肉毒毒素基本知识
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肉毒毒素介绍
主要内容
肉毒毒素介绍
保妥适配制注意事项
历史发展
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结构
单击此处添加文本具体内容
作用机理
单击此处添加文本具体内容
药理 毒理 免疫原性
单击此处添加文本具体内容
目前商用的肉毒素及保妥适的特点
单击此处添加文本具体内容
什么是肉毒毒素? (肉毒神经毒素,肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素 )
皱眉纹标准剂量： 20U
保妥适®是局部用药
Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088
本研究的临床相关性有待明确
BOTOX®
弥散
效应
剂量
靶肌肉
邻近 肌肉
全身 作用
在治疗剂量内， 血液中检测不到肉毒素
肉毒素结构
前体毒素－900 KD 复合体 HA (Haemagglutinin) ,血凝素 NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋白
Reljia 试验结果
组1：25 U
组2：50U
组3：100 U
组4：150 U
疼痛和斜颈均无变化
斜颈无改变，但疼痛改善
疼痛改善1周后改善 斜颈2周后改善
结论： 保妥适可能有直接止痛效果，独立于其肌肉放松的效果
还阻滞其它物质的释放
SNAP-25
Ca++ Channels
Syntaxin
VAMP/ synaptobrevin
COOH
NH2
NH2
COOH
S-S
SS
Heavy Chain 重链
LC 轻链
150 KD
100 KD
50 KD
与靶位受体结合，促轻链内转
以锌肽链内切酶实施毒效
血凝素维持毒素三维结构稳定 影响结构因素： 热变性，碱性条件 空气/液体介面形成的气泡改变毒素形态，氮气/二氧化碳 稀释至过低浓度
作用机理(1)
DAS 评分方法
注射前
注射后
4分 严重弱化
0分 没变化
1分
2分
3分
用DAS测试小鼠肌肉弱化程度
0
1
2
3
4
0
4
8
12
16
20
0.5% BSA/Saline
.5u/kg (BoTx-A)
1u/kg
5u/kg
10u/kg
30u/kg
Digit Abduction Score
Mean ± SEM (n=10)
说明书： 本品的推荐剂量不可与其他肉毒梭菌毒素制剂的剂量互换。
文献上关于保妥适®的推荐剂量只适用于保妥适®， 对其他A型肉毒毒素不一定适用。
有效性的判断
局部有效性： 用DAS 评估 Digit Abduction Score 小鼠后趾外展评分方法 测试去神经化程度 局部肌肉注射的 ED50 半数有效量 DAS =2 时剂量
Please see Important Safety Information on slide 12.
BOTOX® Injection
Please see Important Safety Information on slide 12.
Inject at a 45° angle to skin surface
*注意： 非线性关系
局部和全身效应：弥散系数
K. Roger Aoki, PhD, Pharmacology of Botulinum Toxins
全 身 效 应
弥散
平 均 DAS 峰 值
毒素剂量, U/kg
达到最大 局部效果
弥散系数 (Diffusion Margin)
=
Atr thresh
Use a surgical pen and standard ruler to mark injection points: 1½ to 2 cm apart Staggered to allow for ring effect of intradermal injections
Count injection points and allocate recommended dosage of BOTOX® solution per injection, based on: 50 Units per axilla
脑瘫
眼睑痉挛*
神经肌肉
自主神经
感觉神经
膀胱
美容*
