添加甘油对北里链霉菌ZY150504发酵生产吉他霉素的影响

添加甘油对北里链霉菌ZY150504发酵生产吉他霉素的影响郑钱丽;高淑红;张静;赵军磊;赵臻;高攀
【摘要】本文研究了添加甘油对北里链霉菌ZY150504发酵吉他霉素效价和A5组分的影响.考察了甘油的添加浓度和添加时间对发酵液效价的影响,发现通过添加甘油,提高发酵培养基中的起始甘油浓度,有效地提高了吉他霉素的效价.发酵结束时发酵液的效价为10847U/mL,比对照提高了47％,比文献报道效价提高了27％;吉他霉素A5组分含量提高17％;而A4组分含量降低了36％.进一步研究发酵过程发现添加甘油之后,发酵过程中条件组的脂肪酶活力较高,油脂利用较快,丙酸含量增加,乙酸浓度较低,促进了吉他霉素的生物合成,提高了A5组分的含量.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2016(041)008
【总页数】5页(P594-598)
【关键词】甘油;吉他霉素;组分;北里链霉菌
【作者】郑钱丽;高淑红;张静;赵军磊;赵臻;高攀
【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;天方药业有限公司,驻马店463000;天方药业有限公司,驻马店463000;天方药业有限公司,驻马店463000;天方药业有限公司,驻马店463000
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
吉他霉素(kitasamycin)又名柱晶白霉素(leucomycin，LM)、北里霉素，是由北里链霉菌(Streptomyces kitasatoensis)合成的16元大环内酯类抗生素[1]。

吉他霉素由内酯环、碳霉糖和碳霉胺糖3部分构成，其中含有A1、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A13、U、V等组分，各组分区别在于十六元内酯环C-3位和碳霉糖C-4位上所连的酰基基团不同[2]。

其中，A5是主要活性组分。

发酵液中有效组分的含量直接影响产品的质量。

因此，在发酵过程中提高吉他霉素的产量以及增加其主要组分A5组分的含量很重要。

吉他霉素合成代谢途径表明，在吉他霉素生物合成过程中，先进行碳霉糖C-4位上的酰化，内酯环C-3位上的乙酰化是在吉他霉素生物合成的最后阶段完成[3]。

吉他霉素A4组分是A5组分内酯环C-3位上乙酰化得到的，减弱内酯环C-3位上乙酰化有助于吉他霉素A5组分的积累。

研究发现，葡萄糖与内酯环C-3位上乙酰化有关，会诱导乙酰化酶的产生[4-5]。

吉他霉素发酵培养基的碳源有淀粉和豆油。

淀粉水解产生葡萄糖，豆油水解产生甘油和脂肪酸，各自通过糖酵解、TCA循环、脂肪酸氧化等途径参与吉他霉素前体的形成。

甘油常作为共基质[6]，在甘油激酶、甘油磷酸脱氢酶和丙糖磷酸异构酶的作用下，转化为甘油醛-3-磷酸，进入糖酵解途径并最终生成丙酮酸，其理论反应途径比葡萄糖更短，转化效率更高。

Glycerol carbonate还可作为可溶性酶体系的溶剂，使得脂肪酶活力更高、活性更稳定[7]。

在谷氨酸发酵时添加甘油，发现甘油并不是作为碳源，而是作为保护剂增强细胞对环境变化的抵抗能力和维持关键酶的活性，提高发酵的稳定性[8]。

为了考察添加甘油对北里链霉菌ZY130504发酵吉他霉素效价和组分的影响，本研究优化了甘油添加浓度和添加时间，并研究添加甘油对发酵过程的影响，发现添加甘油对吉他霉素发酵效价的提高和有效组分的优化有较大影响。

1.1 材料
1.1.1 菌种
北里链霉菌ZY130504和枯草芽孢杆菌，均为本实验室保藏菌种。

1.1.2 培养基
种子培养基(g/L)：淀粉20，黄豆饼粉15，葡萄糖10，酵母膏3，氯化钠4，碳酸钙3等，消前pH 7.2～7.4。

发酵培养基(g/L)：淀粉20，黄豆饼粉20，葡萄糖10，丝素粉11，豆油40，碳酸钙3等，消前pH 7.2～7.4。

1.2 实验方法
1.2.1 培养方法
种子培养：挖取新鲜斜面(1cm×1cm)接到装有50 mL种子培养基的500mL摇瓶中，28.0℃±1.0℃培养30h，摇床转速在(240±20)r/min，相对湿度在
50%±10%。

