拟南芥AtGLRs基因家族的研究

拟南芥AtGLRs基因家族的研究
叶放;陈庆;朱世华
【摘要】AtGLRs是拟南芥中类似动物iGluRs的受体家族,在植物的钙离子信号传导和转运、光信号传导、碳氮代谢调节、ABA生物合成、胁迫响应、根的生长等方面起着重要作用,文章对AtGLRs基因功能的最新研究进展进行了综述.
【期刊名称】《宁波大学学报（理工版）》
【年(卷),期】2011(024)001
【总页数】4页(P14-17)
【关键词】拟南芥;iGluR;AtGLR;谷氨酸
【作者】叶放;陈庆;朱世华
【作者单位】宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波31521l;宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波31521l;宁波大学科学技术学院,浙江宁波315211【正文语种】中文
【中图分类】Q344+.4
L-谷氨酸是动物的一种重要兴奋性神经递质,在中枢神经系统中, 离子通道型谷氨酸受体(Ionotropic Glutamate Receptors, iGluRs)作为谷氨酸门控的离子通道, 介导了大部分的神经兴奋传递[1].
研究发现, 在没有神经系统的植物中, 如拟南芥、烟草、豌豆、玉米和水稻中也有编码类似受体(Glutamte Receptors, GLRs)的基因存在, 其中拟南芥存在由20个谷氨酸受体基因组成的基因家族, 植物中的此类基因吸引了一些学者的研究, 笔者
对AtGLRs基因功能研究的成果和进展进行了综述.
1998年在拟南芥中首次发现了与哺乳动物iGluRs高度同源的拟南芥谷氨酸受体(A. thaliana Glutamate Receptors, AtGLRs)基因[2], 其后的研究发现了一个含20个AtGLRs的基因家族[3], 这些基因可以划分为 3个簇(Cluster)或亚族(Subfamily),用RT-PCR分析根、叶、花和果4个器官中20个基因的表达, 发现20个基因中有5个仅在根部特异性表达, 这5个AtGLRs基因都属于第2亚族; 剩余 15个基因除了在根中表达外, 在其他器官中也有表达[4]. 单一细胞质mRNA RT-PCR的结果显示: AtGLRs基因协同表达的种类和数量在同一个体的不同组织(表皮和叶肉)间差异较小, 而在不同个体的相同组织(表皮和叶肉)间却存在较大差异. 说明AtGLR基因家族成员间可能在功能上存在冗余[5].
对植物 GLRs氨基酸序列的分析发现, 植物GLRs能够形成类似动物离子通道型谷氨酸受体的离子通道结构, 它们的跨膜结构域和配体结合结构域氨基酸序列与iGluRs高度同源: 含6个保守结构域, 包括4个跨膜结构域: M1～M4以及2个配体结合结构域GlnH1(S1)和GlnH2(S2)[6-7], 这些谷氨酸受体的结构相似, 由 4～5个亚单位聚合形成离子通道, 每个亚单位由一个基因编码. 相同亚单位聚合形成同源多聚体离子通道, 不同亚单位聚合成异源多聚体通道, 对不同离子的通透性因亚基的组成而异[6].
植物GLRs与动物iGluRs之间的分离可能早于动物iGluRs的分化, 因为植物GLRs与动物3种iGluRs (NMDA/AMPA/KA受体)不同, 单独为一簇[4]. GLRs、iGluRs有2个与细菌周质结合蛋白同源的结构域, 作为激动剂结合位点: 其中一个属于赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸受体(LAOBP)家族; 另一个则是N末端结构域(NTD), 属于亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸受体(LIVBP)家族, LIVBP结构域的功能为激动剂变构结合和促进亚基装配成寡聚蛋白[8]. 在动植物谷氨酸受体分化前, 一次重组事件将GLRs LIVBP域同G蛋白偶联受体7个跨膜结构域融合,产生了原始subC-GPCRs,
而iGLRs基因通过GLRs基因的点突变, 选择进化而来. 因此与动物iGluRs LIVBP 域相比, 植物GLRs LIVBP域同subC-GPCRs LIVBP域的联系更为密切, 推测远古的植物 GLR基因是iGLRs和subC-GPCRs基因的共同祖先[9].
