人正常腹膜间皮细胞原代培养方法

【文章编号】1007-9424(2010)01-0057-03论著人正常腹膜间皮细胞原代培养方法
王沛靓1,吴晓平2
【摘要】　目的　探讨人正常腹膜间皮细胞原代培养方法。

方法　以胰酶和乙二胺四乙酸磁性搅拌分离人正常腹膜间皮细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态结构和大体生长过程,Calretinin免疫荧光染色鉴定间皮细胞,初步观察传代细胞的贴壁生长情况。

结果　培养第4天细胞贴壁良好,第15天呈铺路石状、生长良好,1个月时细胞密集铺满皿壁;腹膜间皮细胞Calretinin表达都呈阳性;传代腹膜间皮细胞数量显著减少。

结论　磁性搅拌酶分离培养可得到数量多、纯度高的原代人正常腹膜间皮细胞,能够满足一般实验要求。

【关键词】　间皮细胞;腹膜;细胞培养技术
【中图分类号】R329.2 【文献标识码】A
Method for Prim ary Culture of N orm al H uman Peritoneal Mesothelial C ells　W A N G P ei2liang1,W U X iao2ping2.
1.Center of Oncolog y,T he Fi f th A f f iliated Hos pital of X ing j iang Medical Universit y,U rumqi830011,Chi2
na; 2.Health Team of69008Unit,U rumqi830011,China
Corres ponding A uthor:W A N G P ei2liang,E2mail:w pl123456@
【Abstract】　Objective　To develop a reliable method for primary culture of normal human peritoneal mesotheli2 al cells.Methods　Human peritoneal mesothelial cells were dissociated by a mixture of pancreatin and ethylene di2 amine tetraacetic acid with a magnetic puddler.Inverted phase contrast microscope was used to observe the morpho2 logical structures of cells,approximate process of growth.Calretinin was used to identify the mesothelial cells.R e2 sults　On the4th d of culture,mesothelial cells adhered to the culture dish.After day14,mesothelial cells conflu2 enced gradually and grew well like the slabstone.Calretinin was positively expressed by mesothelial cells after5d of cultivation.The mesothelial cell population of subculture was less than that of the primary culture.Conclusion　A reliable method for primary culture of normal human peritoneal mesothelial cells has been successf ully developed,by which sufficient amount of highly purified normal human peritoneal mesothelial cells can be obtained.
【K ey w ords】　Mesothelial cell;Peritoneum;Cell culture technique
人腹膜间皮细胞是构成腹膜的主要细胞群体,并能分泌多种细胞因子,是腹膜原发肿瘤的实质细胞,在腹膜纤维化和腹腔粘连形成中也起着始动和关键作用[123],原代培养的人正常腹膜间皮细胞是进行上述疾病研究的重要工具。

本研究以人手术切除标本为细胞来源,探讨简便、可靠的人正常腹膜间皮细胞原代培养方法,以期在细胞及分子水平上为腹膜疾病的研究提供一个较有价值的体外平台。

1　材料与方法
1.1　主要材料
胎牛血清及Ham’s F12干粉培养基购自G ibco
　【作者单位】1.新疆医科大学第五附属医院肿瘤中心(乌鲁木齐830011);2.69008部队卫生队(乌鲁木齐830011)
　【通讯作者】王沛靓,E2mail:wpl123456@
　【作者简介】王沛靓(1976年-),女,新疆乌鲁木齐市人,硕士研究生,住院医师,主要从事肿瘤放疗临床与基础研究。

公司;胰酶购自Amresco公司;D2Hank液购自HyClone公司;DA PI封片剂购自美国Vector La2 boratories公司;Calretinin兔抗体及罗丹明标记山羊抗兔Ig G购自北京中杉金桥公司;塑料培养板及培养皿购自Corning公司。

