生物技术药物的制造进程

杂蛋白变性，然后过CM-22和DEAE-22离子交换层析，分段
洗脱，超滤浓缩，再过干扰素单抗亲和层析柱，可纯化2500
倍，纯度达95%以下，经分装，冻干即成。
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二、生物技术药品质量保证要素
（一）药典（pharmacopia）
（二）质量保证体系
药品的质量保证起始于新药的研究与开发 ，并贯穿于生产销售和
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注射用水制造流程图
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（五）生产许可
1、工艺规程 阐述生产一定量的某一药品所需原料、辅料、包装材料、半成品和成品
的质量标准及批生产处方，生产规程，作业方法，中间控制方法和注意 事项的一套文件。 2药品的批准文件 新药证书或药品批准书 药品生产许可证
纯化方法对重组蛋白的化学性质、构象等都有重要影响，合理的纯化方法至少要 包括以下几方面:
纯化步骤少
产物的纯度、活性及其他检测指标达到规定要求
得率高
在确定纯化工艺时要多借鉴最新的分离纯化技术并计算相关技术成本,要考虑到将 来生产工艺放大以后的可行性，在研制阶段所得出的实验数据,要为将来的生产放 大提供充分的依据。 在现实中,有许多厂家，企业拿到某种产品的新药证书和生 产批文,但市场上迟迟见不到该品种上市的现象比比皆是，除生产厂家有自己的产 品上市销售安排之外,生产工艺先天不足也是一个主要的原因。
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NDV-F（新城疫弱毒株）诱生人脐血干细胞，提取mRNA，
反转录成DNA，构建质粒，经克隆筛选获得有目的基因的质
粒pBV867,转化到大肠干菌中，干扰素基因在启动子控制下
转录。发酵，收集对数期生长的的pBV867工程菌，用溶菌酶
或高压匀浆破菌后，裂解液用85%硫酸胺盐析，酸化使70%
4.药品经销商，GSP(Good supplying practice 医药商品质量管理规范)
5.医院，消费者，GUP(Good use practice 医药商品使用管理规范)
6.中药栽培企业，GAP（Good Agriculrure Practice 中草药栽培规范）
7. 医院药房和药剂科，GPP（Good Pharmacy Practice 医院药房质量 管理规范）
合体
包涵体的分离及其中重组蛋白质的纯化通常包括以下步
骤 （1）.菌体细胞的收集与破碎；
（2）. 包涵体的分离、洗涤与溶解；
（3）.变性蛋白质的纯化；
（4）.重组蛋白质的复性。
2） 分泌型表达产物的分离纯化
分泌型的表达产物通常体积大、浓度低、必需在纯化以
前进行浓缩处理，尽快缩小溶液体积。 超滤是目前最常用的蛋
第三章 生物技术药物的 制造进程
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第一节生物技术药物生产简介
一、一般生产过程
生物技术药物的生产可分为上游和下游
两个阶段。
上游阶段是指构建稳定高效表达的工程细
胞(或工程菌)，主要包括目的基因的分离， 工程菌的构建与筛选；
下游阶段是指工程菌的大规模培养，一
直到产品的分离纯化、制剂、质量控制等一
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2、选择基因载体构建重组NDA 在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带
有选择标记的载体分子进行酶切连接，获得重组DNA分子。 常见基因载体有质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、 病毒载体等。 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞（也称 寄主细胞），并与之同步增殖。被导入的受体细胞分为两大 类：第一类为原核细胞，目前常用的有大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌、链霉菌等。第二类为真核细胞，其中真核微生物主要 有酵母、丝状真菌等，此外为动物细胞、植物细胞。另外也 可以导入动物和植物体。 导入的方法主要有转化、转染等方法，此外也可采用电融合、 显微注射和基因枪等技术。
使用的各个环节。
1.研究与开发者，临床前研究，GLP(good laboratory practice 药品非 临床研究质量规范)
2.临床研究单位，GCP(Good clinical practice 药品临床试验管理规范)