保妥适全球被批准情况
83个国家，22个适应症
保妥适®在中国的适应症
1998： 眼睑痉挛、面肌痉挛及相关 局灶性肌张力障碍。
2009年2月： 暂时改善65岁及65岁以下成人因皱眉肌/或降眉间肌活动引起的中度至重度皱眉纹。
Perform the Iodine Starch Test
03
04
05
06
不是个合适的生化武器
高纯度的保妥适®治疗不会导致肉毒中毒
每瓶保妥适® 只含100单位 纯化的肉毒素
肉毒毒素导致的一种全身性的反应
肉毒中毒:
局部注射治疗,直接注射在相关肌肉或腺体上 如剂量合适,很少弥散到其它肌肉 治疗剂量与中毒剂量相差很远
保妥适是高度纯化的肉毒素
致死剂量 (70kg 人) 静脉注射 3,000 单位 要导致死亡,需静脉注射 30瓶以上保妥适® 每瓶保妥适含蛋白5ng 1ng = 10-9 g
生物制品的特定
没有仿制品的概念 肉毒毒素是一类产品名，而非通用名 与疫苗接近 产品本身没有专利，生产工艺专利 用单位（Unit）衡量，单位之间不能换算 很容易得到，很难提纯，很难恒定
FDA 最新通告：
历史和发展（1）
1920s
1944
1946
首次沉淀纯化A型肉毒毒素（H.Sommer)
Schantz 开始研究其特性和应用
兰州BTX-A (n=6)
5.7 ± 0.3
Dysport® (n=3)
16.2 ± 1.1
Myobloc™ (n=5)
23.4 ± 1.4
平均DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度)峰值效应曲线
*p < 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test
对疼痛的作用
Glutameat
cGRP
Substance P
作用机理的临床意义
躯体运动神经元 Α-梭外肌-收缩减少 γ – 梭内肌-传入信号减弱 内脏运动神经元- 内脏平滑肌收缩减少 腺体分泌减少 痛觉感受器 肉毒毒素阻滞位点
BOTOX® 临床应用范围日益扩大
失驰缓症
多汗症*
偏头痛
斜视*
痉挛性斜颈*
是肉毒梭菌( Clostridium botulinum)在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素 一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒素的细菌属同一科 在合适的条件下（10oC，无氧，合适的酸度）孢子生长为梭菌 细菌继续产生大量的孢子或自溶将毒素释放出来 不同的菌株(如Hall株,Bean株)产生不同亚型的神经毒素(分为 A、B、C、D、E、F、G等7个抗原型), 其中A型毒力最强 是导致肉毒中毒(Botulism)的原因
a permanent tattoo effect
单位的定义
01
有效性
02
安全性
03
抗原性
04
基本药理
单位的定义
生物制品用单位(Unit),而不用mg衡量 肉毒素单位定义: 1 Unit (单位) = i.p. LD50 小鼠腹膜内注射配制后的本品溶液的半数致死量(LD50) 不同厂家的肉毒素单位（Unit）彼此不能互换 有各自的实验和检测方法
Scott 获得FDA批准在人身上进行试验（眼睑痉挛，半面肌痉挛）
1950’s
1950’s – 1960’s
V Brook 证实A型肉毒毒素阻断乙酰胆碱释放
纯化过程优化 (Duff and Schantz)
MF Brint 用于治疗眼睑痉挛，半面肌痉挛 斜颈，喉部肌张力障碍，书写痉挛等…
历史和发展（3）
轻链水解特异 SNARE蛋白
轻链
SNARE 复合 体不能形成
膜没有 融合
神经递质 不能释放
肉毒素以胞饮方式进入
重链
B,D,F,G型
A,C,E 型
C 型
尚有其它作用机理 – 如疼痛
作用机理录像
作用过程