1.2　溶液配制
标本运输液:D2Hank液含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml氟康唑;胰蛋白酶消化液:胰酶0.5g和乙二胺四乙酸(ED TA)0.04g 分别溶于100ml PBS中,再将两者充分混匀,形成含0.25%胰酶和0.02%ED TA的消化液,过滤除菌后备用;Ham’s F12培养液[3]由含10%胎牛血清的双蒸水配制,不含抗生素、胰岛素、氢化可的松和各种促生长物质。

1.3　细胞分离和培养
于新疆医科大学第五附属医院手术室取腹膜切除标本的正常部分,约1cm×1cm大小,标本放入
D 2Hank 运输液保存。

在运输液中摘除血管及脂肪组织,清洗后剪碎,移入100ml 葡萄糖瓶中,加胰蛋白酶消化液20～30ml ,分2组:①37℃磁性搅拌
20min ,搅拌速度稍高于磁性搅拌器最低限;②37℃单纯摇床摇荡20min 。

分别低速离心(1000r/min ,r =20cm )10min ,弃上清,PBS 重悬,重复低速离心1次,含10%胎牛血清培养液重悬后接种于塑料培养板或培养皿,做免疫荧光实验的接种于覆盖玻片的培养皿。

3～5d 后弃上清,PBS 洗去漂浮的细胞和组织,加入培养液常规培养,3～7d 换液1次[4,5]。

1.4　C alretinin 免疫荧光染色鉴定间皮细胞 细胞培养5d 后PBS 洗涤,4%多聚甲醛固定,Triton X 2100透化处理,Calretinin 一抗工作液4℃
孵育15h ,荧光罗丹明标记羊抗兔二抗37℃孵育40min ,DA PI 封片剂封片后4℃避光保存,莱卡TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜观察。

以PBS 代替一抗做阴性对照。

1.5　细胞形态观察
用奥林巴斯CK 40型倒置相差显微镜对细胞进行动态观察,第1次换液后每天观察一次并照相记录。

1.6　细胞传代 磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞培养1个月后,
PBS 洗涤,加入胰蛋白酶消化液,37℃孵育至细胞
脱壁,加入10%胎牛血清培养液中止消化并重悬,接种于塑料培养皿。

2　结果
2.1　细胞培养形态观察结果
磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞,倒置相差显微镜观察第1天细胞体积较小,圆形,多数呈悬浮状
态;第4天多数细胞贴壁,但尚未分裂铺展;第15天细胞生长良好,铺满培养皿壁,多呈圆形铺路石状;1个月时细胞密集铺满培养皿壁。

在生长过程中,大量细胞呈串珠状相连,逐渐铺展(图1)。

37℃摇荡酶分离腹膜间皮细胞仅有零星细胞贴壁,生长缓慢。

2种方法整个培养过程中都可观察到少量成纤维细胞,后一种方法成纤维细胞数相对较多,多分布于腹膜间皮细胞空白处,少数夹杂于间皮细胞中。

2.2　C alretinin 免疫荧光染色结果磁性搅拌酶分离和摇荡酶分离人正常腹膜间皮细胞的Calretinin 表达均呈阳性,胞浆和胞核中均可见罗丹明红色荧光,但胞浆中表达较强,围绕于核周围,荧光强度较均匀;胞核中表达相对较弱,多呈团块状。

阴性对照的间皮细胞胞浆和胞核中都不见荧光。

见图2。

图1　磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞原代培养形态观察结果(倒置显微镜　×100)。

1A :培养第4天细胞贴壁,尚未完全分裂铺展;1B :培养1个月后细胞成铺路石状铺满培养皿壁;1C:细胞成串珠状相连 图2　示人正常腹膜间皮细胞Calretinin 表达(激光共聚焦显微镜)。

