发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究

发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究
黄伟剑;何梦玲;张宏意;严寒静
【摘要】目的筛选诱导广藿香毛状根的最佳条件,建立广藿香毛状根诱导体系,并以此体系作为下一步研究的基础.方法采用共培养法,用发根农杆菌ATCC15834和C58C1,经预培养、侵染、共培养和除菌操作诱导广藿香外植体产生毛状根.结果预培养时间为2d,乙酰丁香酮质量浓度为15 mg/L,侵染时间为25 min,共培养时间为2d,发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导率均达到最高,分别为83.3％和
80.5％;PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表达,说明广藿香毛状根已经被成功诱导.结论成功诱导并建立了广藿香毛状根诱导体系.
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】2015(031)002
【总页数】5页(P156-160)
【关键词】广藿香;毛状根;诱导;发根农杆菌;ATCC15834;C58C1
【作者】黄伟剑;何梦玲;张宏意;严寒静
【作者单位】广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R282.2
广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth．]为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，性辛、微温，具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑等功效，原产菲律宾，东南亚各地栽培较多，中国南方地区也有大量栽培，是广东“十大广药”之一[1]。

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhizobiacea)农杆菌属(Agrobacterium)的一种革兰阴性细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物[2-3]。

发根农杆菌含有致根Ri质粒，当发根农杆菌侵染植物时，Ri质粒上的T-DNA在Vir基因的协助下整合进入植物的核基因组，表达后会产生许多生长迅速、多分支成毛状的不定根，称为毛状根。

毛状根具有生长速度快、激素自主性和遗传稳定等特点，已成为得到植物次生代谢产物的重要途径[4-6]。

除此以外，还可以利用毛状根转基因的特性培育新品种；利用毛状根高度的繁殖潜能制作人工种子；利用毛状根的稳定性进行与根相关的理论研究等[2]。

本研究利用发根农杆菌ATCC15834和C58C1侵染广藿香外植体，研究预培养时间、乙酰丁香酮质量浓度、侵染时间和共培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响，得到诱导广藿香毛状根的最佳条件，为下一步研究提供理论支持。

1．1 广藿香无菌苗的制备
广藿香采于广东药学院药用植物园，经广东药学院中药学院刘基柱副教授鉴定为广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth．。

广藿香叶片外植体先用体积分数75%乙醇浸泡4 s，无菌水冲洗3次；再加入质量分数0．1%升汞溶液，浸泡15 min，无菌水冲洗，重复4次。

灭菌后的广藿香外植体用剪刀割为1 cm2小块并培养在MS(murashige and skoog medium)＋0．1 mg/L NAA (萘乙酸)＋0．2 mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)培养基中。

在光照14 h/d、25℃条件下培养20 d，广藿香外植体形成愈伤组织并产生丛芽。

把丛芽移栽到1/2 MS培养基中进行生根培养，在光照14 h/d、25℃条件下培养得到广
藿香无菌苗。

1．2 发根农杆菌菌株及其培养
发根农杆菌ATCC15834菌株，由广东省林业科学研究院王洪峰研究员惠赠；发
根农杆菌C58C1菌株，由西南大学廖志华教授惠赠。

1．2．1 发根农杆菌的保存发根农杆菌保存于发根农杆菌培养基(YEB，Agrobacterium rhizogene medium)液体培养基中，菌液与灭菌甘油以
7．5∶2．5 (体积比)混合均匀后于-80℃下长期保存。

1．2．2 发根农杆菌的活化发根农杆菌ATCC15834在YEB固体培养基(pH 7．4)上划线培养，发根农杆菌C58C1在含利福平40 mg/L的YEB固体培养基(pH 7．4)上划线培养，28℃黑暗条件下培养48 h，直到长出单菌落。

挑取1个
单菌落接种于YEB液体培养基中，140 r/min、28℃、黑暗条件下振荡培养16 h，此时的YEB液体培养基由接种前透明的黄棕色变成浑浊的淡黄色，证明发根农杆
菌已正常长出。

取10mL已活化的菌液加入20mL已灭菌的YEB液体培养基中(OD600＝0．6)用于侵染广藿香外植体。

1．3 广藿香毛状根的诱导
1．3．1 预培养将广藿香无菌苗叶片外植体于主脉处垂直切割成1 cm2小块，接种在无激素的MS固体培养基上，25℃、黑暗条件下分别预培养1、2、3 d。