主要步骤： 结合（Binding） ： A型肉毒素的重链与运动神经终板上的乙酰胆碱受体高亲和结合 摄入（Internalization)： 毒素通过受体介导的胞饮作用进入细胞内。这一过程中神经末端细胞膜将毒素包裹，在神经末梢内形成毒素囊泡。摄入后，肉毒素的轻链从囊泡中被释放到胞浆内，现在已非常明确轻链具有阻断神经递质的功能结构。 阻断 （Blocking) A型肉毒素通过裂解胆碱能神经末梢突触前膜内SNAP-25而阻滞乙酰胆碱的释放。SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合并释放乙酰胆碱的必需蛋白质。这过程阻止肌肉收缩，但并不影响神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维传导。 神经芽生 (Sprouting) 充分证据表明肉毒素介导的神经肌肉接头的化学去神经化作用并没有影响终板区域，也没有影响轴突的生长，芽神经与终板结合连接释放神经递质 神经再生 “芽生”是暂时的，会逐渐消退，原始的神经肌肉接头恢复功能。
Lammanna首次分离出A型肉毒素结晶
1820
1895
Justinus Kerner 推测“腊肠毒” 作用原理，并提出应用于治疗的可能性
E Van Ermengem 分离肉毒梭状芽胞杆菌
历史和发展（2）
1960’s – 1970’s
1978
1984
Schantz 和Scott 继续研究
Scott在猴子身上进行A型肉毒毒素治疗斜视的试验
注射后天数
严重
正常
DAS 量效关系 （对数值）
平 均 DAS 峰 值
毒素剂量, U/kg
此图可用来比较不同产品的效力
保妥适® 效力最高的肉毒素
J. Francis Poster #51, Toxins 2005
Toxins
ED50 ± SEM (U/kg)
保妥适X® (n=6)
3.4 ± 0.3
ED50
Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量
作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用 在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的 临近肌肉 全身
不同产品的弥散性不一样
Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088
正常神经递质释放过程
神经肌肉接头
神经末梢
肌肉细胞
肌肉细胞
肌肉纤维收缩
突触间隙
乙酰胆碱
乙酰胆碱受体
神经终点
SNARE 蛋白
突触囊泡蛋白
突触融合蛋白
突触相关蛋白
突触囊泡
SNARE 蛋白 形成复合体
突触融合 复合体
囊泡和终板 膜融合
神经递质释放
作用机理(2)
当有神经肉毒素时
肌肉细胞
肌肉纤维瘫痪
肉毒素
2006年6月GSK在中国上市保妥适®
2002
FDA批准美容适应症
83个国家 22个适应症
2月11日获中国SFDA批准用于皱眉纹
温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解
常规的消毒方法既能使其灭活
人与人不能传播
雾状的毒素，很不稳定
氯， 加热85C5分钟
存在肉毒素抗毒素 （但对已经存在的症状无效）
01
02
1998
2006
2009
FDA 批准低蛋白剂型 每100单位 5ng
1989
1997
Allergan获得FDA批准以 BOTOX 商品名上市；用于治疗眼睑痉挛，斜视和第VII神经功能紊乱
Allergan 公司获得对A型肉毒素的所用权
1998年6月中国药品监督管理局批准保妥适®用于治疗眼睑痉挛、面肌痉挛及相关病灶肌张力障碍。
A depth of approximately 2 mm
Bevel side up to minimize leakage and ensure injections remain intradermal
Be sure not to inject directly on ink mark to avoid
乙酰胆碱的作用
颅神经
骶神经
胸腰神经
节前 神经节 节后
CNS
副交感神经
交感神经
交感神经
交感神经
躯体运动神经
Ach
Ach
Ach
Ach
Ach
Ach
Ach
N
M
交感神经
NE
N
N
N
N
Ach
M
D
N
Epi
Ach
胆碱能性神经： 运动神经 全部植物神经节前纤维 大多数副交感神经节后纤维 支配小汗腺和血管肌肉的交感神经节后纤维
疼痛作用的发现-Rejia 试验
