tor y t ract infectio ns.It sh ould be pointed o ut that FISH is no t f ree o f bia ses a s with o ther mo lecula r methods.T he mo st st riking pr oblem is auto fluo rescence of micro org anisms themselv es.In additio n,accur acy and reliability of FIS H is highly dependent o n the specificity of the o lig o nucleo tide pro be.that FI SH as a pow er ful to ol will make mo r e co ntributionscommunities.Key words:fluo rescence in situ hy bridization;micro bial eco lo gy;16Sr RN A;pro be文章编号:1000-0933(2004)05-1048-07 中图分类号:Q93-3,Q938 文献标识码:A微生物是地球生物圈的重要组成部分。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(2820)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 根据A基因序列设计原核表达引物。
A基因序列如下：ATGTCCGAAGTAATCGAAGAACATCTTCTCAGCGATAATTCTGATGATTCCAGCTCGGAAT TGACTTCTAC………GGACGAACCACGAAGAGACGATATTAApET28a多克隆位点如下引物设计必须满足：要求在引物两端分别加上BamHI（GGATCC）和EcoRI（GAATTC）。
要求表达的重组蛋白C端带His标签。
答案：设计引物时应注意：（1）酶切位点前后必须添加1～6个保护碱基，以提高限制性核酸内切酶的切割效率。
（2）His标签座落在酶切位点的下游，且靠近终止密码子，且mRNA的翻译方向是由N端向C端，所以目的片段插入时的顺序不颠倒。
（3）引物长度一般在18～27bp，且与目的片段有合适的互补长度以保证引物可以顺利结合。
上游引物可为（5′端至3′端）：CGCGGATCCGCGATGTCCGAAGTA。
下游引物可为（5′端至3′端）：GGCCTTAAGGCCAATTATAGCAGA。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. DNA是生物界中唯一的遗传物质。
（）答案：错误解析：RNA也可以做遗传物质。
2. 碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不相同的。
（）答案：错误解析：碱解法和煮沸法分离质粒DNA的原理是相同的，都是根据染色体DNA的变性和复性差异的原理。
3. 基因表达的最终产物都是蛋白质。
（）答案：错误解析：基因表达的即便最终产物不都是蛋白质，有时是RNA。
4. 原核生物应急反应信号是鸟苷四磷酸和鸟苷五磷酸。
它们的作用范围十分广泛，不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批操纵子的转录，属于超级调控因子。
【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解
【高中生物】荧光原位杂交(FISH)技术详解荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。
20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。
1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。
20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
原理FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。
它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。
将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
实验流程FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。
特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。
用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。
缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。
采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。
FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。
六大优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用