3.药品生产企业 ，GMP(Good Manyfacturing practice 药品生产质量 管理规范)
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4、生产过程控制方法及标准
为保证药品批间质量的均一性，进行生产过程控制 或中间品的质量控制，目的是监控生产全程，及时 查明中间品和产品变异质量的偏差。
5、原、辅料质量标准、
如：糊精,乳糖,淀粉明胶,乙醇,甘油,壳聚糖,甲壳素,聚维酮,活性碳,凡士 林,丙二醇,包衣粉,硬脂酸镁,聚乙二醇,空心胶囊,微粉硅胶,纤维素系列等
→分离纯化表达产物→除菌过滤→半成品检定→制剂→成品检定→包装 ．
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1、获得具有遗传信息的目的基因 从复杂的生物体基因组中采用不同方法分离并获得带有目的基因的 DNA片段。获得目的基因主要通过下述方法。 (1)用限制性内切酶法直接分离目的基因 质粒和病毒等DNA分子小的几kb,大的几百kb,编码的基因较少,直接用 限制性内切酶法获得目的基因 （2）人工合成目的基因 人工合成目的基因主要采用下列3种途径。 ①酶促方法 经提取获得编码基因的信息RNA（mRNA），在逆转录 酶的作用下，合成互补DNA（cDNA）链，在DNA聚合酶I的作用下， 加工成为双链DNA分子。 ②化学合成法 前提是必须已知基因的核苷酸序列，化学合成的DNA 片段一般较短，需要用DNA连接酶进行连接，从而获得较长的DNA片 段。 ③聚合酶链反应（PCR） 先决条件是必须已知基因的核苷酸序列， 根据序列设计引物，进行PCR扩增获得的目的基因。也可以采用反转录 PCR（RT-PCR）等方法，直接从富含目的基因的实验材料提取RNA， 在逆转录酶的作用下获得cDNA，以此为模板进行PCR 批准文号：药品批准文号为：国药准字＋1位字母＋8位数字；化学药品
使用字母“H”，中药使用字母“Z”，生物制品使用字母“S”，进口分包 装药品使用字母“J”等。数字第1、2位为原批准文号的来源代码，。第3、 4位为换发批准文号之年公元年号的后两位数字。数字第5至8位为顺序号。 3、生产方法(manufacturing method) 生产某一药品标准批量的基本方法、流程及原则要求。注意生产处方与 终产品处方的区别。
胞外分泌型表达：通过信号肽携带等操作，是最优选的
方法。
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1） 细胞内不溶性表达产物包涵体的分离纯化
包涵体是在大肠杆菌高表达系统中, 某些目的蛋白质以
不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物。包涵体可以较容易
地与胞内可溶性蛋白杂质分离，但因包涵体中重组蛋白质产物
经过了一个变性复性过程，较易形成蛋白产物的错误折叠和聚
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4、鉴定带有目的基因的克隆 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的 寄主细胞。为了挑选出重组子，针对不同基因的表达产物， 采用各自特有的测活方法确定其生物活性；也可以采用酶联 免疫方法确定其抗原性；以目的基因为探针，通过DNA杂 交方法可以直接确定重组子。 5、目的基因的扩增及获得目的产物 培养克隆有目的基因的重组子，提取获得扩增的目的基因以 进行深入的研究。 将目的基因克隆至适当的表达载体，采用特定的方法将基因 导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得活性表达，从而 得到人类需要的特定目的物质
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6、大规模培养工程菌 基因工程菌的培养过程主要包括： ①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、 培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对 受体菌的影响； ②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案 及顺序。由 于工程菌生长和异源基因表达之间有着较大的差异，各培养 参数在全过程中必须分段控制。 在不同的发酵条件下，工程菌的代谢途径也不一样，因而 对下游的纯化工艺会造成不同的影响。因此在高表达高密度 发酵的前提下，还要尽量建立有利于纯化的发酵工艺，以提 高产品的纯度及改善其性质。
9、变更控制和登记
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第二节生物技术药物来源与质量控制