基本设计： 36个病人有疼痛性斜颈 随机，双盲分成4组 25U,50U,100U,及 150U 一个治疗周期，每周观察直至12周 观察指标： 主要终点： TWSTRS ( Totonto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale) 疼痛频率 疼痛强度 次要终点 医生及病人 全球评定量表（Global Assessment Scale)
主要内容
肉毒毒素介绍
保妥适配制注意事项
历史发展
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结构
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作用机理
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药理 毒理 免疫原性
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目前商用的肉毒素及保妥适的特点
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什么是肉毒毒素? (肉毒神经毒素,肉毒杆菌神经毒素，肉毒梭菌毒素 )
皱眉纹标准剂量： 20U
保妥适®是局部用药
Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088
本研究的临床相关性有待明确
BOTOX®
弥散
效应
剂量
靶肌肉
邻近 肌肉
全身 作用
在治疗剂量内， 血液中检测不到肉毒素
肉毒素结构
前体毒素－900 KD 复合体 HA (Haemagglutinin) ,血凝素 NTNH non-toxic non-haemagglutinins 非血凝素蛋白
Reljia 试验结果
组1：25 U
组2：50U
组3：100 U
组4：150 U
疼痛和斜颈均无变化
斜颈无改变，但疼痛改善
疼痛改善1周后改善 斜颈2周后改善
结论： 保妥适可能有直接止痛效果，独立于其肌肉放松的效果
还阻滞其它物质的释放
SNAP-25
Ca++ Channels
Syntaxin
VAMP/ synaptobrevin
COOH
NH2
NH2
COOH
S-S
SS
Heavy Chain 重链
LC 轻链
150 KD
100 KD
50 KD
与靶位受体结合，促轻链内转
以锌肽链内切酶实施毒效
血凝素维持毒素三维结构稳定 影响结构因素： 热变性，碱性条件 空气/液体介面形成的气泡改变毒素形态，氮气/二氧化碳 稀释至过低浓度
作用机理(1)
DAS 评分方法
注射前
注射后
4分 严重弱化
0分 没变化
1分
2分
3分
用DAS测试小鼠肌肉弱化程度
0
1
2
3
4
0
4
8
12
16
20
0.5% BSA/Saline
.5u/kg (BoTx-A)
1u/kg
5u/kg
10u/kg
30u/kg
Digit Abduction Score
Mean ± SEM (n=10)
说明书： 本品的推荐剂量不可与其他肉毒梭菌毒素制剂的剂量互换。
文献上关于保妥适®的推荐剂量只适用于保妥适®， 对其他A型肉毒毒素不一定适用。
有效性的判断
局部有效性： 用DAS 评估 Digit Abduction Score 小鼠后趾外展评分方法 测试去神经化程度 局部肌肉注射的 ED50 半数有效量 DAS =2 时剂量
Please see Important Safety Information on slide 12.
BOTOX® Injection
Please see Important Safety Information on slide 12.
Inject at a 45° angle to skin surface
*注意： 非线性关系
局部和全身效应：弥散系数
K. Roger Aoki, PhD, Pharmacology of Botulinum Toxins
全 身 效 应
弥散
平 均 DAS 峰 值
毒素剂量, U/kg
达到最大 局部效果
弥散系数 (Diffusion Margin)
=
Atr thresh
Use a surgical pen and standard ruler to mark injection points: 1½ to 2 cm apart Staggered to allow for ring effect of intradermal injections