术 在 应 用 中存 在 的 问题 ， 对 其 应 用 前 景 进 行 了展 望 。 并 关键 词 荧 光 原 位 杂 交 １ Ｓｒ Ｎ ６ Ｒ Ａ 寡 核 苷 酸 探 针 微 生 物 群 落 结 构
维普资讯
净
水
技 术
Ｖｏ． ５ ． ０６ １２ Ｎｏ １ ０ ２
ＷＡ ＲＰ ＴＥ ＵＲＩ Ｉ ＴＩ Ｃ Ｆ ＣＡ ＯＮ ＴＥ ＨＮＯＬ ＯＧＹ
荧光原位杂交技术在微 生物群落结构研究 中的应用
李华芝 李 秀艳 徐 亚 同
（ 东师 范大 学资 源 与环境 学 院环境 科 学 与技 术 系 上 海 ，０ ０ ２ 华 ２０６ ）
分 析 以及多 种 细胞遗 传 学研 究方 面得 到应用 。１ ８ ９８
ａ ｎ ｔ ｎ ｏ ａ ｔ ｐ ｅ ｅ ｔａ ｄ ｆ ｔ ｒ ｐ ｌ ａ ｉｎ ， ｎ ｅ ｓ ｅ ｔ ｅ ｅ ｅ ｅ ｐ ｃｅ ｂ ｕ ｈ ｓｔ ｃ ｎ ｌｇ ． ｍｉ ａｉ ｆｐ ｓ ， ｒ ｓ ｎ ｎ ｕ ｕ ｅ ａ ｐ ｉ ｔ ｓ ａ ｄ ｐ ｒｐ ｃ ｉ ｓ ｗ ｒ ｘ ｅ ｔ ｄ ａ ｏ ｔ ｉ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｃ ｏ ｖ ｔ ｅ Ｋｅ ｗｏ ｄ Ｆ Ｓ ｙ ｒｓ Ｉ Ｈ １ Ｓ ｒ ＮＡ ｏｉ ｏ ｕ ｌ ｏ ｉｅ ｐ ｏ ｅ ｍｉｒ ｂ ａ ｏ Ｒ ６ ｌ ｎ ｃｅ ｔ ｒ ｂ ｇ ｄ ｃ ｏ ｉ ｃ ｍｍｕ ｉ ｔｕ ｔ ｒ ｌ ｎ ｔ ｓｒ ｃ ｕ ｅ ｙ
对 于一些 培养条 件要 求较苛 刻 或未被 培养 的细 菌往
境 中监 测和 鉴定 不 同 的微生 物个 体 ．同时对微 生物 群 落进 行评 价 。 目前 ，ＩＨ 技 术广泛 应 用 于微生 物 ＦＳ
揭秘基因密码——荧光原位杂交分子病理报告解读
视界照耀科技| 11MEDICAL HEALTH医学健康生命是一部由基因编写的复杂交响曲，而荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization ，FISH ）是揭示这部交响曲内在奥秘的重要工具之一。
FISH 是一种生物分子分析技术，用于研究细胞和组织中的染色体结构、基因定位和基因表达。
该技术通过使用荧光标记的DNA 或RNA 探针与目标DNA 或RNA 序列杂交，然后通过荧光显微镜观察杂交信号的位置和数量。
FISH 技术让人们能够在细胞和组织层面上观察基因、染色体的情况，了解患者病变部位的分子生物学特征，从而为个体化医疗提供支持。
但对于许多患者而言，他们并不了解FISH ，甚至对为何进行FISH 检测存在疑惑。
本文将从科普角度解读FISH 分子病理报告，以及FISH 走入临床工作的意义。
1 FISH 的前世今生FISH 从实验室走进临床工作，已经历了50余年的历史。
1969年，科研工作者利用放射性标记DNA 或28S RNA 发明了FISH 。
尽管当时原位杂交技术已经具有较高的特异性和灵敏度，但鉴于放射性同位素自身特性的局限，如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题，这项技术仅限于实验室研究方面的应用。
1986年，有科研工作者开始利用异硫氰酸盐荧光素来标记探针，并在荧光显微镜下进行观察分析，建立了荧光原位杂交技术。
1989年，Delong 首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。
20世纪90年代，FISH 技术已具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点，这使得FISH 技术逐渐商业化，并出现了各种商业化的荧光标记探针和相关试剂。
同时，自动化的FISH 系统也开始出现，使得该技术更加高效和可靠。
随着技术的发展，研究人员实现了多色FISH ，允许在同一样本中同时检测多个目标。
这作者简介：陈烨，博士，研究实习员，主要研究方向为分子病理研究。
通信作者：陈光勇，博士，主任医师，主要研究方向为消化系统疾病病理诊断。
荧光原位杂交技术
该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建 立起来的。当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列 DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分 重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对 的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技 术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。
非放射性标记法
直接法
荧光素（fluorescein）或其他荧光染料
间接法
地高辛（digoxigenin） 生物素（biotin）
1. 随机引物法 2. 缺口平移法 3. PCR法 4. 寡核苷酸末端标记法 5. 直接在探针3’或5’端合成
1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul
5种荧光素联合标记人类24条染色体
荧光素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
FITC ☆
☆☆ ☆