一、生物技术药物表达系统
（一）原核生物细胞
1、大肠杆菌
A.表达方式
细胞内不溶性表达：包含体
胞内可溶性表达：分离纯化较困难
细胞周质表达：用渗透振扰法分离产物,可避免细胞内 蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除 监测：空气悬浮粒子标准监测
微生物限度监测
人员监测
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(四)制药用水系统
纯化水和注射用水系统 纯化水：为原水经离子交换法、反渗透法、蒸馏法
或其他适宜方法制得的供药用的水，不含任何附加 剂，可作为配制普通药物制剂用的溶剂或试验用水， 不能于注射剂的配制。 注射用水：为纯化水经蒸馏所得的水，应符合细菌 内毒素实验要求，可作配制注射剂用的溶剂。
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分离纯化的一般流程
8、剂型，配方，规格和稳定性 结合我国现阶段物流运输的实际情况,最好选择冻干剂型,冻干 剂型易于运输和保存,但在冻干过程中产品易发生聚集,生物活 性可能会受到影响，而液体制剂在临床使用上比较方便， 合 适的产品配方对产品的活性保持非常重要。根据剂型的特点和 现有的同类产品的辅料,找出自己最合适的,并进行稳定性考察。 选择合适的产品规格,对于产品的临床使用和上市销售非常重 要，有些产品临床使用剂量大,而小规格的产品造成终端用户 使用极不方便。根据药效学研究的结果,参照将来临床使用的 剂量来确定合理的制剂规格，如果所开发的产品国外已经上市, 应尽可能参照已上市产品的规格和剂型。 稳定性考察是对产品的剂型、配方及储存条件确定的综合评 价。特别是基因工程药物,稳定的生物活性是其安全有效的保 证，应在充分研究同类或相近产品的稳定性考察温度和本品的 生物化学性质的基础上,制订好考察周期,根据质检规程的要求 进行检测为产品的有效期确定提供科学依据。
白质溶液浓缩方法。其优点是不发生相变化，也不需要加入化
学试剂，能耗低。
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3） 大肠杆菌细胞内可溶性表达产物的分离纯化 某些细胞因子（如白细胞介素2、11）和硫氧还原蛋白
6、质量标准
成品质量标准分为外控质量标准和内控质量标准。
外控标准就是产品的注册标准或法定标准(如药典标 准、部颁标准)、
内控标准是企业控制标准，一般检查项目多于外控
标准或项目的限定指标严于外控标准或二者兼有。
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7、包装材料质量标准
8、稳定性考察
药品稳定性是指药品保持其物理、化学、 生物学稳定性及其疗效和安全性的能力， 确保药品在有效期内的安全性与有效性。 包括三部分内容：影响因素试验 ，加速 试验和长期留样考察。
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7、根据研制产品的物理化学性质,选择合理的分离纯化方法
基因工程产物分离纯化的费用约占整个生产费用的80%～90%，因此，该工艺过 程理所当然地应受到高度的重视。然而基因工程产物的分离纯化过程与传统发酵 产物相比，具有下列特点：（1）产物大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎， 增加了很多困难；（2）产物浓度较低、杂质多、而最后成品要求达到的纯度高， 故提取较困难，且收率低，常需好几步操作并需采用高分辨力的精制方法；（3） 产物都是大分子蛋白质，通常不稳定，遇热、极端pH、有机溶剂和剪切力等易引 起失活。各种产物表达形式所采用的分离纯化方法不同。
系列工艺过程。
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获得目的的基因 ↓
构建重组体 ↓
构建基因工程菌(或工程细胞) ↓
大规模培养工程菌 ↓
产物分离纯化 ↓
除菌过滤 ↓
半成品检定 ↓
制剂 ↓
成品检定 ↓
包装
生物技术药物生产一般过程
生物技术药物制造过程的主要程序是：获得目的基因→构建DNA重组体→将重组
体导入宿主细胞→鉴定筛选阳性克隆→构建基因工程菌（或工程细胞）→培养工程菌
QA（Quality Assurance 质量保证）——GMP——QC（Quality
Control质量控制）
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(三)生产车间与设备
制药车间设备包括生产专门设施区、质量控制区 和贮存区。
洁净区是安装有制药设备并受严格环境洁净控制 的区域，注射剂或无菌生物药物必须在洁净区生 产，洁净区需特殊设计以防止产品受到污染，常 见的污染物有微生物与颗粒物质。