Count injection points and allocate recommended dosage of BOTOX® solution per injection, based on: 50 Units per axilla
脑瘫
眼睑痉挛*
神经肌肉
自主神经
感觉神经
膀胱
美容*
保妥适全球被批准情况
83个国家，22个适应症
保妥适®在中国的适应症
1998： 眼睑痉挛、面肌痉挛及相关 局灶性肌张力障碍。
2009年2月： 暂时改善65岁及65岁以下成人因皱眉肌/或降眉间肌活动引起的中度至重度皱眉纹。
Perform the Iodine Starch Test
03
04
05
06
不是个合适的生化武器
高纯度的保妥适®治疗不会导致肉毒中毒
每瓶保妥适® 只含100单位 纯化的肉毒素
肉毒毒素导致的一种全身性的反应
肉毒中毒:
局部注射治疗,直接注射在相关肌肉或腺体上 如剂量合适,很少弥散到其它肌肉 治疗剂量与中毒剂量相差很远
保妥适是高度纯化的肉毒素
致死剂量 (70kg 人) 静脉注射 3,000 单位 要导致死亡,需静脉注射 30瓶以上保妥适® 每瓶保妥适含蛋白5ng 1ng = 10-9 g
生物制品的特定
没有仿制品的概念 肉毒毒素是一类产品名，而非通用名 与疫苗接近 产品本身没有专利，生产工艺专利 用单位（Unit）衡量，单位之间不能换算 很容易得到，很难提纯，很难恒定
FDA 最新通告：
历史和发展（1）
1920s
1944
1946
首次沉淀纯化A型肉毒毒素（H.Sommer)
Schantz 开始研究其特性和应用
兰州BTX-A (n=6)
5.7 ± 0.3
Dysport® (n=3)
16.2 ± 1.1
Myobloc™ (n=5)
23.4 ± 1.4
平均DAS (小鼠后趾外展肌评分方法测试去神经化程度)峰值效应曲线
*p < 0.05 one-way ANOVA and post hoc Tukey t-test
对疼痛的作用
Glutameat
cGRP
Substance P
作用机理的临床意义
躯体运动神经元 Α-梭外肌-收缩减少 γ – 梭内肌-传入信号减弱 内脏运动神经元- 内脏平滑肌收缩减少 腺体分泌减少 痛觉感受器 肉毒毒素阻滞位点
BOTOX® 临床应用范围日益扩大
失驰缓症
多汗症*
偏头痛
斜视*
痉挛性斜颈*
是肉毒梭菌( Clostridium botulinum)在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素 一种厌氧菌，其孢子常规在土壤中，与产生破伤风毒素的细菌属同一科 在合适的条件下（10oC，无氧，合适的酸度）孢子生长为梭菌 细菌继续产生大量的孢子或自溶将毒素释放出来 不同的菌株(如Hall株,Bean株)产生不同亚型的神经毒素(分为 A、B、C、D、E、F、G等7个抗原型), 其中A型毒力最强 是导致肉毒中毒(Botulism)的原因
a permanent tattoo effect
单位的定义
01
有效性
02
安全性
03
抗原性
04
基本药理
单位的定义
生物制品用单位(Unit),而不用mg衡量 肉毒素单位定义: 1 Unit (单位) = i.p. LD50 小鼠腹膜内注射配制后的本品溶液的半数致死量(LD50) 不同厂家的肉毒素单位（Unit）彼此不能互换 有各自的实验和检测方法
Scott 获得FDA批准在人身上进行试验（眼睑痉挛，半面肌痉挛）
1950’s
1950’s – 1960’s
V Brook 证实A型肉毒毒素阻断乙酰胆碱释放
纯化过程优化 (Duff and Schantz)
MF Brint 用于治疗眼睑痉挛，半面肌痉挛 斜颈，喉部肌张力障碍，书写痉挛等…
历史和发展（3）
轻链水解特异 SNARE蛋白
轻链
SNARE 复合 体不能形成
膜没有 融合
神经递质 不能释放
肉毒素以胞饮方式进入
重链
B,D,F,G型
A,C,E 型
C 型
尚有其它作用机理 – 如疼痛
作用机理录像
作用过程
