微生物群落结构研究2015-01

表达差异
基因表达量，差异表达聚类及功能显著性富集等
韩国泡菜的宏基因组+宏转录组研究
1. 基于宏基因组结果：明串珠菌 （Leuconostoc）、乳杆菌属 （Lactobacillus）和魏丝氏氏菌 属（Weissella）为发酵过程中 优势菌属，4种主要的乳酸菌比比 例都超过了5%； 2. 宏转录组分析发现有23种乳酸 菌与泡菜的发酵有关，宏转录 组的分析结果表明除两种微生生 物外所有的乳酸菌都对泡菜发 酵有影响，即使丰度较低的微 生生物在泡菜发酵过程中也有着 积极的作用用。 结果讨论
抗生生素添加剂对猪肠道菌群环境的影响：! 16S rDNA+宏基因组
1. 0和14天分别取样；
用用添加促生生⻓长的 ASP250（含⻘青霉素、 磺胺甲嘧啶、氯四环 素等多种抗生生素）和 正常饲料喂养的猪（给 三头）。 2. 提取DNA，进行行16S rDNA的 V3区扩增测序，分析 ASP250对肠道物种组成的影 响； 3. 通过宏基因组，分析添加 ASP250对功能和耐药因子子的 影响。
差异比比较
物种组成和丰度比比较，多样本差异分析， 找出差异物种。
16S rDNA
454 ，400bp， V4 ! V6 454 ，400bp，V3 ! V5 454 ，400bp， V1 ! V3
V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8
Hiseq 2000, 150PE Miseq , 250PE, V4 Miseq , 300PE, V3 -> V4
Database
Name Greengene RDP Silva UNITE ITS2 Assembling the Fungal Tree of Life (AFTOL) ITSoneDB FunGene Focus Bacteria,Achaea Bacteria,Achaea Bateria,Achaea,eu karyon Root-associated fungi ITS2 Fungal phylogeny Fungi ITS1 Sequecne data on-line 16S 16S 16S,18S,23S,18S ITS ITS2 SSU, LSU, ITS, RPB1, RPB2, mitSSU, mitATP6,TEF1 ITS1 FunctionGene URT http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/ nph-index.cgi http://rdp.cme.msu.edu/ http://www.arb-silva.de/ http://unite.ut.ee/ http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/ aftol.org http://itsonedb.ba.itb.cnr.it:8080/ITS 1/ http://fungene.cme.msu.edu/
NAM Y D, CHANG H W, KIM K H, et al. Metatranscriptome analysis of lactic acid bacteria during kimchi fermentation with genome-probing microarrays[J]. International Journal of Food Microbiology 2009, 130(2): 140-146.
Youssef N,et al. 2009. Comparison of species richness estimates obtained using nearly complete fragments and simulated pyrosequencing-generated fragments in 16S rRNA gene-based environmental surveys. Appl Environ Microbiol. 75:5227-36.
结果讨论 Looft, T., T. A. Johnson, et al. "In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome." Proc Natl Acad Sci U S A 109(5): 1691-6.
图A：不同样品0和14天耐药因子子的差别
手手术所需的粪便；并进一一步开发“粪便胶囊”，替换传统的抗生生素治疗。
Classical methods
• Categorize: ∼17 morphologies • 个体大大小小: • 形状与排列: 杆菌，球菌，弧菌…… • 细胞结构: 鞭毛毛，芽孢，荚膜，纤毛毛…… • 菌落形态：菌落颜色色，大大小小，光泽…… • 生生理生生化指标：营养类型，碳源谱，氮源谱…… • 致病性……
材料背景
研究思路
结果讨论
Kembel, S. W., E. Jones, et al. "Architectural design influences the diversity and structure of the built environment microbiome." ISME J 6(8): 1469-79.
Meta
宏
基
因
组
研
究
思
路
基于单独分离培养的 方方法研究微生生物，只 能获取不超过5%的微 生生物种类，而而超过 95%的微生生物是不可 培养的！
采用用Meta研究方方法， 直接对整个群落提取 DNA，进行行建库测 序，获取全部序列信 息，不需要经过培养， 获取信息更完整。
群落结构分析介绍 宏基因组分析介绍
数据分析操作（基于16S数据）
答疑讨论
Metagenome
物种分类
基于reads比比对的物种分类和丰度统计
基因组组分
组装，基因预测，特殊元件（CRISPR等）
宏基因组
基因功能
通用用数据库功能注释，KEGG, GO， ARDB等
差异比比较
物种组成差异，功能基因差异
Hiseq 2000, 100PE
16S rDNA
可变区 V1-V2 V3 V4 V5-V6 V6 V6-V7 V7 V7-V8
引物位点 27-355 338-548 530-826 805-1065 967-1065 967-1238 1046-1238 1046-1406
与16S全长比比较 高高估(1.2) 低估(0.88) 接近(0.97) 接近(1) 高高估(1.67) 接近(0.98) 低估(0.6) 低估(0.65)
!
Meta-transcriptome
基因芯片片结合宏基因组和宏 12天连续发酵过程中不 同时间的韩国泡菜发酵 液样品，发酵液ph值下 降过程中选取4个代表 时间点进行行宏基因组和 宏转录组分析。 材料背景 研究思路 转录组分析：构建了针对 39种乳酸菌的特异性基因 组探针芯片片(genome probing microarrays， GPM)，用用来研究韩国泡菜 发酵过程中微生生物的多样性 及其基因表达的情况。
!
