蛋白羰基化和脂质过氧化的测定

实验单元3：蛋白羰基化和脂质过氧化的测定
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摘要：蛋白羰基化和脂质过氧化指标可以反映鱼类的氧化损伤水平。

本实验对鲫鱼在应激条件下蛋白羰基化水平和脂质过氧化指标进行了测定，以探讨应激对鲫鱼氧化损伤的影响。

实验结果表明，鲫鱼在应激条件下，其羰基浓度为38.255nmol/L，而它的MDA浓度为20.70nmol/mL.这两组指标都显著大于鲫鱼的正常值。

说明应激能够引起鲫鱼的氧化损伤。

关键词：蛋白质羰基化脂质过氧化鲫鱼
【前言】
MDA含量的测定原理：丙二醛（MDA）是膜脂过氧化（LPO）最重要的产物之一。

脂质过氧化物水平是测定MDA的降解产物含量。

MDA能与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，在532nm处有最大吸收。

蛋白羰基化的测定原理：蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后，羰基产物积累，蛋白质功能丧失甚至被降解。

蛋白质羰基含量是蛋白质氧化损伤的敏感指标。

羰基可以2,4-二硝基苯肼（DNPH）反应生成红棕色沉淀2,4-二硝基苯腙，将沉淀用盐酸胍溶解后即可读取370nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。

【材料与方法】
1.1实验用鱼体重为200g左右的鲫鱼
1.2实验仪器与试剂
实验仪器：涡旋振荡器、计时器、高速冷冻离心机、水浴锅、冰箱、酶标仪、制冰机
实验试剂：PBS、10mmol/l的DNPH(4℃，避光保存)，2.5mol/l的HCl，三氯乙酸、无水乙醇、乙酸乙酯、6mol/L盐酸胍、10mM BHT（丁基羟基甲苯）、20%醋酸、1%SDS、TBA（硫代巴比妥酸）、10nM MDA标准品
1.3试验方法：
1.3.1蛋白质羰基化的测定
1.取肝脏上清，用PBS稀释
2.试验管操作：取稀释后的上清50 μL，在上清中加入50 μL的10 mmol/L的DNPH；空白管操作：取稀释后的上清50 μL，在上清中加入50 μL的2.5 mol/L的HCl；将反应体系置于黑暗的冰盒放置1分钟，每隔15分钟漩涡一次
3.反应完毕，加入125μl 50%的TCA溶液来沉淀蛋白质腙衍生物，4℃离心15分钟，弃上清
4.得到的沉淀用乙醇和乙酸乙酯的混合物洗涤，离心后的沉淀用用2ml，6mol/l 盐酸胍溶解，之后12000g离心15分钟，取上清
5.于λ=370nm下测定上清液的吸光值
羰基浓度=[CA/22000]*106*(V final/V sample) CA=实验组吸光值-对照组吸光值
1.3.2脂质过氧化物的测定
1.取0.4ml未离心的匀浆与1.6ml的0.53%TBA混匀，于95℃孵育60min,4℃ 15000g离心15min,取上清
2.于λ=532nm下测定上清液吸光值，对比标准曲线得到测定值
3.标曲制作：将制备好的MDA样品，与0.53%TBA混匀，于95℃孵育60min,4℃ 15000g 离心15min,取上清于λ=532nm下测定上清液吸光值.
4.横坐标为MDA浓度，纵坐标为吸光值，制作标曲，得到MDA浓度与吸光值关系的公式
5.以样品吸光值带入公式，求得样品MDA的浓度CMDA（nmol/mL）.组织中MDA 含量(nmol/mg prot) = [CMDA (nmol/mL)]/ [(Protein mg/ml)]
【实验结果与分析】
2.1蛋白质羰基化的测定结果
吸光度为0.183 对照为0.0778
羰基浓度（nmol/L）=38.255nmol/L
Vfinal / Vsample = 2 / 0.25
样品的吸光度值为0.7633，根据标曲计算其蛋白浓度为0.3643 mg/mL。

C蛋白=105.01 nmol/mL
蛋白质的羰基化水平是评价蛋白质总的氧化程度的常用方法。

蛋白质羰基化是蛋白质的非酶促的不可逆羰基修饰，主要包括：(1) 蛋白质与不同来源的RCS反应，生成蛋白质羰基加合物，(2) 蛋白质本身氧化生成蛋白质羰基衍生物。

鲫鱼肝脏中羰基的正常浓度为4-5nmol/mL，本实验中其浓度显著大于正常浓度，可能是由于鲫鱼的应激反应，应激产生大量H2O2或O2ˉ 自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。

也可能是由于实验中的操作不熟练或者操作失误使其偏离正常值。

2.2脂质过氧化的测定结果
标准曲线如下：
1 2 3 4 5 6 7 8 0.0737 0.0721 0.0707 0.0711 0.0709 0.072 0.0697 0.0722 样品的MDA吸光值
本实验中，样品稀释50倍后，吸光度值的平均值为0.072.利用标准曲线测得的浓度为0.0414 nmol/mL，所以原样品的MDA浓度为20.70nmol/mL.
所谓脂质过氧化(Lipid peroxidation，LP) 是指活性氧、自由基攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸(PUFA)而引起的一系列氧化过程，此过程可产生一系列脂质过氧化物(LPO)，而MDA是自由基引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量可间接反映机体的LP水平。

鲫鱼的肝脏内MDA正常值为（10.56±0.21）nmol/mL,本实验中样品的MDA浓度为20.70nmol/mL，这显著高于正常水平，脂质过氧化水平升高，在研究中已得到了证实，这表明此时机体已处于氧化应激态。

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