发酵培养：按4%接种量(V/V)将种子液接入装有培养基的500mL发酵摇瓶中，28.0℃±1.0℃培养112h，摇床转速在(240±20)r/min，相对湿度在50%±10%。

1.2.2 分析方法
菌体PMV的测定：取10mL发酵液3000r/min离心10min，读取沉淀物体积即为菌体PWV。

总糖的测定：费林法测定总糖含量。

葡萄糖的测定：用生物传感分析仪测定。

发酵液中残油含量测定：正己烷萃取法。

甘油含量测定：高碘酸氧化法[9]。

脂肪酶活力测定：对硝基苯酚法。

以对硝基苯酚酯作为底物，经脂肪酶水解产生对硝基苯酚，在405nm处显色测定对硝基苯酚吸光值的增加。

酶活力单位定义为检测条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需的脂肪酶的量[10]。

有机酸含量的测定：采用高效液相色谱法。

HPLC色谱条件：色谱柱AgilentZorbox SBAq(250mm×4.6mm，5μm)，流动相10mmol/L硫酸；检测波长为210nm，柱温为30℃，流速为0.6mL/min，进样量为10μL。

吉他霉素生物效价的测定：管碟法[11]。

按照《中国药典》2010版附录ⅪA依法
测定，试验用菌为枯草芽孢杆菌，用微生物自动测量分析仪测量并计算结果。

吉他霉素发酵组分含量的测定：高效液相色谱法。

HPLC色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax 300SBC18(150mm×4.6mm，5μm)，流动相0.1mol/L乙酸铵(磷酸调节pH4.5)-甲醇-乙腈(55-40-5)；检测波长为232nm，柱温为60℃，流
速为0.5mL/min，进样量为10μL。

2.1 甘油的添加浓度对吉他霉素发酵的影响
为了考察甘油对吉他霉素发酵的影响，以不添加甘油作为对照，条件组分别添加0.2%、0.5%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%的甘油，研究添加不同浓度的甘油对
吉他霉素发酵的影响，结果如图1所示。

由图1可知，在发酵培养基中添加一定浓度的甘油，A5组分含量都有明显的增长，而A4组分含量有明显的下降，整体组分较好。

当添加1.2%甘油时，吉他霉素的
效价最高，可达10847U/mL，比对照提高了47%，与2014年文献[12]公布的用豆油发酵的最高效价8514U/mL，提高了27%；添加更高浓度的甘油，效价开始降低，说明高浓度的甘油对吉他霉素生物合成有抑制作用。

2.2 甘油的添加时间对吉他霉素发酵的影响
为了考察甘油的添加时间对吉他霉素发酵的影响，在吉他霉素摇床发酵过程的不同时间点添加1.2%的甘油，研究甘油的添加时间对吉他霉素发酵的影响，结果如图
2所示。

由图2可知，在0和17h添加甘油，对吉他霉素合成有明显的促进作用；发酵中
后期41h之后添加甘油对发酵有明显的抑制作用；添加时间越晚，吉他霉素发酵
效价越低。

这可能是由于甘油是速效碳源，在发酵中后期添加甘油会使得中后期次级代谢过程，转回到初级代谢过程，改变了吉他霉素的代谢途径，对吉他霉素生物合成造成影响。

除在89h外，其他时间加入甘油，A5组分都有所增加；甘油添加时间越早，A5
组分提高越明显；在0h添加甘油，A5组分含量最高，比对照提高了17%。

A4
组分，在发酵前期0和17h添加甘油，有明显的降低；而在中后期添加甘油，A4组分与对照相比没有明显降低。

因此在吉他霉素摇床发酵时，甘油最佳的添加时间为0h，甘油的最佳添加浓度为
1.2%，此时发酵液中甘油的起始浓度由原来的10.5mg/mL变为23.2mg/mL。

2.3 发酵过程研究
以0h添加1.2%的甘油作为条件组，以不加甘油为对照组，在摇床上每隔12h取样测定各种参数，并且每个时间点条件组和对照组各取3组平行进行测定，取平
均值，所以误差不超过10%。

