267例支气管镜检查患儿肺泡灌洗液的病原学分析

267例支气管镜检查患儿肺泡灌洗液的病原学分析
作者：朱勇斌方金涌郑铭城王梵烨
来源：《中国医学创新》2020年第14期
【摘要】目的：探討267例行支气管镜检查患儿的肺泡灌洗液的病原学分布特征。

方法：选取2016年7月-2019年12月于本院行支气管镜检查的患儿267例。

所有患儿均行支气管镜检查并留取肺泡灌洗液，分别做抗酸染色、结核杆菌聚合酶链式反应（PCR）、细菌培养、肺炎支原体及肺炎衣原体RNA-PCR检查。

观察各检查结果、分析致病菌分布及主要致病
菌耐药性。

结果：267例患儿中抗酸染色阳性2例（0.75%）;结核杆菌PCR检测阳性4例（1.50%）;肺炎支原体及肺炎衣原体RNA-PCR阳性79例（29.59%）;细菌培养阳性84例（31.46%）。

84例细菌培养阳性中主要致病菌为肺炎链球菌（38.10%）、流感嗜血杆菌（32.14%）、金黄色葡萄球菌（9.52%）、卡他莫拉菌（5.95%）、肺炎克雷伯菌（4.76%）及大肠埃希菌（3.57%）。

流感嗜血杆菌对复方新诺明与左氧氟沙星耐药性均较高;肺炎克雷伯菌与卡他莫拉菌均对复方新诺明耐药性最高;大肠埃希菌对复方新诺明、头孢他啶及头孢曲松耐药性均较高。

肺炎链球菌对红霉素与四环素耐药性较高;金黄色葡萄球菌对青霉素耐药性最高。

金黄色葡萄球菌多重耐药比例最高。

结论：267例支气管镜检查患儿的肺泡灌洗液病原菌分布广泛，主要致病菌为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及金黄色葡萄球菌，且对多种抗菌药物耐药性不同，其中金黄色葡萄球菌多重耐药较为常见。

【关键词】支气管镜检查肺泡灌洗液病原学
[Abstract] Objective： To investigate the etiological distribution of alveolar lavage fluid in 267 children with bronchoscopy. Method： A total of 267 children underwent bronchoscopy in our hospital from July 2016 to December 2019 were selected. All children were examined by bronchoscopy， and alveolar lavage fluid was collected for acid-fast staining， polymerase chain reaction （PCR） of tuberculosis bacteria， bacterial culture， RNA-PCR of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae. All test results were observed and the distribution and drug resistance of main pathogenic bacteria were analyzed. Result： Among the 267 cases， 2 cases （0.75%） were positive for acid-fast staining. 4 cases （1.50%） were positive for tuberculosis bacteria PCR test. 79 cases （29.59%） were Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae RNA-PCR positive. 84 cases （31.46%） were positive in bacterial culture. The main pathogenic bacteria in the 84 cases with positive in bacterial culture were Streptococcus pneumoniae
（38.10%）， Haemophilus influenzae （32.14%）， Staphylococcus aureus （9.52%），Moraxella cachaca （5.95%）， Klebsiella pneumoniae （4.76%） and Escherichia coli （3.57%）. The drug resistance of Haemophilus influenzae to Compound Sulfamethoxazole and Levofloxacin was high. Both Klebsiella pneumoniae and Moraxella catarrhalis had the highest Resistance to Compound Sulfamethoxazole. Escherichia coli had high resistance to Compound Sulfamethoxazole，Ceftazidine and Ceftriaxone. Streptococcus pneumoniae has high resistance to Erythromycin and Tetracycline. Staphylococcus aureus is the most resistant to Penicillin. Staphylococcus aureus had the highest rate of multiple drug resistance. Conclusion： The pathogenic bacteria of alveolar lavage solution in 267 children with bronchoscopy were widely distributed， and the main pathogenic bacteria were Streptococcus pneumoniae， Haemophilus influenzae and Staphylococcus aureus，they have different resistance to multiple antibacterials， among which multiple drug resistance of Staphylococcus aureus was more common.
支气管镜是临床检查与诊断呼吸系统疾病的内窥镜技术，可用于肺炎、气管异物等，儿童呼吸系统疾病多伴有细菌感染，治疗不及时易引起呼吸衰竭、肺脓肿、胸膜炎等，严重威胁
患儿生命安全[1-2]。