4.1 钙离子通道和钙离子转运
4.1.1 钙离子通道
根尖细胞在外源谷氨酸处理下会产生快速的细胞膜去极化, 同时伴随胞质内 Ca2+浓度峰值出现; 用质膜Ca2+通道抑制剂La3+处理后, 谷氨酸就不能引起胞质
Ca2+浓度的增加和细胞膜的去极化;用Ca2+螯合剂EGTA预处理根尖, 谷氨酸同样不能引起胞质Ca2+浓度的增加, 说明谷氨酸能触发Ca2+通过质膜流入胞内从而导致胞质 Ca2+浓度的显著变化[10]. 动物iGluRs拮抗剂DNQX (6,7 dinotropuinoxaline 2,3 (1H, 4H) dione)可以阻断子叶中谷氨酸(甘氨酸)引起的胞质Ca2+浓度增加[11]. 进一步利用突变体glr3.3进行的电生理实验发现, 谷氨酸不能激发突变体 glr3.3的细胞膜去极化和胞质 Ca2+浓度峰值出现, 因此推测AtGLRs参与了植物的钙离子调控[12]. 通过与大鼠GluR1和GluR6的融合实验, 发现AtGLR1.1和AtGLR1.4具有对Na+、K+和 Ca2+选择性通透的核心结构域[13]. 过度表达AtGLR3.1基因会削弱 Ca2+诱导的气孔关闭, 说明与 Ca2+调控的气孔关闭运动相关[14]. 因此, 推测AtGLRs具有谷氨酸门控的钙离子通道功能. 4.1.2 钙离子转运
通过RT-PCR和mRNA印迹方法发现AtGLR3.2基因的转录产物主要集中在分裂旺盛的组织和较为成熟的胚轴、叶和花芽的维管组织中, 推测可能与钙离子转运相关[15].
AtGLR3.2的过度表达使植株产生了缺钙症状,导致根尖坏死和叶尖坏疽. 但转基因植株的总钙量同野生型相比差异并不显著, 经过量 Ca2+处理挽救后, 钙缺乏症状消失, 植株恢复正常. 表明过度表达的 AtGLR3.2并不影响 Ca2+的吸收和积累, 而是
导致 Ca2+的利用率降低才产生缺钙症状. AtGLR3.2启动子融合GUS转化拟南芥, GUS基因在根和茎的维管组织中表达, 在导管邻近细胞中的表达尤其强烈, 推测AtGLR3.2编码的亚单位参与了钙离子转运[16]. AtGLR1.3和AtGLR3.3启动子融合GUS转化拟南芥, AtGLR1.3主要在根尖皮层表达, 而 AtGLR3.3主要在植株维管组织表达, 因为植物吸收土壤中的矿物质等离子与根尖的皮层组织相关而维管组织是植物运输矿物质的通道, 暗示它们的功能可能分别与 Ca2+的吸收和转运相关
[17]. 此后, 在小萝卜中过度表达 RsGluR也导致与过度表达AtGLR3.2相似的表型
[18].
4.2 光信号传导
光培养条件下, 生长在含 DNQX平板上的拟南芥幼苗其下胚轴长度是对照长度的1.5～2倍, 同时 DNQX削弱了幼苗的叶绿素合成, 这些效应是光特异性的, 在黑暗条件下无效. 说明DNQX至少能够部分阻断光诱导的幼苗下胚轴伸长抑制和叶绿素合成[2]. BMAA (β-Methylamino-L-alanine, 一种动物 iGluR激动剂), 在光照条件下可以抑制拟南芥幼苗根的生长和子叶张开, 并刺激下胚轴伸长2～3倍. 与DNQX处理相似, 这种效应同样是光特异性的. 同时, 该效应可以被加入的外源谷氨酸消除[19], 推测AtGLRs基因在植物体内可能起到一种光信号传导的作用.