2.3.1 添加甘油对pH和效价的影响
在整个摇床发酵过程中，对照组和条件组的菌浓变化基本相同。

从图3可知，条件组的最终效价为11254U/mL，比对照组(6995U/mL)提高了39%。

添加甘油，在发酵27h之后pH小幅下降，并直到发酵放瓶时，一直保持
在5.0～6.0之间。

50h条件组的起步效价为1793U/mL，且整个产素期吉他霉素效价增长速度较快。

在对照组，27h之后pH略有回升，至50h开始缓慢下降；
87h时pH仍保持在6.0以上；99h之后，pH开始快速下降至6.0以下，吉他霉
素效价快速增长，但最终放瓶效价仍比条件组低。

2.3.2 添加甘油对甘油和糖利用的影响
从图4可知，发酵前27h以内对照组和条件组的甘油消耗速率相似。

添加甘油之后，在发酵27～51h之间，甘油利用最快，甘油消耗速率接近于0.56mg/mL·h，
甘油被迅速消耗之后趋于平衡，保持在5.0mg/mL左右，比对照略高。

实验还发现，添加甘油降低了发酵27h之前的葡萄糖消耗速率；39h之后发酵液中的葡萄
糖含量一直比对照略高，但是总糖一直比对照高，糖消耗速率比对照慢。

在添加甘油后，甘油利用速率变快，葡萄糖消耗速率减慢，可能原因是甘油直接被北里链霉菌利用，产生甘油-3-磷酸，进入糖酵解途径，比葡萄糖进入糖酵解途径
更短，从而促进了吉他霉素的生物合成。

2.3.3 添加甘油对脂肪酶活力、油脂消耗和丙酸合成的影响
从图5可知，添加甘油之后，脂肪酶活力在发酵39h以后都比对照组高，油脂利
用更快，猜测添加甘油增加了发酵液中豆油的溶解度，使得发酵液中的脂肪酶与豆油接触更好。

底物的诱导作用也可能促进了脂肪酶活力的表达，加速了油脂的分解与利用。

油脂分解产生更多的小分子脂肪酸，乙酸、丙酸、丁酸等是吉他霉素合成的前体，前体供给的增加促进了吉他霉素的生物合成。

在发酵培养基中添加甘油之后，发酵液中丁酸的含量变化不大，乙酸的含量有所下降(图6)，丙酸含量增加(图5)。

丙
酸主要来源于糖酵解途径、氨基酸降解脂肪酸分解。

在发酵过程中添加甘油，甘油代谢进入糖酵解途径，生成更多的丙酮酸，丙酮酸氧化生成丙酸[13]，使得丙酸含量较高，特别是发酵75h之后，条件组的丙酸含量是对照组的2～4倍。

2.3.4 添加甘油对吉他霉素组分的影响
由图6可知，在发酵51h时条件组与对照组的A5/ A4组分含量相差不大；至
75h时两组的A5含量都逐渐上升，A4含量变化不大。

发酵后期(87h之后)对照
组中A4含量逐渐上升，A5含量下降；而在添加甘油的条件组中，A5和A4含量几乎不变。

放瓶时条件组的A5组分为61%，比对照组高27%；A4组分为11%，比对照低52%。

吉他霉素A4组分是A5组分内酯环C-3位上乙酰化得到的。

在发酵培养基中添加
甘油之后，发酵过程中发现乙酸含量一直低于对照组，可能添加甘油之后减缓了内酯环C-3位上的乙酰化，降低了A5组分的乙酰化作用，吉他霉素A4组分含量下降，A5组分含量提高。

本文主要考察了添加甘油对北里链霉菌ZY130504发酵生产吉他霉素的影响。

结
果表明在发酵开始时，在发酵培养基中添加1.2%的甘油，甘油起始浓度从原来10.5mg/mL变为23.2mg/mL，吉他霉素产量增加明显，可达10847U/mL；吉
他霉素A5组分含量为64%，比对照组高17%；而A4组分含量比对照低了36%，效价和组分整体都较好。

研究整个发酵过程发现，添加甘油之后，发酵过程中条件组的脂肪酶活力较高，油脂利用较快，有机酸含量较多，特别是丙酸含量增加，促进了吉他霉素的生物合成。

而较低的乙酸浓度，可能减缓了内酯环C-3位上的乙酰化，降低了A4组分的含量，提高了A5组分的含量。

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