主要步骤： 结合（Binding） ： A型肉毒素的重链与运动神经终板上的乙酰胆碱受体高亲和结合 摄入（Internalization)： 毒素通过受体介导的胞饮作用进入细胞内。这一过程中神经末端细胞膜将毒素包裹，在神经末梢内形成毒素囊泡。摄入后，肉毒素的轻链从囊泡中被释放到胞浆内，现在已非常明确轻链具有阻断神经递质的功能结构。 阻断 （Blocking) A型肉毒素通过裂解胆碱能神经末梢突触前膜内SNAP-25而阻滞乙酰胆碱的释放。SNAP-25是一种在细胞膜上促使神经末梢内囊泡与突触前膜顺利融合并释放乙酰胆碱的必需蛋白质。这过程阻止肌肉收缩，但并不影响神经递质的分泌和储存，也不影响电信号沿神经纤维传导。 神经芽生 (Sprouting) 充分证据表明肉毒素介导的神经肌肉接头的化学去神经化作用并没有影响终板区域，也没有影响轴突的生长，芽神经与终板结合连接释放神经递质 神经再生 “芽生”是暂时的，会逐渐消退，原始的神经肌肉接头恢复功能。
Lammanna首次分离出A型肉毒素结晶
1820
1895
Justinus Kerner 推测“腊肠毒” 作用原理，并提出应用于治疗的可能性
E Van Ermengem 分离肉毒梭状芽胞杆菌
历史和发展（2）
1960’s – 1970’s
1978
1984
Schantz 和Scott 继续研究
Scott在猴子身上进行A型肉毒毒素治疗斜视的试验
注射后天数
严重
正常
DAS 量效关系 （对数值）
平 均 DAS 峰 值
毒素剂量, U/kg
此图可用来比较不同产品的效力
保妥适® 效力最高的肉毒素
J. Francis Poster #51, Toxins 2005
Toxins
ED50 ± SEM (U/kg)
保妥适X® (n=6)
3.4 ± 0.3
ED50
Atr thresh: 注射腓肠肌后引起同侧四头肌萎缩的最低剂量
作为局部注射药，肉毒素一般没有口服药所具有的全身作用 在临床使用中，很多副反应是由于药物不适当弥散造成的 临近肌肉 全身
不同产品的弥散性不一样
Aoki, Neurology 2003; 60(5 Suppl 1):A212-A213 ABS-P03. 088
正常神经递质释放过程
神经肌肉接头
神经末梢
肌肉细胞
肌肉细胞
肌肉纤维收缩
突触间隙
乙酰胆碱
乙酰胆碱受体
神经终点
SNARE 蛋白
突触囊泡蛋白
突触融合蛋白
突触相关蛋白
突触囊泡
SNARE 蛋白 形成复合体
突触融合 复合体
囊泡和终板 膜融合
神经递质释放
作用机理(2)
当有神经肉毒素时
肌肉细胞
肌肉纤维瘫痪
肉毒素
2006年6月GSK在中国上市保妥适®
2002
FDA批准美容适应症
83个国家 22个适应症
2月11日获中国SFDA批准用于皱眉纹
温度、湿度，空气和光照都会使毒素降解
常规的消毒方法既能使其灭活
人与人不能传播
雾状的毒素，很不稳定
氯， 加热85C5分钟
存在肉毒素抗毒素 （但对已经存在的症状无效）
01
02
1998
2006
2009
FDA 批准低蛋白剂型 每100单位 5ng
1989
1997
Allergan获得FDA批准以 BOTOX 商品名上市；用于治疗眼睑痉挛，斜视和第VII神经功能紊乱
Allergan 公司获得对A型肉毒素的所用权
1998年6月中国药品监督管理局批准保妥适®用于治疗眼睑痉挛、面肌痉挛及相关病灶肌张力障碍。
A depth of approximately 2 mm
Bevel side up to minimize leakage and ensure injections remain intradermal
Be sure not to inject directly on ink mark to avoid
乙酰胆碱的作用
颅神经
骶神经
胸腰神经
节前 神经节 节后
CNS
副交感神经
交感神经
交感神经
交感神经
躯体运动神经
Ach
Ach
Ach
Ach
Ach
Ach
Ach
N
M
交感神经
NE
N
N
N
N
Ach
M
D
N
Epi
Ach
胆碱能性神经： 运动神经 全部植物神经节前纤维 大多数副交感神经节后纤维 支配小汗腺和血管肌肉的交感神经节后纤维
疼痛作用的发现-Rejia 试验
基本设计： 36个病人有疼痛性斜颈 随机，双盲分成4组 25U,50U,100U,及 150U 一个治疗周期，每周观察直至12周 观察指标： 主要终点： TWSTRS ( Totonto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale) 疼痛频率 疼痛强度 次要终点 医生及病人 全球评定量表（Global Assessment Scale)