临床多采用抗菌药物治疗，但由于病原菌种类繁多，且具有多重耐药性，临床治疗难度增大[3-4]。

通过对支气管镜检查肺泡灌洗液进行病原菌分析，可快速确定致病菌类型，并分析其耐药性，科学合理选择药物，有助于临床治疗[5-6]。

本研究选取于本院行支气管镜检查的患儿267例，旨在探讨肺泡灌洗液的病原学分布特征，现报道如下。

1 资料与方法
1.1 一般资料选取2016年7月-2019年12月于本院行支气管镜检查的患儿267例，纳入标准：根据临床表现、胸部X线或CT检查确诊为肺炎;经胸部CT检查确诊为气管异物。

排除标准：合并先天性心脏病、营养不良或贫血;合并其他器官系统器质性疾病;其他部位合并细菌感染;支气管镜检查禁忌证;严重气道梗阻;大咯血及严重出血性疾病;肺功能严重减退;心、肾、肝功能严重衰竭;一般情况太差不能耐受检查。

其中男149例，女118例;年龄1个月～13岁，平均（5.24±
2.41）岁;疾病类型：肺炎215例，气管异物52例。

所有患儿家属均知情同意并签署知情同意书，本研究已经医院伦理委员会批准。

1.2 方法
1.2.1 支气管镜检查及肺泡灌洗液采集选择合适的支气管镜，经鼻腔插入，并进行气道局部麻醉，经支气管镜观察黏膜下水肿、明显充血、分泌物潴留、异物位置等;推注5 mL 37 ℃0.9%氯化钠溶液，进行灌洗，然后将灌洗液吸出，重复3次，立即密封保存，置于4 ℃冰箱中保存待测。

1.2.2 肺泡灌洗液分析（1）抗酸染色：将1 mL肺泡灌洗液采用灭菌纱布过滤后除去黏液，于离心管中以2 000 r/min的速度离心15 min，分离沉淀物，制作玻片，滴加石碳酸复红初染，采用3%盐酸乙醇进行脱色30 s～1 min，最终用亚甲蓝复染。

玻片红色者为阳性。

（2）结核杆菌聚合酶链式反应（PCR）：取1 mL肺泡灌洗液，以15 000 r/min的速度离心5 min，分离沉淀物，并直接加入50 µL DNA提取物，混匀后于100 ℃沸水浴10 min后，以15 000 r/min的速度离心5 min，分离得到上清液，取2 µL做PCR反应;采用微电脑自动基因PCR 扩增仪（北京新技术应用研究所，型号：1109型），扩增条件：45 s 93 ℃、45 s 55 ℃、1 min 72 ℃，共35个循环，最终至72 ℃温度下保温5 min;取扩增物10 µL，采用2%琼脂糖凝胶，电泳20～30 min，x于紫外仪观察，在227 bp处若发现橙黄色条带则为阳性。

（3）肺炎支原体及肺炎衣原体RNA-PCR检查：设计引物与探针序列，反应体系为5 µL 10×PCR buffer+4 µL 5 mmol/L dNTP+6 µL 25 mmol/L MgCl2+2 µL 10 pmol/µL MPF/MPB+1.2 µL 10 pmol/µL
MPFB+2 U Taq酶+5 µL模板，并加水至50 µL;反应程序为2 min 93 ℃预变性，5 s 93 ℃变性，45 s 57 ℃退火，重复40个循环，并于末次循环延长7 min，于37 ℃下保温1 s。

>4×105
copy/mL判定为阳性。

（4）细菌培养：将肺泡灌洗液以600 r/min的速度在温度为4 ℃条件下离心5 min，弃去上清液;将标本均质化，采用四分区划线接种于血琼脂培养皿、麦康凯培养皿、巧克力培养皿，于35 ℃下5% CO2培养箱中孵育18～24 h，认真观察细菌生长状态，对
优势菌株进行纯培养，并采用API鉴定系统（法国梅里埃公司）对菌种进行鉴定;并采用K-B 琼脂扩散法进行耐药性试验。

1.3 观察指标（1）肺泡灌洗液检查结果。

（2）肺泡灌洗液致病菌分布。

（3）主要致病菌耐药性分析。

（4）主要致病菌多重耐药性分析。

2 结果
2.1 肺泡灌洗液检查结果 267例患儿中抗酸染色阳性2例（0.75%）;结核杆菌PCR检测阳性4例（1.50%）;肺炎支原体及肺炎衣原体RNA-PCR阳性79例（29.59%）;细菌培养阳性84例（31.46%）。

