跨膜区

1.膜蛋白有胞外区、跨膜区、胞内区。

跨膜区就是蛋白在细胞膜内的部分。

有的蛋白只有一个跨膜区，有的会有很多个跨膜区。

2，肽段可以既扮演信号肽作用，到了目的地发挥定位锚定作用的。

不是绝对的信号肽最终都要被剪切掉的
3信号肽signal peptide：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端），至少含有一个带正电荷的氨基酸，中部有一高度疏水区以通过细胞膜。

信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译是首先合成的是N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。

信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随机被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。

4.信号肽-指在新合成的多肽链中用于指导蛋白质跨膜运输的氨基酸残基序列
只有通过预测该蛋白有没有信号肽或跨膜域来判断该蛋白是膜蛋白或可溶性蛋白。

5．原核生物的蛋白运输机制
原核生物细胞的结构比较简单，一般由细胞膜、细胞壁及周质空间等构成。

在细胞内合成的蛋白质需要通过转运到细胞的特定位置或分泌到细胞外行使其功能。

目前基于信号肽的蛋白运输途径研究主要有Sec途径和Tat途径。

基于信号肽的运输基本过程如下：核糖体上合成的新生肽，通过胞质中的各种定向伴侣蛋白识别N端信号肽，并引导其运送到膜上的移位机器上；使蛋白插入膜上或跨过膜分泌到膜外，此过程需要ATP或质子动力（pmf）供应能量；最后信号肽被剪除，蛋白折叠成正确构象。

1 信号肽及阻留(retention)信号
此类信号决定新产生的蛋白运送到细胞的特定位置。

1.1 信号肽一般包括三个区域：N域、H域及C域。

现在鉴定的信号肽有：由SPaseI作用的信号肽I（通用的Sec信号肽），由SPaseII作用的信号肽II（脂蛋白的信号肽）及含模体R/K-R-x-#-#（＃为蔬水残基）的Tat信号肽。

1.2 各种运输到细胞特定结构上的蛋白有以下几种阻留信号：⑴跨膜域；⑵脂修饰作用（革兰氏阳性菌的脂蛋白经脂修饰后固定于外膜表面）；⑶细胞壁结合重复序列；⑷共价结合到细胞壁（一般N端有信号肽，C端有LPXGT/NPQTN的模体）。

2 定向（Targeting）
参与把蛋白定向到特定运输机制的伴侣蛋白有以下三种：
2.1 SRP
原核生物SRP为Ffh蛋白和4.5S RNA的复合物，同源于真核生物的SRP54
及7S RNA。

Ffh可分为三个功能域：N端的N域、具GTPase活性的G域，及甲硫氨酸丰富的M域。

N和G域能结合信号肽，而M域能结合RNA。

SRP 与信号肽的高蔬水区相互作用，疏水性越高结合力越强。

SRP的受体为位于细胞膜周边的FtsY。

Ffh、4.5S RNA和FtsY的相互作用大大增加GTPase活性，GTP水解释放的能量使它们牢固结合。

2.2 SecB
SecB是酸性蛋白，分子量为17kDa，一般以四聚体形式存在。

普遍认为SecB 是与原蛋白（preprotein）的成熟域结合。

SecB目前只在革兰氏阴性菌中发现，还未在革兰氏阳性菌发现同源物，但估计有相似功能的蛋白存在。

一般认为SecB是分泌到细胞膜外蛋白的识别分子，而SRP是膜蛋白的识别分子。

2.3 Tat信号识别蛋白
具有Tat信号肽的原蛋白在Tat信号识别辅助因子的帮助下，转运到膜上的Tat 移位机器，它可把已经折叠的完整蛋白运输到细胞外。

目前已经发现Tat途径的生物有：Streptomyces lividan, E.coli, B.subtilis及Zymononas mobilis等。

3 移位机器（Translocation machinery）
3.1 Sec系统
Sec系统包括整合膜蛋白SecYEG及结合其周缘的SecA(具ATPase 活性)，又称移位酶(Translocase)。