☆☆ ☆
☆☆☆ ☆
Cy3
△ △ △ △ △△
△
△
△△
Cy3.5
○
○○
○○ ○○
○○ ○ ○
Cy5
※※※※
※※
※※※※
4. 混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时
5. 65 ℃处理10min终止反应
染色体标本变性
共变性
杂交液加到标本上封片，置80 ℃烘箱中10分钟
荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用
济大学环境 与 ［ ： 程学 院污染控制 与资源化研究国家重点实验窜 ２ ０ ９ ｝ 海 ０ ０２
【 关键 词 】Ｐ Ｒ ＤＧＧＥ活 性 污 泥 微 生物群 落 结构 Ｓ ａｎｎ多样 性 指 数 Ｃ ｈｎ ｏ
【 文 摘】利用分子生物学技术 ， 直接从化学 一 生物 絮凝工艺的活性污泥样 品中提取 Ｄ Ａ，对 １Ｓ Ｄ ＡＶ Ｎ ６ Ｎ ３ ｒ 区进 行 Ｐ Ｒ扩 增 ，结合 Ｄ Ｃ ＧＧＥ变性 浓度 梯度凝 胶 电泳） （ ，分析 了活性 污泥 中微 生物群 落结 构 ，并对 Ｓａｎｎ ｈｎｏ 多样性指数进行分析讨论，通过研究指出系统中细菌数量的增加或减少 ．测定了活性污泥 中部分菌种的 １Ｓ ６ ｒＮ ３ Ｄ ＡＶ 区片段序列 ， 通过 Ｎ Ｂ（ ＣＩ 美国国立生物技术信息中心） 基因库比对 ，初步确定细菌的属 ． 结果表明，
李华芝 李秀艳 徐 亚同
华东师范大学资源与环境学院环境科学与技术 系 Ｉ ２ ０ ６ 海，０ ０ ２
【 关键 词 】荧光 原 位杂 交 １ Ｓｒ ＮＡ 寡 核苷 酸 探针 微 生物群 落 结构 Ｒ ６ 【 文
－－ — —
摘 】该文 综 述 了荧 光 原 位 杂 交 技 术 的 发展 、技术 原 理及 其 在 环 境 微 生物 群 落 研 究 中 的应 用 ，还 探
张建栋 王梦亮 刘 滇生
大 学 现 代 化 学 研 究所 ＇Ｉ Ｉ曲太 原 ０ ０ ０ 【 ３０ ６
【 关键 词 ｌＰ Ｆ 堆肥 化 微 生物 群 落 结 构 Ｌ Ａ
【 文 摘 ｌ利用磷脂脂肪酸（Ｌ Ａ 方法分析堆肥化过程 中微 生物群落结构的变化 ，对 Ｐ Ｆ ＰＦ ） Ｌ Ａ数据进行主成 分 分析 显专 ，随着 警 肥 温 度 的 升 高 ，嗜热 菌 浓度 增 长 很 快 ，而 嗜 温 菌 浓度 却开 始 降 低 ，到 最 高温 时 浓度 达到最低 。到腐熟 期 ，能利 用木 质素 和纤维素 的细菌 （１ ：０ ５ ，ｉ ６ ．６：１ ｎ ｃ ： ｉ ５ ，ａ ：０ ：０ １ １ １ ７ ，１ ｗｉ ６
荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用_李华芝
Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用李华芝李秀艳徐亚同（华东师范大学资源与环境学院环境科学与技术系上海，２０００６２）摘要该文综述了荧光原位杂交技术的发展、技术原理及其在环境微生物群落研究中的应用，还探讨了该技术在应用中存在的问题，并对其应用前景进行了展望。
关键词荧光原位杂交１６ＳｒＲＮＡ寡核苷酸探针微生物群落结构ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）ｔｏＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅＬｉＨｕａｚｈｉＬｉＸｉｕｙａｎＸｕＹａｔｏｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６２，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｉｔｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＦＩＳＨｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｎｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｅｎｖｉ－ｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ，ｉｔｓｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｓｈｏｒｔａｇｅｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎａｎｅｘ－ａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｗｅｒｅｅｘｐｅｃｔｅｄａｂｏｕｔｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＦＩＳＨ１６ＳｒＲＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ微生物是生态系统的重要组成部分，在各种元素的生物进化循环中起着关键作用。
因此，研究微生物的群落结构，借此了解微生物和环境的关系尤为重要。
长久以来，微生物群落结构的调查方法一直是建立在分离和培养的方法上，这种方法不但费时费力，而且不能精确地反映混合菌群的组成和多样性，对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果［１］。
关于细菌的一些荧光原位杂交(FISH)的资料
