景观人工湿地微生物群落结构的季节变化

景观人工湿地微生物群落结构的季节变化
3
凌　云1
,林　静2
,徐亚同
3
(1.上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;2.深圳市环境科学研究所,
广东518001;3.华东师范大学环境科学系,上海200062)
摘要:采用PCR-DGGE 技术对梦清园人工芦苇湿地不同季节的细菌群落变化进行了研究。

结果表明,随着水体流动和季节更替,人工湿地中优势细菌一直在变化。

测序结果显示芽孢杆菌在系统中较占优势,4个季节里都可以检测出来。

恶臭假单胞菌在春夏秋3季比较有优势,而冬天枯草芽孢杆菌比较适合在该芦苇湿地中生存。

经湿地处理后,水体细菌群落的多样性下降,相似性升高,部分细菌被淘汰出水体,但适应的细菌生长较快,整体细菌数量上升。

对底泥的研究中,随运行时间的增加,进水口与出水口的细菌相似性分别下降,且进水口的相似性下降要明显快于出水口。

关键词:人工湿地;微生物群落;PCR-DGGE 中图分类号:X172
文献标识码:A
文章编号:(K )09088(原1002-1264)(2009)04-0008-03
M i crob i a l Co mm un ity Changes i n Reed Con structed W etl and i n D i fferen t Sea son s
L ING Yun 1
,L IN J ing 2
,XU Ya 2t ong
3
(1.College of Fisheries and L ife Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Shenzhen I nstitute of Envir on mental Sciences,Guangdong 518001,China;3.Depart m ent
of Envir on mental Sciences,East China Nor mal University,Shanghai 200062,China )
Abstract:The m icr obial co mmunity in the constructed wetland ofMengqing Park was studied with PCR-DGGE in different seas ons .The results of DGGE sho wed that the m icr obial structures had significant changes in different seas ons,with the do m inating bacteria changed als o .Bacillus had been detected in f our seas ons,and the Bacillus subtilis was the do m inating bacteria in winter .The diversity of m icr obial co mmunity in effluent was l o wer than in influent,with the si m ilarity increase .But the vig or ous gr o wth of do m inating bacteria made the nu mber of bacteria increased .I n the sedi m ent,the bacteria
si m ilarity of the intake and outlet both decreased with ti m e,and there was more decrease in the sedi m ent of intake .
Key words:constructed wetland;m icr obial community;PCR-DGGE
人工湿地处理受污染水体是近年来研究的一个热点,而微生物是湿地中的主要分解者。

因此,研究湿地微生物的多样性是评价人工湿地作用、研究人工湿地污染物去除机制的重要指标。

随着分子生物学方法的发展,以基因检测为基础的微生物检测手段可以提供更为可靠而全面的结果,为环境样品中的微生物群落结构研究提供了有力的帮助。

变性梯度凝胶电泳DGGE 是目前应用较为广泛的微生物群落结构
分子生物学检验方法之一[1]。

本研究采用DGGE 技术对梦清园人工芦苇湿地中不同时间、不同地点的细菌种类变化进行了分析,人工湿地的去除机理研究提
供进一步的理论支持[2]。

1　材料与方法
1.1　环境细菌的检测和样品总DNA 的提取
试验在上海市梦清园芦苇人工湿地中进行
[3]
,该
湿地为表面流人工湿地,主要用作景观湿地,运行时
水深0.5m ,底泥厚度0.9m 。

每天进水10h,水力负荷0.20m /d,水力停留时间为2d 。

每月在人工芦苇湿地的进水口和出水口采集水样和表层浮泥样品,用
培养计数法进行细菌数量的检测[4]
,取平均值以季度为单位显示;将每季度3个月的样品混合后进行微生物DNA 的提取。

用0.2μm 的醋酸纤维膜滤纸过滤200mL 水样富集水中的细菌。

采用申能博采的“环境样品DNA 提取试剂盒”进行底泥和水体中细菌总DNA 的提取,具体操作方法可参见说明书。

1.2PCR -DGGE 扩增
根据文献[5]
设计细菌16S r DNA 序列PCR 引物357fGC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGGCCT ACGGG AGGCAGCAG -3’
)和518r (5’-ATT ACCGCGGCTGCTGGPCR-3’
),用于扩增细菌16S r DNA 的V3区段。