1．3．2 侵染将预培养后的外植体移至已经活化好的发根农杆菌悬液中，分别加
入10、15、20 mg/L的乙酰丁香酮溶液，侵染时间分别为10、15、20、25、30 min，期间不断振荡，用无菌滤纸吸取外植体表面多余的菌液。

1．3．3 共培养将侵染后的外植体，接种在无激素的MS培养基中，在25℃、黑暗条件下分别共培养1、2、3 d。

1．3．4 除菌共培养长出菌斑后，用无菌水清洗菌斑并用灭菌后的滤纸把多余的
水吸干，将外植体移至MS＋500 mg/L的头孢噻肟钠培养基中，25℃、14 h/d
散射光下进行培养，每7 d转接1次，反复继代除菌，直到培养基没有菌斑出现。

1．4 广藿香毛状根的鉴别
采用改良 CTAB[7-9]法提取广藿香毛状根总DNA用作PCR扩增的模板，并用相
同的方法提取广藿香无菌苗正常不定根的总DNA，以rol B基因作为PCR扩增的引物。

rol B引物：P1，5′-GCT CTT GCAGT G CTA GAT TT-3′；P2，5′-GAA GGT GCA AGC TAC CTCTC-3′。

PCR扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变
性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环；最后72℃延伸
10min，12℃保存[10]。

PCR产物用质量分数0．8%琼脂糖凝胶电泳和核酸染色
进行分析。

2．1 乙酰丁香酮质量浓度对广藿香毛状根诱导率的影响
乙酰丁香酮是一种酚类化合物，可诱发发根农杆菌内Ri质粒DNA上Vir基因的
活化和高效表达，促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移，从而提高遗传转化效率[11]。

乙酰丁香酮广泛应用于双子叶植物和单子叶植物的发根农杆菌介导的遗传转化中。

适当浓度的乙酰丁香酮可以提高转化率，但浓度过高，会产生毒害作用[12]。

由表1可知，添加不同质量浓度的乙酰丁香酮对广藿香毛状根的诱导率有显著的
影响。

乙酰丁香酮质量浓度为15 mg/L时，发根农杆菌ATCC15834和C58C1
的诱导率均达到最高，分别为68．1%和50．0%。

此时，发根农杆菌能够充分识别宿主细胞，诱导率达到最高。

乙酰丁香酮质量浓度为10 mg/L时，由于质量浓
度较低，发根农杆菌不能充分识别宿主细胞，诱导率仅为58．3%和25．0%。

当乙酰丁香酮质量浓度达到20mg/L时，由于质量浓度较高，产生毒害作用阻碍了
发根农杆菌与宿主细胞的结合，诱导率分别降为13．9%和44．4%。

2．2 预培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响
外植体在侵染前要经过一定时间的预培养，因为外植体产生伤口后在愈合的过程中会形成并释放乙酰丁香酮等物质作为诱导发根农杆菌识别的信号分子。

经过预培养
后，外植体能形成并释放这种信号分子，提高转化率。

同时，由于过敏反应的影响，经发根农杆菌感染的外植体伤口处细胞可能导致褐化，严重影响根的形成以及转化率，预培养也能较好的解决褐化问题[10，13]。

由表2可知，预培养时间为1 d时，发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导广藿香毛状根诱导率分别为75．0%和66．7%；预培养时间增加到2 d时，诱导率达到最高，分别为83．3%和80．5%；预培养时间增加到3 d时，诱导率有明显的下降，分别为66．7%和58．3%。

2．3 侵染时间对广藿香毛状根诱导率的影响
侵染的主要作用是让发根农杆菌与外植体充分接触，并在乙酰丁香酮的作用下，对外植体进行有效的感染。

侵染时间过短，发根农杆菌与外植体没能充分接触，不能对外植体进行有效的感染，会导致诱导率较低。

但侵染时间过长，外植体与发根农杆菌过分接触，在共培养过程中会导致外植体伤口处长满农杆菌，外植体由于农杆菌的毒害作用，最终会导致外植体褐化、软腐和死亡，最终导致诱导率降低；另外，侵染时间过长，导致附着在外植体表面和伤口处的发根农杆菌数量较多，会增加除菌的次数和难度。

由表3可知，侵染时间为25 min时，发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导广藿香毛状根诱导率达到最高，均为80．5%；侵染时间少于25 min时，由于发根农杆菌与外植体不能充分接触，不能进行有效的感染，诱导率低于80．5%；侵染时间为30 min时，由于侵染时间过长导致的毒害作用，诱导率有所下降。