阿哈湖深层水中微生物和硫酸还原菌数量及群落结构空间变化本文章中细菌FISH操作流程：材料方法：1.样品采集于2006年6月使用Niskin采样器，从18m深度开始按1m间距采集贵州阿哈湖水深22m处的深层湖水，共采集5个样品（编号为Aha06101-Aha06105），样品立即用45多聚甲醛进行固定。
2.主要试剂和仪器：多聚甲醛（Sigma，美国）；明胶（Oxiod，美国）；丫啶橙（Sigma，美国）；DAPI （Sigma，美国）；荧光显微镜（Olympus，日本）。
3.荧光探针采用EUB338和SRB385寡核苷酸探针，5’端Cy3标记（表1），由上海生物工程技术服务有限公司合成。
表1 16S rRNA 探针的靶细菌种属和探针序列探针名称序列（5’-3’）检测的微生物EUB338 GCT GCC TCC CGT AGG AGT 真细菌SRB385 CGG CGT CGC TGC GTC AGG 硫酸盐还原菌4.荧光原位杂交法对阿哈湖深层水环境总微生物、真细菌和硫酸盐还原菌数量的分析4.1 样品预处理取1ml样品用直径25mm GTTP滤膜过滤后，1 ml PBS 洗涤3次后，0.5ml 50%、80%和99.5%乙醇分别洗涤，每次3min，风干。
4.2 原位杂交湿盒中适量加入杂交缓冲液（EUB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1Tris-Hcl，0.01% SDS，20% formamide；SRB探针杂交缓冲液0.9mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，35%甲酰胺），将包被有明胶的玻片放于湿盒中，膜放于玻片上。
25ng·μl-1探针4μl和杂交缓冲液20μl混匀后，滴加于膜上，38℃ 90min；取出膜放入洗涤液中50℃20min （EUB探针洗涤液0.18mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，5mmol·L-1 EDTA；SRB探针洗涤液0.40mol·L-1NaCl，20mmol·L-1 Tris-Hcl，0.01% SDS ，5mmol·L-1 EDTA）水洗膜，风干；&O &- /7·/? K -的<1=> 4& "? 复染，避光-0 /*$，水洗，风干。
荧光原位杂交的原理
荧光原位杂交的原理嘿，朋友！你有没有想过，在微观的生物世界里，科学家们是怎么像侦探一样精准地找到特定的基因或者染色体片段的呢？这就不得不提到一个超级厉害的技术——荧光原位杂交（FISH）啦。
我给你打个比方吧，你可以把细胞想象成一个巨大的图书馆，里面装满了各种各样的“书籍”，这些“书籍”就是染色体。
每本“书”上都写满了密密麻麻的“文字”，这些“文字”就是基因。
而荧光原位杂交呢，就像是一个超级智能的图书管理员，它能够在这个巨大的图书馆里，准确地找到特定的那本“书”或者那一页“文字”。
那这个技术到底是怎么做到的呢？其实呀，这里面涉及到一些非常巧妙的分子生物学原理。
我们先来说说这个“探针”。
这个探针就像是一把特制的钥匙，它是一小段单链的DNA或者RNA。
这把“钥匙”的设计可是非常有讲究的，它的碱基序列是和我们想要找到的目标基因或者染色体片段的碱基序列互补的。
你可以想象一下，这就像一把钥匙只能开一把锁一样，这个探针只能和特定的目标序列结合。
在进行荧光原位杂交的时候，我们要先把细胞固定在载玻片上，就像把图书馆里的书架固定住，不让里面的“书籍”乱跑。
然后呢，我们要让细胞里的染色体DNA变成单链的形式。
这就好比把“书籍”打开，把里面的“书页”摊开，让那些“文字”都暴露出来。
这个过程有点像我们把紧紧卷在一起的毛线团解开，变成一根根的毛线，这样才能让我们的“钥匙”有地方插进去。
接下来，就到我们的“超级钥匙”——探针出场的时候啦。
我们把带有荧光标记的探针加入到这个细胞的体系里。
这个探针就会在这个微观的世界里到处游动，寻找它的“目标锁”。
一旦它发现了和自己互补的序列，就会紧紧地结合上去。
这就像钥匙插入了锁孔，然后咔哒一声，完美匹配。
这个过程在细胞里是非常神奇的，就像一场微观世界里的精确对接比赛。
比如说，我有一个朋友是做遗传学研究的。
有一次，他就跟我讲他用荧光原位杂交技术来检测一种罕见遗传病的基因。
他当时特别兴奋地说：“你知道吗？这个技术就像在一堆干草里找一根针，但是它真的能找到！”他在实验室里，看着那些细胞在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光，就知道他找到了目标基因。
基于原位杂交技术的微生物群落分析研究
基于原位杂交技术的微生物群落分析研究微生物群落是一系列微生物在生态系统中的聚集附着体，它们之间相互作用，对环境有着至关重要的影响。
而对微生物群落的深入了解和研究不仅可以揭示微生物之间的相互影响，也能够为我们更好地理解环境和生态系统的运行机制提供重要的参考。
为了深入研究微生物群落，人们通常采取的方法是利用现代的生物技术手段。
其中一种非常重要的技术是原位杂交技术，即利用DNA探针与环境中的微生物进行相互结合，并用荧光或放射性示踪原位探针的分布，从而实现对微生物群落的定量和定性研究。
原位杂交技术基本原理是，将探针与内部标记结合并以小分子为载体，送入细胞中，等待探针与目标核酸进行杂交反应。
相比于传统的PCR等技术，原位杂交技术不需要经过扩增步骤，避免了PCR产物带来的误差，也避免了PCR产物降解带来的影响。