2.2 肺泡灌洗液致病菌分布 84例细菌培养阳性中肺炎链球菌32例（38.10%），流感嗜血杆菌27例（32.14%），金黄色葡萄球菌8例（9.52%），卡他莫拉菌5例（5.95%），肺炎克雷伯菌4例（4.76%），大肠埃希菌3例（
3.57%），铜绿假单胞菌2例（2.38%），鲍曼不动杆菌1例（1.19%），博德特菌1例（1.19%），产气肠杆菌1例（1.19%）。

主要致病菌为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌。

其中检出流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌及肺炎克雷伯菌的肺泡灌洗液中分别有5、1、2、2例肺炎支原体RNA-PCR阳性。

2.3 主要致病菌耐药性分析流感嗜血杆菌对复方新诺明与左氧氟沙星耐药性均较高;肺炎克雷伯菌与卡他莫拉菌均对复方新诺明耐药性最高;大肠埃希菌对复方新诺明、头孢他啶及头孢曲松耐药性均较高。

肺炎链球菌对红霉素与四环素耐药性均较高;金黄色葡萄球菌对青霉素耐药性最高。

见表1、2。

2.4 主要致病菌多重耐药性分析流感嗜血杆菌多重耐药5例（18.52%）;肺炎克雷伯菌中多重耐药1例（25.00%）;卡他莫拉菌多重耐药2例（40.00%）;大肠埃希氏菌中多重耐药1例（3
3.33%）;肺炎链球菌中多重耐药2例（6.25%）;金黄色葡萄球菌中多重耐藥4例
（50.00%），其中金黄色葡萄球菌多重耐药比例最高。

3 讨论
支气管镜技术可有效清除气道分泌物，防止堵塞气道，缓解缺氧状态，减轻呼吸道感染，同时可对肺泡灌洗液进行病原学分析、细菌培养，有助于确定病原菌，选择合理抗生素[7-9]。

支气管镜是临床检查与诊断呼吸系统疾病的内窥镜技术，可用于肺炎、气管异物等，儿童呼吸系统疾病多伴有细菌感染，治疗不及时易引起呼吸衰竭、肺脓肿、胸膜炎等，严重威胁患儿生命安全[1-2]。

临床多采用抗菌药物治疗，但由于病原菌种类繁多，且具有多重耐药性，
临床治疗难度增大[3-4]。

通过对支气管镜检查肺泡灌洗液进行病原菌分析，可快速确定致病菌类型，并分析其耐药性，科学合理选择药物，有助于临床治疗[5-6]。

本研究选取于本院行支气管镜检查的患儿267例，旨在探讨肺泡灌洗液的病原学分布特征，现报道如下。

1 资料与方法
1.1 一般资料选取2016年7月-2019年12月于本院行支气管镜检查的患儿267例，纳入标准：根据临床表现、胸部X线或CT检查确诊为肺炎;经胸部CT检查确诊为气管异物。

排除标准：合并先天性心脏病、营养不良或贫血;合并其他器官系统器质性疾病;其他部位合并细菌感染;支气管镜检查禁忌证;严重气道梗阻;大咯血及严重出血性疾病;肺功能严重减退;心、肾、肝功能严重衰竭;一般情况太差不能耐受检查。

其中男149例，女118例;年龄1个月～13岁，平均（5.24±
2.41）岁;疾病类型：肺炎215例，气管异物52例。

所有患儿家属均知情同意并签署知情同意书，本研究已经医院伦理委员会批准。

1.2 方法
1.2.1 支气管镜检查及肺泡灌洗液采集选择合适的支气管镜，经鼻腔插入，并进行气道局部麻醉，经支气管镜观察黏膜下水肿、明显充血、分泌物潴留、异物位置等;推注5 mL 37 ℃0.9%氯化钠溶液，进行灌洗，然后将灌洗液吸出，重复3次，立即密封保存，置于4 ℃冰箱中保存待测。

1.2.2 肺泡灌洗液分析（1）抗酸染色：将1 mL肺泡灌洗液采用灭菌纱布过滤后除去黏液，于离心管中以2 000 r/min的速度离心15 min，分离沉淀物，制作玻片，滴加石碳酸复红初染，采用3%盐酸乙醇进行脱色30 s～1 min，最终用亚甲蓝复染。