2A :磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞;2B :磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞阴性对照;2C:摇荡酶分离腹膜间皮细胞;2D :摇荡酶分离腹膜间皮细胞阴性对照
Fig.1　Morphologic result s of primary cultures of human peritoneal mesot helial cells dissociated by trypsinase wit h magnetic puddler (IPCM ×100).1A :Day 4after culture ,cells adhered but did not spread completely ;1B :One mont h after culture ,a confluent monolayer of slabstone 2like cells was obtained ;1C :The bead 2like morphology cells were observed Fig.2　The expression of calretinin in human perito 2neal mesot helial cells (CL SM ).2A :The cells dissociated by trypsinase wit h magnetic puddler ;2B :Negative control to t he cells dissociated by trypsinase wit h magnetic puddler ;2C :The cells dissociated by trypsinase wit h a simple rocking bed ;2D :Negative control to t he cells dissocia 2ted by trypsinase wit h a simple rocking bed
2.3　细胞传代结果
磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞培养1个月后传代,细胞贴壁良好,但培养2d后成纤维细胞明显增多,甚至成优势生长,间皮细胞数量较原代培养时明显减少。

3　讨论
近年来,随着对腹膜肿瘤、腹透后腹膜纤维化及腹腔粘连形成机理研究的增多[6,7],腹膜间皮细胞原代培养方法的探讨也增多,主要有胰蛋白酶消化法、网膜碎片直接种植法、腹水培养法、胶原酶消化法、腹腔灌注消化液法等[4,8214],这些方法各有利弊,产量、纯度、重复性、简易性、费用等不尽相同,依取材难易、培养目的等实际情况都被采用,但比较经典和常用的还是胰蛋白酶消化法。

本研究所采用的方法属于胰蛋白酶消化法,但与以往操作又不完全相同,最大的差别是细胞分离采用了磁性搅拌器搅拌分离,与传统操作比较,这种方法腹膜间皮细胞获得量大,培养过程中细胞纯度高。

在其他条件完全相同的情况下,磁性搅拌酶分离腹膜间皮细胞第4天多数细胞贴壁,第15天细胞生长良好,1个月时细胞密集成铺路石状铺满培养皿壁,非磁性搅拌器搅拌分离法仅有零星细胞贴壁且生长缓慢。

前一种分离方法腹膜间皮细胞中成纤维细胞极少,腹膜间皮细胞Calretinin蛋白表达阳性,Calretinin蛋白是间皮细胞的一个重要标志,临床可用于诊断间皮瘤。

而后一种方法成纤维细胞相对较多,特别在间皮细胞稀疏处。

所以,磁性搅拌酶分离法得到的人正常腹膜间皮细胞从数量和纯度上能满足一般的实验要求,且培养液中未加任何抗生素、生长因子、细胞基质,不会干扰实验结果。

在分离培养过程中应注意以下几个问题:①无菌操作。

从取标本开始,标本瓶要在手术室内密封,回实验室后要浸入运输液中摘除血管及脂肪组织,稍洗涤。

②快速处理标本。

用眼科剪尽快剪碎标本,接种时重悬液中可以有大量细碎组织及血细胞, 3～5d换液后便可得到清晰的正常间皮细胞。

③剪碎分离时磁性转子低速旋转。

1cm×1cm大小标本搅拌速度稍高于磁性搅拌器最低限即可。

④注意接种密度。

同一些上皮细胞一样,合适的接种密度可以使细胞生长速度快,细胞纯度增高;相反,接种密度过低,细胞不但铺展速度慢,而且在间皮细胞空白处很早就出现成纤维细胞。

通常1cm×1cm大小标本可接种于2个35mm塑料培养皿中。

⑤换液不宜过于频繁。

腹膜间皮细胞生长习性完全不同于上皮细胞,而类似于成纤维细胞,生长缓慢,生命力也较强,换液间隔较常规培养延长,既利于细胞安静生长,又减少污染机会,在培养过程中曾20d没有换液,细胞仍生长良好。

进一步说明腹膜间皮细胞生长缓慢,可以延长换液时间。

人正常腹膜间皮细胞可以传代,但传代2d后有大量成纤维细胞生长,甚至成优势生长。

因此,从现有结果来看,延续实验不宜采用传代腹膜间皮细胞作为研究平台。

4　参考文献
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(2009207205收稿,2009210218修回)
(本文编辑孟文建)。