还有一些蛋白如SecD、SecF及SecYajC等对维持SecA的活性构象有重要作用。

SecA与原蛋白相结合，SecA水解提供能量使蛋白通过SecYEG通道，SecA 与原蛋白的解离，重复些过程促使蛋白穿过膜运送。

对大片段的蔬水域的移位（>60aa）需要SecA的ATPase活性及SecYEG/SecDFYajc组份。

而小片段蔬水域氨基酸（<40aa）的转运不依赖于SecA，只需要质子动力（pmf）提供能量。

Sec系统是相当保守的分泌机制，在古菌、细菌及真核生物中都存在。

Sec系统即可用于蛋白的跨膜运输，也可用于膜蛋白的插入膜层。

3.2 Tat系统
Tat系统最大的特点是能把折叠后的蛋白运输的膜外。

它即使在细菌中也没有统一性。

在E.coli中，它至少由四个膜蛋白构成：TatA、TatB、TatC及TatE。

前三个编码在同一个操纵子（tatABC），tatE独立位于基因组的不同位置。

TatA与TatE 功能相似，TatB与TatC参与对RR信号的识别。

另外TatB与TatC与多拷贝的TatA形成蛋白的穿越通道。

在B.subtilis中，Tat系统包括两个tatC基因分别为tatCd和tatCy，其每一个前面有tatA基因，分别为tatAd和tatAy。

这两个不同的tatAC基因簇代表有两个不同的Tat移位通道。

Tat系统的能量来源是原子动力（pmf）。

4 正确折叠及质量控制
Sec系统转运的蛋白，在转运后需要折叠成有功能构象，从而避免蛋白酶的降解。

此过程需要一些折叠催化蛋白的参与。

如B.subtilis的PrsA、SpoIIIJ和YqjG；
E.coli的YidC参与膜蛋白的正确折叠。

在细胞膜、细胞壁及环境基质中至少存在27种蛋白酶，用于降解末折叠好的肽链。

如E.coli的HtrA和HtrB蛋白酶。

当分泌蛋白末折叠好，HtrA/B可帮助它们折叠，但如它们已不能正确折叠，就被它们降解。

另一蛋白酶WprA也在分泌蛋白的正确折叠及质量控制中起重要作用。

5 问题
对蛋白的运输有许多问题有待解决。

（There are more questions than answers.）以下举几个例子：
⑴对Sec途径的蛋白是如何从SRP/FtsY移位到SecYEG机器的机制还不了解？
⑵预测Tat途径的RR信号判断准则？现在判断准则准确率偏低。

⑶由于有多个移位系统存在，底物是由特定系统转运，还是多系统同时在起作用？如是特定系统起作用，基因是如何调控而避免多系统间的干扰？
基因的表达是受多种内外因素共同影响和作用的。

某些基因在任何发育阶段或任何种类的细胞中都是永久表达的，而有些基因只在个体发育的某个阶段，或受到某种外界条件的作用时才会表达。

利用分子生物学的手段，人工调控某个基因的开和关，可以从以下几个方面入手。

（1）对基因表达影响最大是启动子，如果想提高某个基因的表达水平，可以将所研究的基因置于强启动子的下游，增强该基因的转录水平。

（2）某些基因的表达可能受到其它基因产物的抑制，可以考虑采用基因敲除的手段，降低抑制蛋白的浓度，来提高目的基因的表达水平。

（3）如果想要人工控制某个基因的开和关，可以利用各种可诱导的启动子，只有在诱导物存在时，基因才被有效的转录。

（4）还可以将目标基因的序列与各种信号序列融合，改变目标蛋白的空间定位等因素，来影响基因的表达水平。

例如，将目标基因的序列与蛋白转运至膜外的
信号融合，有可能将表达的蛋白产物分泌到细胞外，从而无限量的表达目标蛋白。

基因原核表达的详细过程
最佳答案
有三种表达方式，包涵体异源蛋白表达，分泌性表达，融合型异源蛋白表达。

根据对产物的不同需要，或者对表达载体的选择等等因素而选择不同的表达方式！建议你到生物谷这个网站看看，很有用的！
结构预测大概是基于蛋白质序列数据的预测方法中最复杂和技术上最困难的。

从序列充分和准确地预测蛋白质结构的重要性扎根于这样的认识：既然序列可以决定构象，那么多个序列就可能决定同一个构象。

根据结构比序列更加保守，以及蛋白质骨架motif数量有限的想法（Chothia和Lesk，1986；Chothia，1992）说明，没必要仅仅从传统的基于序列比对的方法去寻找蛋白之间的相似性。

序列与结构的关
系问题的根源在于“蛋白质折叠过程”的问题，这是近来一些综述的讨论的焦点（Bryant
蛋白质的疏水性由ProtScale tool (/cgi-bin/protscale.pl)预测；蛋白质的高级结构由SWISS-MODEL (/) 预测；蛋白质在细胞内的定位由在线软件TargetP1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析；蛋白质的功能区由PROSITE tools (/prosite/)预测；采用clustalX1.8软件进行氨基酸多序列比对；用AliBee - Multiple Alignment
（http://www.genebee.msu.ru/services/malign_reduced.html）分析BmTnC与其它无脊椎动物TnC的氨基酸序列相似性；蛋白质的等电点以及分子量由Compute pI/Mw tool （/tools/pi_tool.html）预测[39]。

跨膜区分析
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
点评
进入ExPASy的网站：/tools/protscale.html，选择Hphob. / Kyte & Doolittle 。

将氨基酸序列输入，得到一个图表，其中数值越大的部分表示这段氨基酸序列的疏水性越强，越有可能是跨膜区域，再
与已知的同源蛋白质比较（NCBI中的BLAST）,即可大致预测跨膜结构。

所采用的氨基酸亲水性算法请参见文献：A simple method for displaying the hydropathic character of a protein。

蛋白质序列采用SignalP预测信号肽结果显示，具有明显的信号肽区域，可能定位在内质网膜上；跨膜区预测结果显示，只有通过SignalP预测的信号肽的部分区域是跨膜区，其他部分在膜外
2同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析
33在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：
1.翻译起始位点
现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要
留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子
2.GC含量
表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。

GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等软件进行预测。

3.二级结构
在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译
暂停从而产生不完全的蛋白。

如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄
（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。

4.基因或者蛋白的大小
一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。

蛋白越小，越
容易被降解。

在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。

如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。

对于另一个极端，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签，如6×组氨酸
标签。

对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。

当然表达时要根据
目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部
位抗原性较强。

对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite 或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结
论，如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话还是不妨一试的。

5.亲疏水性
这也是一种经验之谈，相信经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高，如果你要表达一个膜蛋白，那么劝你做好长期抗战的准备吧。

有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 对跨膜区进行预测。

对于自己表达的蛋白有所了解后就可以开始对载体进行选择了，目前商业化的载体基本上包含以下几个元件：
除了上面标出的元件外还需要有复制起点，它对于控制质粒的拷贝数非常重要；另外就是筛选标记了，比如蓝白斑筛选的lacZ，各种抗生素标记。

在以上几个元件中，我们需要注意的是负责调节与启动的元件，也就是调控子和启动子。

其中启动子对于蛋白表达的速度起着举足轻重的作用，它与最终蛋白的表达量、是否可融密不可分。

这里，对于世面上广泛销售的几种原核表达载体使用的启动子进行总结。

启动子来源调控手段（浓度）强度LacUV5 乳糖操纵元lacI/IPTG (0.1-1mM) 强
Trp 色氨酸操纵元trpR 3-β-吲哚丙烯酸强
Tac 结合了色氨酸启动子的-35
序列和乳糖启动子的-10
序列
lacI/IPTG (0.1-1mM) 强
PL λ噬菌体λcI阻遏物/温度强噬菌体T5 T5噬菌体lacI/IPTG (0.1-1mM) 强pBAD 阿拉伯糖操纵元AraBAD/阿拉伯糖严谨
（1μm-10mM）
T7 T7 RNA聚合酶lacI/IPTG (0.1-1mM) 非常强
所有启动子里属T7启动子最强，它可以将大肠杆菌的资源最大程度地调用过来表达外源蛋白。

这样一些难表达的蛋白都可以在pET系统里面表达出来，但是是不是越强就越好呢？如果你需要表达蛋白是可溶的，那么T7启动子就不那么适合了。

较弱的启动子转录速度较慢，这样对于表达可溶、稳定、完整的蛋白比较有利。

Novagen可以说是的pET系统是最王牌的T7启动子表达系统，可是当T7启动子的强启动效应不受欢迎的时候怎么办呢？在这里给读者留个小小的疑问，看看大家有没有仔细看笔者写的Novagen篇。

提示一下，虽然它转录速度快，但是可以控制它的拷贝数，又或者是……利用这些原理Novagen载体也可以毒性高的外源蛋白。

很多标签是为了增加蛋白的可溶性，也有一些是为了方便鉴定表达产物，所以在表达时可以选择加标签。

是否加标签要看个人需要，笔者认为如果是表达一个人家没表达过的蛋白最好还是加标签，这样方便将来鉴定。

如果从经济角度考虑最好加入6×组氨酸标签，
1.就是先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，不要设计重了，否则酶
切时发现怎么老是有预期外的小片段出现。

2.根据载体上的酶切位点设计引物，现在许多类似T载原理的克隆方法也可
以应用到原核表达中了，如果T载克隆方法要定向很多时候要多加4个碱基，设计引物时候可别忘了加。

在设计酶切位点的5’端不要忘了加保护碱基，不同内切酶所需的保护碱基不同，SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ
需要1个，NotⅠ需要2个，HindⅢ最好有3个。

一般情况下，都设计2
个。

3.注意启始密码子和终止密码子的读码框。

如果载体上有ATG可以不另外加
了，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，如果中间含有载体序列，务必确定中间这段序列不会造成你外源序列的移码。

按情况需要，可以加1
到2个碱基在引物中使读码框正确。

有始有终，同样正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。

大部分载体也有终止密码子，如果你对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子，这样万无一失。

4.还有就是设计一对引物需要注意的地方：一对引物之间Tm值相差不宜过
大，能一样最好；一对引物不宜形成发夹结构、互相配对，若配对时最好不要是G-C的结合（可以用软件分析）；3'端以G、C结尾为宜等等。

如
果要详细研究可以看一下PCR技术的相关书籍，很厚。

还有就是记得把上游引物设计成有义链，下游设计成反义链，否则就没有片段出现了。

虽然这是很小的地方，可是经常会被忽略。

5.如果你是进行截取表达，那么除了之前提到的要注意截取亲水区，还有一
点就是对密码子的使用频率进行分析。

如果在大肠杆菌中使用较少的密码子在外源片段中连续出现，还是避开它为上策。

作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。

每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。

宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？
知其然还要知其所以然。

比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。

堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。

大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。

因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。

改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

（已经携带有氯霉素抗性质粒）
当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。

（卡那霉素敏感）。