4.3 碳氮代谢的调节和ABA关系
在缺N (仅含3%蔗糖)培养基中, 反义AtGLR1.1 (antiAtGLR1.1)拟南芥植株与野生型对照, 其种子萌发受到抑制. 在外加N后, antiAtGLR1.1种子的萌发恢复正常, 说明不同的C/N比能够影响种子的萌发, 高 C/N 比抑制了 antiAtGLR1.1的种子萌发. ABA在碳氮代谢和种子萌发中起到重要作用, 在antiAtGLR1.1株系中, 与碳氮代谢相关的HXK1 (己糖激酶I)等多个关键酶转录降低; 而ABA1转录水平提高, 导致植株体内 ABA 的积累, 经测定antiAtGLR1.1株系的内源ABA浓度较野生型要高8倍, 说明AtGLR1.1参与了C/N的代谢, 并通过对ABA合成的调控来控制
种子萌发[20-21].
4.4 环境胁迫
对拟南芥AtGLR3.4基因启动子融合GUS转基因植株提供外力刺激, 发现机械外力(如损伤、穿刺)能够诱导 AtGLR3.4表达量增加[22]. 冷胁迫能够诱导拟南芥细胞膜快速去极化和细胞外 Ca2+流入,导致胞质Ca2+浓度快速增加[23]. 通过定量RT-PCR分析, 发现冷处理 5min, 再放回正常环境 15min之后, AtGLR3.4基因转录水平达到最高, 但此效应能被质膜 Ca2+通道抑制剂 La3+阻断, 用一定浓度ABA 对实验材料进行处理, ABA并不影响AtGLR3.4基因的转录[22]. 推测AtGLR3.4基因在环境胁迫快速响应机制中的作用是基于Ca2+信号, 而与ABA无关.
4.5 氨基酸信号的协同作用
甘氨酸处理、甘氨酸与谷氨酸协同处理能够有效阻断动物iGluRs拮抗剂DNQX 诱导的拟南芥幼苗下胚轴延伸, 之后转基因拟南芥表达水母发光蛋白表明: 甘氨酸处理、甘氨酸与谷氨酸协同处理可分别诱导胞质Ca2+浓度瞬时增加, 而这2个诱导都能被DNQX抑制. 推测AtGLRs可能是一种类似动物NMDAr (NMDA Receptor)的受体, 可以接受谷氨酸和甘氨酸的协同作用[11].
进一步的研究发现, 除谷氨酸外, 甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、丝氨酸和谷胱甘肽的处理都能诱导野生型拟南芥幼苗根尖细胞膜瞬间去极化和细胞外
Ca2+大量流入, 而这一效应在突变体glr3.3中大幅度降低, 因此推测这6种氨基酸都能作为AtGLR3.3的激动剂[12]. 随后对野生型拟南芥幼苗的下胚轴使用上述 6种氨基酸中的任意2种进行先后处理(共36对处理), 发现这些氨基酸作为激动剂的作用并不是等效的, 例如谷氨酸引起的细胞膜去极化后的失敏现象不能被其他氨基酸信号解除, 而谷氨酸能够解除其他氨基酸信号引起的失敏现象, 由此推测GLRs离子通道可以分为A、B、C 3类: A类离子通道仅受谷氨酸激活和失敏; B类离子通道能够被丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸激活和失敏; C类离子通道能被所有
6种氨基酸激活和失敏. 通过对突变体glr3.3和突变体glr3.4的实验, 推测AtGLR3.3是3类离子通道的必要组成部分, 而AtGLR3.4是后2类通道的组成部分[24].
4.6 其他高等植物中的GLRs
在水稻OsGLR3.1基因的T-DNA插入短根突变体中, 因根尖分生组织的分裂能力受到阻碍, 细胞凋亡的增强导致短根, 说明OsGLR3.1基因与根尖的分生组织分裂和细胞发育密切相关, 参与调控根系的生长和发育[25]. 对小萝卜RsGluR基因的研究发现, 小萝卜GLRs是位于细胞膜上的谷氨酸门控的钙离子通道, 参与了受茉莉酸生物合成调控的病菌防御过程[18].
因为异源表达系统构建不成功等原因, 拟南芥AtGLRs的功能研究至今没有突破性进展, 它们的生理功能、进化上意义也都没有确定, 然而通过电生理学、药理学、AtGLRs基因过度表达株系和反义AtGLR株系的研究, 越来越多证据表明, 植物的GLRs可能是一类特殊的GLRs受体, 对于它们的研究有可能开启探索“植物神经学”的大门.
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