同时，原位杂交技术还具有高灵敏度、高分辨率等特点，能够在细胞水平上精确捕获微生物群落结构，成为微生物学研究中非常有力的手段之一。
在微生物群落分析中，原位杂交技术的应用范围极为广泛。
例如，可以利用原位杂交技术快速检测环境中的特定微生物细种或完成对某些环境微生物共生关系的研究。
同时，原位杂交技术还可用于优化菌株筛选、工业微生物发酵过程监测、农业土壤微生物生态系统分析等领域。
虽然原位杂交技术在微生物群落分析中已经得到广泛应用，但其仍存在一些技术难点。
首先，对于病原微生物的快速检测和诊断，原位杂交技术仍面临着灵敏度和特异性等方面的问题；而对于复杂微生物群落的性质和结构的理解，原位杂交技术也需要进一步地优化和完善。
此外，针对环境因素、处理方法、探针选择等方面，还需要开展更深入的研究和探索，以便准确地获得、处理和分析微生物群落数据。
总之，微生物群落分析是微生物学领域的一个重要前沿课题，而原位杂交技术又是其中不可或缺的重要手段。
随着生物技术的不断推进和微生物群落研究的深入，相信原位杂交技术在未来的微生物学研究中将有更广泛的应用。
（精选）荧光原位杂交的认识
对荧光原位杂交技术的认识摘要:荧光原位杂交技术（FISH）作为分子水平的微生物检测技术，已成为目前首要生物学核酸检测技术，本文主要介绍了FISH的发展及在污水处理中的应用，重点介绍了在硝化细菌方面的应用，并给出了FISH技术存在的缺陷及改进的方法。
Abstract:Fluorescence in situ hybridization (FISH) , as a microbial molecular detection technology, has become the first biology nucleic acid detection technology. This paper introduces the development of FISH and the application in wastewater treatment, and mainly introduces the application in nitrifying bacteria.Further more,it also describes the disvantages in FISH and the improved methods.关键词：荧光原位杂交技术（FISH），16S rDNA(16S rRNA),污水生物处理荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization）是在同位素原位杂交技术基础上发展起来的非放射性原位杂交方法，起始于20世纪70年代后期。
它以16S rDNA(16S rRNA)探针用特殊的核苷酸分子标记然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维素切片上的定性，相对定量分析。
有不同细菌的16S rDNA都有其独特序列，利用这些独特的序列制成的探针可以鉴别和跟踪自然样品中的目标细菌。
荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究_孙寓姣
荧光原位杂交技术在环境微生物生态学解析中的应用研究孙寓姣1,2 王 勇1 黄 霞1(1.清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京100084;2.哈尔滨工业大学环境生物技术研究中心,哈尔滨150090)摘 要 近年来,诸多国家在环境微生物领域先后开展了分子生物学研究方法的建立和生物学评价工作。
一些不依靠纯培养的微生物群落的分析方法已得到广泛应用和发展。
荧光原位杂交(FISH )技术,具有细胞在测定过程中不被破坏、形状不改变、特异性强、能够真实反映在自然环境下微生物的情况及分布等特点,在环境微生物群落探测分析中已逐渐被广泛应用。
该技术利用带有荧光标记的特异性寡核苷酸探针,与细胞内相应的靶核糖体结合,能将微生物探测、鉴定到属和种的水平。
运用于硝化细菌、除磷细菌和丝状微生物等废水处理中常见的特征性微生物种群和群落生态学研究中,颇为高效。
该技术的应用避免了传统培养方法进行鉴定和计数的局限性,在环境微生物生态学解析中具有较高应用价值。
关键词 分子生物学 荧光原位杂交 寡核苷酸探针 环境微生物 微生物生态学Application of fluorescence in situ hybridization inanalysis of environmental microbial ecologySun Yujiao 1,2 Wang Yong 1 Huang Xia 1(1.Environmental S imul ation and Poll u tion Control S tate Key Joint Laboratory ,Department ofEnvironmen tal Science and Engineering ,Tsinghua Univers ity ,Beijing 100084;2.Environmental Biotechnol ogy Research Office ,Harbin Industry University ,Harbin 150090)A bstract Recently ,molecular biology methods are established and biology evaluation are carried out inenvironmental