扩增总体系为50μL:模板DNA 40～80ng;10mmol/L 4×dNTPs 1.5μL,
8　
第22卷4期2009年8月
城市环境与城市生态
URBAN ENV I RONMENT &URBAN ECOLOGY Vol .22No .4Aug .2009
3基金项目:国家高科技研究发展863计划“上海城市水环境质量改善技术与综合示范项目”
(2003AA601020);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金支持(B-8101-08-0013);上海市教委重点学科(J50701)支持
　收稿日期:2009-05-27
5U /
μL Taq 酶1μL,20pmol/μL 引物各1.5μL,10×扩增缓冲液(含Mg 2+),5μL ddH 2O 补足至50μL 。

扩增条件:94℃预变性5m in;20个循环的降落PCR (94℃1m in,退火30s,72℃3m in;退火温度由65℃到55℃,每一循环递减0.5℃);15个循环(94℃1m in,55℃退火30s,72℃3m in );72℃延伸10m in 。

反
应产物直接用于变性梯度凝胶电泳(DGGE )分析。

1.3　PCR -DGGE 凝胶电泳及结果处理
DGGE 凝胶电泳:所用胶浓度为8%,其变性梯度为55%～70%(100%的变性剂中含有7mol/L 的尿素和40%的去离子甲酰胺),电压150V,60℃电泳300m in 后,EB 染色20m in 。

在紫外灯下观察摄像。

选取具有代表性特征的条带割胶,回收测序,测序工作由上海生工生物公司完成。

通过B last 对Gen Bank 数据库中序列进行相似性搜索得到细菌种属的结果。

通过Tano 软件将DGGE 图谱照片转化成数字信号,运用MS VP 软件计算多样性和相似性。

多样性和相似性分别采用香侬威纳(Shannon-W iener )多样性指数和索伦森配对相似性系数(Sorens onPair wise Si m ilar 2
ity Coefficient )来表示[6]。

2　结果与分析
2.1　细菌数量变化
对水体中的细菌数量进行检测,结果如图1。

图1　水体细菌数量变化
在人工湿地的处理过程中,水体的细菌数量一直
在103～104
CF U /mL 之间波动,秋天最高可以到4.06
×104个/mL,最低只有冬天的1.10×103个/mL,与四季温度变化规律吻合,但出水的细菌数量始终略高于进水。

底泥中异养细菌的变化规律与水体相似,但密度明显高于水体,为湿地中有机质的分解提供了良好的条件。

2.2　水样与底泥细菌的细菌16S r DNA 多态性分析 底泥和水体中细菌的DNA 用引物357fGC /534r 扩增得到了预期大小的片段,将直接PCR 产物通过DGGE 分析,均得到了若干分离的条带(图2)。

从图谱可以看出,在水样中,8条泳道没有发现明显的共同
亮带,底泥样品结果也基本类似。

如水体中仅有条带3在8个样品中都有出现,但强弱差别很大;而底泥样
品中只有条带4在四个季节中都有出现,且在冬季进水口底泥中未被检出。

因此,随着水体流动和季节的变化,人工湿地中的优势细菌和群落结构始终在发生着变化,受到水质与气候的影响较大。

图2　DGGE 结果
2.3　细菌Shannon -W iener 多样性指数研究
多样性指数研究的结果见表1。

进水以及进水口的细菌多样性要高于出水和出水口,这与进水带来的大量营养成分有关。

但经湿地处理后,部分细菌被淘汰,适应湿地环境的细菌大量生长,使出水细菌种类减少但数量增加。

同一样点在不同采样时期,湿地底泥中细菌多样性呈现夏秋季较高,春冬季较低的态势。

其中水体中的细菌除了冬季气候影响导致多样性大大降低之外,其他季节水体和底泥中细菌多样性变化幅度并不是很大,芦苇湿地的运行状况是基本稳定的。

表1　不同季节人工湿地细菌的Shannon-W iener 多样性指数位置
水体
春季夏季秋季
冬季
底泥
春季
夏季秋季
冬季
进水 2.89 3.18 3.46 2.77 2.48 2.71 2.83 2.30出水
2.69
3.09
3.09
2.71
2.40
2.64
2.39
2.30
2.4　Sorens on 相似性系数分析结果
相似性系数的分析结果见图3。

对细菌的相似性统计可以看出,在进出水样中,春夏秋进水的相似性小于出水,说明经过人工湿地的处理后,细菌的相似性越来越接近,在温度合适时,湿地能使细菌群落往近似的方向发展。