2．4 共培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响
外植体侵染过后要进行一段时间的共培养。

共培养的主要作用是在培养基的作用下，外植体继续与发根农杆菌接触，使T-DNA整合进入植物的核基因组。

随着共培养时间的增加，外植体与发根农杆菌接触并且感染的时间延长，有利于提高诱导率。

但是，共培养时间过长，会导致发根农杆菌过度生长，导致外植体褐化，最终死亡。

发根农杆菌的过度生长还会增加除菌的次数和难度。

由表4可知，共培养时间由1 d增加到2 d，发根农杆菌ATCC15834和C58C1
诱导广藿香毛状根的诱导率均有所提高并达到最高，分别为83．3%和80．5%；共培养时间增加到3 d时，由于培养时间过长，外植体发生褐化，最终死亡，诱
导率均发生明显下降，分别为55．6%和58．3%。

2．5 毛状根的PCR检测
以rol B为引物的广藿香毛状根和广藿香无菌苗不定根的PCR扩增产物结果见图1。

可见，rol B的PCR引物均能从发根农杆菌 ATCC15834和C58C1诱导的广藿香毛状根总DNA中扩增得到1条423 bp的片段，该扩增带的大小与目的基因一致，而从广藿香无菌苗不定根的总DNA中扩增不到任何片段。

由此，可以证明发根农杆菌的含rol B基因的T-DNA部分片段已在广藿香毛状根基因组中整合并得到表达，所得到的不定根为广藿香毛状根。

2．6 广藿香毛状根诱导的最佳条件
综合以上结果，发根农杆菌和C58C1诱导广藿香毛状根的最佳条件均是预培养2 d，乙酰丁香酮质量浓度 15 mg/L，侵染时间 25 min，共培养 2 d；ATCC15834的诱导率最高达83．3%，C58C1的诱导率最高达80．5%。

浸染8 d后，毛状
根最先在横切面叶脉处长出，新长出的毛状根为乳白色，密被白色绒毛，无向地性并且多分枝(图2)。

本文采用共培养法，利用发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导产生广藿香毛状根，结果显示不同菌种、乙酰丁香酮质量浓度、预培养时间、侵染时间和共培养时间都对诱导率有一定程度的影响。

本文采用的发根农杆菌ATCC15834为野生菌种，而发根农杆菌C58C1为人工改造菌种。

结果表明，在相同的转化条件下，发根农杆菌ATCC15834的诱导率高
于发根农杆菌C58C1，这说明不同的菌株具有不同的致根能力，从而对诱导率也
有一定的影响。

施和平等[12]研究表明，乙酰丁香酮能提高发根农杆菌的诱导率和敏感性，这与Bolton[14]和Stachel[15]的研究结果相似。

本文结果也表明，当加入乙酰丁香酮质量浓度为 15 mg/L时，诱导率最高。

有研究认为，乙酰丁香酮能够提高外植体
的诱导率，是因为Vir区的活动产物可以将T-DNA区从T两侧25 bp边缘序列中切割下来，以促进DNA的转移，Vir区的活化被认为是发根农杆菌向植物基因组
转移的一个关键步骤[16]。

预培养时间对诱导率也有较大的影响，发根农杆菌感染外植体后，伤口处的细胞因为过敏性反应而导致褐化，使诱导率下降。

经过2 d预培养，能较好地解决褐化
问题，同时诱导率也达到最高。

这是因为受伤后的外植体经过2 d的预培养后，
伤口部位的细胞开始分裂，处于感受态，发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA能更好
地插入与整合到植物基因组上去，所以诱导率达到最高。

但预培养时间为3 d时，诱导率有所下降，原因可能是预培养时间过长使外植体开始向愈伤组织分化，感受态降低所致。

毛状根的培养已经广泛应用于植物次生代谢产物的生产，并已成为获取植物次生代谢产物的重要途径。

王莉等[17]利用发根农杆菌LBA9402诱导何首乌毛状根并对
其产生的活性成分进行检测，结果表明毛状根培养物中大黄酸的质量分数是原植物的2．85倍。

孙敏等[18]建立长春花毛状根培养体系并对其生物碱质量分数进行
测定，结果表明不同组织中生物碱的质量分数不同，其中以毛状根的质量分数最高(33．157 mg/g)，分别是原植株根、茎、叶、愈伤组织的32．75、49．01、24．50、35．34倍。

本研究已经成功利用发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导广藿香毛状根，下一步将进行毛状根的离体培养、质量分数测定等研究。

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