microbiology field in many countries .Some methods to analy se microbiological community w ithout traditional culture -based methods are used ex tensively .Fluorescence in situ hybridization (FISH )technology can exactly reflect the natural colo nial morphology of culturable and unculturable org anisms .In FISH method ,especial probes are used to hybridize w ith targeted rRNA in cells ,and the exact identification of bacteria can be attained to genus and species level .Nitrifying bacterium probes ,phosphate -removing bac -terium probes ,and filamentous bacterium probes are often used in microbiology morphology ,count ,spatial distribution studies .FISH technology avoids the localization of bacterial traditional culture -based methods ,and has a g reat potential in environmental microbial ecology analy sis .Key words molecular biology ;fluorescent in situ hybridization (FISH );oligonucleotide probes ;envi -ronmental microorganism ;microbial ecology 资助项目:国家“863”高技术研究发展计划项目(2002AA601220)收稿日期:2003-08-22;修订日期:2003-10-09作者简介:孙寓姣(1975～),女,博士研究生,主要从事环境微生态学研究。
荧光原位杂交技术在活性污泥菌群识别中的研究进展_费学宁
Advances in Identification of Activated Sludge Bacteria by Fluorescence in situ Hybridization
Fei Xuening1 ，Cao Yang1 ，Hao Yachao1 ，Chi Yongzhi1 ，Li Yuyou2
FISH 所采用的探针必须具有特异性强，灵 敏 度 高，良 好 的 组 织 渗 透 性。 一 个 典 型 的 寡 核 苷 酸 探 针 长度一般是 15 ～ 30bp［16］。FISH 技术的常用探针可分为 3 类：第 1 类是包括 α 卫星和卫星 Ш 类 的 染 色 体特异重复序列探针；第 2 类是全染色体或染色体区域特异性探针，由一条染色体或其上某一区域几段 不同的核酸片段组成；第 3 类是位点特异性探针，这类探针由 1 个或几个克隆序列组成［15］。
（ 1 Tianjin key laboratory，Department of Environmental and Municipal Engineering，Tianjin Institute of Urban Construction，Tianjin 300384； 2 Department of Civil Engineering，Tohoku University，Sendai 980-8576 Japan ）
摘 要 荧光原位杂交技术（ FISH） 广泛地应用于分析环境微生物的群 落 组 成，能 够 同 时 对 微 生 物 进 行 定 性、定量分析，并确定微生物群落空间分布情况。本文阐述了 FISH 法应用于活性污泥处理系统的重要作用，综 述了 FISH 法在活性污泥及生物膜微生物 菌 群 的 组 成、结 构 与 功 能 的 研 究 和 应 用，同 时 讨 论 了 其 在 应 用 中 存 在 的不足，并在此基础上总结了一系列可供改进的措施，最后对 FISH 的灵敏度、靶向性的改性等进行了展望。
荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用
荧光原位杂交技术及其在微生物生态学中的应用
荧光原位杂交技术及其在微Байду номын сангаас物生态学中的应用
介绍了荧光原位杂交技术的基本原理,讨论了该技术的操作程序及其在微生物生态学领域的应用.
作 者：夏铁骑 XIA Tie-qi 作者单位：濮阳职业技术学院,生物系,河南,濮阳,475000 刊 名：新乡学院学报（自然科学报） 英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 26(2) 分类号：Q938.1 关键词：荧光原位杂交 寡核苷酸探针 16SrRNA 微生物生态学 fluorescence in situ hybridization oligonucleotide probe 16S rRNA microbial ecology ?