玻片红色者为阳性。

（2）结核杆菌聚合酶链式反应（PCR）：取1 mL肺泡灌洗液，以15 000 r/min的速度离心5 min，分离沉淀物，并直接加入50 µL DNA提取物，混匀后于100 ℃沸水浴10 min后，以15 000 r/min的速度离心5 min，分离得到上清液，取2 µL做PCR反应;采用微电脑自动基因PCR 扩增仪（北京新技术应用研究所，型号：1109型），扩增条件：45 s 93 ℃、45 s 55 ℃、1 min 72 ℃，共35个循环，最终至72 ℃温度下保温5 min;取扩增物10 µL，采用2%琼脂糖凝胶，电泳20～30 min，x于紫外仪观察，在227 bp处若发现橙黄色条带则为阳性。

（3）肺炎支原体及肺炎衣原体RNA-PCR检查：设计引物与探针序列，反应体系为5 µL 10×PCR buffer+4 µL 5 mmol/L dNTP+6 µL 25 mmol/L MgCl2+2 µL 10 pmol/µL MPF/MPB+1.2 µL 10 pmol/µL
MPFB+2 U Taq酶+5 µL模板，并加水至50 µL;反應程序为2 min 93 ℃预变性，5 s 93 ℃变性，45 s 57 ℃退火，重复40个循环，并于末次循环延长7 min，于37 ℃下保温1 s。

>4×105
copy/mL判定为阳性。

（4）细菌培养：将肺泡灌洗液以600 r/min的速度在温度为4 ℃条件下离心5 min，弃去上清液;将标本均质化，采用四分区划线接种于血琼脂培养皿、麦康凯培养皿、巧克力培养皿，于35 ℃下5% CO2培养箱中孵育18～24 h，认真观察细菌生长状态，对优势菌株进行纯培养，并采用API鉴定系统（法国梅里埃公司）对菌种进行鉴定;并采用K-B 琼脂扩散法进行耐药性试验。

1.3 观察指标（1）肺泡灌洗液检查结果。

（2）肺泡灌洗液致病菌分布。

（3）主要致病菌耐药性分析。

（4）主要致病菌多重耐药性分析。

2 结果
2.1 肺泡灌洗液检查结果 267例患儿中抗酸染色阳性2例（0.75%）;结核杆菌PCR检测阳性4例（1.50%）;肺炎支原体及肺炎衣原体RNA-PCR阳性79例（29.59%）;细菌培养阳性84例（31.46%）。

2.2 肺泡灌洗液致病菌分布 84例细菌培养阳性中肺炎链球菌32例（38.10%），流感嗜血杆菌27例（32.14%），金黄色葡萄球菌8例（9.52%），卡他莫拉菌5例（5.95%），肺炎克雷伯菌4例（4.76%），大肠埃希菌3例（
3.57%），铜绿假单胞菌2例（2.38%），鲍曼不动杆菌1例（1.19%），博德特菌1例（1.19%），产气肠杆菌1例（1.19%）。

主要致病菌为肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌。

其中检出流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌及肺炎克雷伯菌的肺泡灌洗液中分别有5、1、2、2例肺炎支原体RNA-PCR阳性。

2.3 主要致病菌耐药性分析流感嗜血杆菌对复方新诺明与左氧氟沙星耐药性均较高;肺炎克雷伯菌与卡他莫拉菌均对复方新诺明耐药性最高;大肠埃希菌对复方新诺明、头孢他啶及头孢曲松耐药性均较高。

肺炎链球菌对红霉素与四环素耐药性均较高;金黄色葡萄球菌对青霉素耐药性最高。

见表1、2。

2.4 主要致病菌多重耐药性分析流感嗜血杆菌多重耐药5例（18.52%）;肺炎克雷伯菌中多重耐药1例（25.00%）;卡他莫拉菌多重耐药2例（40.00%）;大肠埃希氏菌中多重耐药1例（3
3.33%）;肺炎链球菌中多重耐药2例（6.25%）;金黄色葡萄球菌中多重耐药4例
（50.00%），其中金黄色葡萄球菌多重耐药比例最高。

3 讨论
支气管镜技术可有效清除气道分泌物，防止堵塞气道，缓解缺氧状态，减轻呼吸道感染，同时可对肺泡灌洗液进行病原学分析、细菌培养，有助于确定病原菌，选择合理抗生素[7-9]。