底泥的相似性变化分析中,进水口底泥的相似性越来越小,可能是系统开始运行不久,土质比较均匀造成的,但随着系统的运行,两者之间的相似性差距越来越大。

而出水口底泥春夏和秋冬季节的相似性
9
　凌　云,等　景观人工湿地微生物群落结构的季节变化
较高,同样有着湿地处理使得出水口相似性接近的情况,但温度的变化也可能造成春夏季和秋冬季相似性有较大的差异。

比较进水口附近样品的相似性与出水口的差别较大,因此湿地系统的环境条件改变了苏
州河水的细菌群落结构类型,促进了某些微生物的生长,但对一些微生物有去除作用。

由于未做进一步研究,还不能判断这种变化是否有利于微生态环境的发展。

图3　Sorens on 相似性系数分析
2.5　细菌的鉴定结果
DGGE 图谱中6条典型的目标条带进行测序的序
列通过B last 对Gen Bank 数据库中序列进行相似性搜索。

鉴定结果见表2。

表2
DGGE 部分条带鉴定结果
条带号
比对结果
相似性(%)
中文
种属1B acillus cereus H3081.9798蜡质芽孢杆菌2B acillus pum ilus ATCC 706198
短小芽孢杆菌3U ncultured B acillus bacterium
clone
M10Ba65
97不可培养菌
4U ncultured bacterium clone sv21d598
不可培养杆菌
5B acillus subtilis subsp .subtilis 100枯草芽孢杆菌6
Pseudo m onas putida G B-1
94恶臭假单胞菌
从鉴定结果可以看出,目标条带中有两株为不可培养细菌。

此外芽孢杆菌的生存力始终较强,无论在水样中还是在泥样中,在4个季节里都可以检测出来,假单胞菌在春夏秋季的泥样中有表达,而在冬天枯草芽孢杆菌比较适合在该芦苇湿地中生存,因此在采用微生物强化系统处理能力的时候可以适当考虑采用该类菌种。

3　小结
人工湿地中夏秋季细菌数量最高,冬季最低,底泥中的细菌数量要高于水体。

经过湿地的处理,水体和底泥中细菌数量均有上升。

在梦清园芦苇湿地中,没有始终明显的优势菌株。

芽孢杆菌的生存力相对较强,而在冬天枯草芽孢杆菌比较适合在该芦苇湿地中生存,因此在采用微生物强化系统处理能力的时候可以适当考虑采用该类
菌种。

在进出水体中,夏、秋天的细菌多样性指数相近,冬季多样性下降明显,相似性系数都不高,但没有明显规律。

经芦苇湿地处理后,细菌多样性降低,但相似性升高。

湿地底泥的多样性指数进出水口较为相
近,整个湿地系统细菌生态状况良好,但随湿地运行时间增加,进出水口细菌相似性减弱,且进水口的相似性分化要明显快于出水口。

参考文献
[1]　Eichner C A ,R W Erb ,K N Ti m m is1Ther mal .Gradient Gel
Electr ophoresis Analysis of B i op r otecti on fr om Pollutant Shocks in the Activated Sludge M icr obial Community [J ].
App lied and
Envir onmentalM icr obi ol ogy ,1999,(65):102-109.
[2]　Marsh T L ,L iu W en Ts o ,L J Forney .Beginning A Molecular
Analysis of the Eukaryal Community in the Activated Sludge [J ].W ater Science &Technol ogy ,1998,(4):455-460.
[3]　凌云,林静,吴淑杭,等.上海市梦清园芦苇湿地脱氮研究[J ].农
业系统科学与综合研究,2007,23(1):102-104.
[4]　周德庆.微生物学实验手册[M ].上海:科学技术出版社,1986.[5]　Delbes C,Leclerc M ,Zum stein E,et al .A Molecular Method t o
Study Populati on and Activity Dyna m ics in Anaer obic D igest ors[J ].W ater Science Technol ogy,2001,43:51-57.
[6]　Gillan DC,A GCL Speksnijder ,G Z wart .Genetic .D iversity of the
B i ofil m Covering Montacuta Ferruginosa (Mollusca,B ivalvia )as Evaluated by Denaturing Gradient Gel Electr ophoresis Analysis and Cl oning of PCR Amp lified G Frag ment Coding for 16Sr DNA [J ].App lied and Envir onmental M icr obi ol ogy ,1998,(9):3464-3472.
作者简介:凌云(1978-),男,浙江湖州人,博士,主要从事微生物生态学的研究,发表论文5篇。

1 城市环境与城市生态　22卷4期　2009年。