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中国环境科学
２ ０ ，７３ ：２ ５ ２ ９ ０ ７２ （） ９ — ９
Ｃ ｉａ ｎｉｌ ｅ
荧 光 原 位 杂 交技 术 解 析 发 酵 产 氢 细 菌 群 落结 构
陈 瑛 ， 南琪 卜宋佳 秀 （． 任 ， １ 哈尔滨工业大学市政环境工程学院， 黑龙江 哈尔滨 １０９； ． ５００ ２ 哈尔滨师范大学
ｐｏ ｕ ｔ ｎ ｅｍｅ ｔｔ ｅ ｔｐ ａ ｄ ａ ｔｒ ｏ ｒ ｄ ｃ ｏ ，ｆｒ ｎａ ｖ ｅ ｎ ｂ ｃｅ ａ ｃ ｍ ｉ ｉ ｙ ｉ ｕ ｉ ｎ ｓ ａ ｄ ａ ｕ ｔｖ ｒ ｃ ａ ｄ ｔ ｎ ｕ ｎ ｅ ｏ ｈ ｄ ｏ ｅ ｎｔ ｋ ｄ ｙｉ ｎ ｍｏ ｎ ａｉ ｅ ｎ ｉ ｉｆ ｅ ｃ ｎ ｙ ｇ ｎ ｎ ａ ｓ ｌ ｒ
生物系， 黑龙江 哈尔滨 １０ ８ ） ５０ ０
摘要 ： 用荧 光原 位杂 交（ＩＨ） 术， 究 了连续 流搅 拌槽 式（ Ｓ Ｒ 发酵 制氢 反应 器 中 ２ 产氢 发酵 类型 的菌 群组 成和 发酵 类型 转化 过程 应 ＦＳ 技 研 ＣＴ） 种
中 的菌群 种类 和数 量变 化及 其对 产 氢速 率 、生物 量和 发酵 产物 的影 响 ． 果表 明． 菌属 和肠 杆菌 科在 决定 产 氢发酵 类 型方 面有 重要 作用 ． 结 梭 以梭 菌为 优 势种群 的乙 醇型发 酵 比 以肠 杆菌 为优 势种 群 的丁 酸型 发酵 具 有更 佳 的产氢 能 力． 验 结果 能够 与 生物发 酵 系统 常规 监测 指 标 实
形成 很好 的印证 ．
关 键词 ：生 物制 氢 ；发酵 ；荧 光原 位杂 交（ＩＨ） ＦＳ ；细 菌；群 落 结构
中图分 类号 ：Ｘ１２ ３ ７， Ｑ９ 文 献标识 码 ：Ａ 文 章编 号 ：１０－ ９３２０ ）３ ０９－ ５ ０ ０６ ２（０ ７０ —２ ５０
Ｃｏ ｍｍｕ ｉ ｔｕ ｔ ｒ ｓ ｆ ｅ ｍｅ ｔｔｖ ｙ ｒ ｇ ｎ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇｂ ｃｅ ｉ ｏ ｎｔ ｓｒ ｃｕ ｅ ｒ ｎ ａｉｅｈ ｄ ｏ ｅ － ｒ ｄ ｃｎ ａ ｔｒａｃ ｍｍｕ ｉ ｙｆ ｏ ｅｃ ｎ ｉ ｙ ｒｄｚ ｔ ｎ ｙ ｏｆ ｎｔ ｂ ｕ ｒｓ ｅ ｔｉ ｓｔ ｈ ｂ ｉａ ｏ ． ｙ ｌ ｎ ｕ ｉ ｉ ＣＨＥＮ ｎ ， Ｎ ｎ ｑ ， ＯＮＧ ｉ．ｉ １Ｓ ｈ ｏ ｆ ｎｃｐ ｌａ ｄＥ ｖｒｎ ｎａ ｎ ｉｅ ｒｎ ， ｒ ｉ ｎ ｔｕｅｏ Ｙｉｇ ＲＥ Ｎａ ．ｉ Ｓ Ｊａｘ ｕ （ ，ｃ ｏ ｌ ｏ Ｍｕ ｉｉａ ｎ ｎ ｉｏ ｍｅ ｔｌ ｇｎ ｅ ｇ ＨａｂｎＩ ｓ ｔｔ ｆ Ｅ ｉ ｉ
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