图B：Beta内酰胺酶、四环素外排泵、磺 胺类药抗性因子子、氨基糖苷类磷酸转移酶等 在使用用ASP250 14天后显著增加 图C：不同样品0和14天物种组成分差别比比 较大大的几几个物种
Meta-transcriptome
基因预测
组装，基因预测
宏转录组
基因功能
通用用数据库功能注释，KEGG, GO等
ITS
➢ITS：（Internal Transcribed Spacer，内部转录间隔区）：属于中度保守区域，种内 相对一一致，种间差异相对明显，长度在450-750之间。 由于18S不像16S，具有较少的高高变区，进化速率慢，没有ITS快（是18S的10倍）， 多用用于系统发育。 ➢ITS结构：
Metagenome
➢
技术路线
Prepare genomic DNA of cases & controls
!
Gut microbial gene related diseases
Bioinforamatics analysis/association study
Fragment
Assembly
Tens of millions of reads per lane
群 落! 整! 体! 研! 究! 思! 路!
!
!
群落结构分析介绍 宏基因组分析介绍
数据分析操作（基于16S数据）
答疑讨论
Tools
✓EstimateS: http://viceroy.eeb.uconn.edu/estimates ✓R: http://www.R-project.org ✓Mothur: http://www.mothur.org/ ✓Qiime: http://www.qiime.org ✓ USEARCH: http://www.drive5.com/usearch/ ✓Others: DOTUR, Chimera_Check.
Meta
16s rRNA
ITS/18S rDNA
Metagenome
Meta
Meta-transcriptome
Metavirus
Research strategy
数据处理
低质量，tags拼接，数据比比对，嵌合体…
物种注释
OTU聚类，物种注释，物种丰度；
16S/ITS
复杂度统计
稀释曲线，Alpha多样性；
环境 免疫
人人体 微生生物
遗传
失调
疾病
耐药 卫生生 因素
生生活 方方式
HMP(Human Microbiome Project): http://www.hmpdacc.org/
Metagenome
从宏基因组装出单菌
单细胞测序 生生物信息学组装单菌
H Bjørn Nielsen et al. identification and assembly of genomes and genetic elements in complex metagenomic samples without using reference genomes. Nat Biotechnol. 2014
微生生物群落研究分享
Outline
群落结构分析介绍 宏基因组分析介绍
数据分析操作（基于16S数据）
答疑讨论
粪便变胶囊 粪便移植治疗消化道疾病：浙大大附属医院通过粪便移植的方方法成功治疗炎症 性肠病和抗生生素相关性肠炎这两个消化科的两大大顽疾； 美国粪便银行行：收集健康人人群的粪便，为美国122家医院提供粪便微生生物移植
微生生物群落
微生生物总DNA
微生生物总RNA
PCR扩增特定区域
特定区域区测序
宏基因组调查
宏转录组调查
微生生物多样性分析 •物种分类 •OTU分析 •物种丰度分析 •多样品间差异比比较
微生生物群落物种分类 功能组成以及代谢网网络研究 •基因预测 •功能注释 •物种分类 •物种及基因功能差异
检测差异表达基因 筛选高高活性微生生物 •基因预测 •物种及功能注释 •基因表达差异统计
Metagenome
➢采用用高高通量测序进行行的宏基因组研究
Metagenຫໍສະໝຸດ Baidume
In humans, microbes • provide protection against foreign invaders, • educate and stimulate the immune response, • produce antimicrobials, • aid in digestion, • produce vitamins, • among a host of other functions.
NTS rDNA-repeat NTS rDNA-repeat
ETS1
18S rDNA
ITS1
5.8S rDNA
ITS2
28S rDNA
ETS2
ITS
➢测序区域： 454：ITS1，ITS2，ITS，18S Miseq：ITS，18S
北京雾霾颗粒中微生生物群落的研究 16S+18S
空气气中收集PM2.5和PM10 颗粒样本（主要污染源之 外的地点），分别从 PM2.5和PM10颗粒样本中 提取DNA进行行全基因组 测序分析 使用用测序数据中 的16S和18S数据 分别进行行细菌、 真菌和病毒的物 种注释，进行行物 种丰度比比较分 析. 1. PM样本中细菌所占的微生生物比比例非非 常大大，而而且大大部分的细菌都与土土壤的 微生生物组成相似； 2. 发现PM样本中存在部分已知的病原 菌，包括：肺炎双球菌 (Streptococcus pneumoniae)，烟曲 霉菌(Aspergillus fumigatus)和腺病 毒(human adenovirus C) 等; 并且随 着雾霾的持续，这些病原菌成分会逐 步上升。
Metagenome
396个人人样本的测 序数据 通过组装得到基因集 3,871,657个基因
Reads比比对到核心心 基因集完成单独到组 装
选取seed基 因，根据丰度信息 构建核心心基因集
最终组装出 238 个独特的基因组草图，构建 7381 个 CAGs(co-abundance gene groups)
1. 添加ASP250喂养后，拟杆菌 ⻔门、 梭菌等显著减少，奇异球 菌-栖热菌⻔门和变形菌⻔门显著上 升，其中变形菌⻔门从1%上升到 11%； 2. 不添加ASP250喂养，猪肠道中 也有很多耐药因子子，但添加后 使抗生生素失活的酶组分降低、 外排泵系统和保护抗生生素的活 力力显著增加。
材料背景 研究思路