微生物学实验二 培养基配制、相关器皿的包扎及

三、培养基配制的步骤
1、计算 按照配方要求（一般为1000ml的 按照配方要求（一般为1000ml的 和实际配制培养基的量， 量）和实际配制培养基的量，计算出 不同组分需要的量。 不同组分需要的量。
2、称量、溶解 称量、 按培养基配方在三角瓶中先加水（ 按培养基配方在三角瓶中先加水（如 无加入后大幅度改变原体积的物质， 无加入后大幅度改变原体积的物质，可 以把水加足）， ），然后依次准确称取各药 以把水加足），然后依次准确称取各药 品并分别逐一溶解于其中（ 品并分别逐一溶解于其中（琼脂需加热 溶解），最后补充水到所需体积。 ），最后补充水到所需体积 溶解），最后补充水到所需体积。 注意： （注意：各成分之间发生化学反应产生不 溶的沉淀；培养基成分中有影响pH试纸 溶的沉淀；培养基成分中有影响pH试纸 的显色的物质，调pH值后再加入） 的显色的物质， pH值后再加入） 值后再加入
3、物理化学条件适宜的说明
pH值： pH值 渗透压和水活度（ 渗透压和水活度（aw）： 在同温同压下， 在同温同压下，某溶液的蒸气压 与纯水蒸气压（ 之比。 （P）与纯水蒸气压（P0）之比。 氧化还原电位： 氧化还原电位： 针对厌氧菌分离特别需要注意 半胱氨酸、巯基乙醇酸钠等） （半胱氨酸、巯基乙醇酸钠等）
膜过滤装置
不耐热的液体培养基的除（灭）菌 不耐热的液体培养基的除（
膜过滤装置
细 菌 截 留 于 膜 过 滤 器 滤 膜 表 面
二、加热灭菌的方法
1、干热灭菌法： 干热灭菌法： 火焰灼烧法 烘箱内热空气灭菌法 2、湿热灭菌（消毒）法： 湿热灭菌（消毒） 常压下：巴氏消毒法；煮沸消毒法； 常压下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；间 歇灭菌法。 歇灭菌法。 加压下：常规加压灭法； 加压下：常规加压灭法；连续加压灭菌 法。
3、马丁氏培养基 （分离、培养真菌用） 分离、培养真菌用） ——500ml/ ——500ml/组 500ml/组 KH2PO4 1g MgSO4·7H2O 0.5 g 5g 蛋白胨 10 g 葡萄糖 20 g 琼脂 1000ml 水 pH 6.0
配好后在此培养基中，按1000ml加入1%孟加拉红水 加入1% 配好后在此培养基中， 1000ml加入 孟加拉红水 溶液3.3 ml。 溶液3.3 ml。 临用时以无菌操作在100ml培养基中加入 的链霉 培养基中加入1% 临用时以无菌操作在100ml培养基中加入1%的链霉 0.3ml，使其终浓度为30ug/ml。 素0.3ml，使其终浓度为30ug/ml。
注意！！ 注意！！
标记（记号笔） 标记（记号笔）写在器皿壁或外 包装纸上（ 包装纸上（如还需要高压蒸汽灭 只能写在外包装纸上）； 菌，只能写在外包装纸上）； 不要直接写在瓶（ 不要直接写在瓶（管）塞或包装 棉布上。 棉布上。
内 容 二
消 毒 与 灭 菌
一、消毒、灭菌的定义和常见方法 消毒、
消毒：指消灭病原菌和有害微生物的营养体。 消毒：指消灭病原菌和有害微生物的营养体。 灭菌：指杀灭一切微生物的营养体、 灭菌：指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和 孢子。 孢子。 常见方法： 常见方法： 加热法： 加热法：包括干热灭菌和湿热灭菌 过滤除菌 辐射灭菌 化学药品灭菌
六、无菌水的准备
经灭菌处理后的蒸馏水或自来水。 经灭菌处理后的蒸馏水或自来水。 1、量取90mL蒸馏水在250mL三角瓶， 量取90mL蒸馏水在 蒸馏水在250mL三角瓶 三角瓶， 内加玻珠 1瓶 2、吸取9mL蒸馏水在18*180试管中 6支 吸取9mL蒸馏水在 蒸馏水在18*180试管中 包扎后灭菌。 包扎后灭菌。
四、高压蒸汽灭菌锅的 结构及使用
高压蒸汽灭菌的原理
高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽（潜热） 高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽（潜热） 对物品、器械、药液等灭菌的设备， 对物品、器械、药液等灭菌的设备，适用于科学 研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用—— 研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用—— 造成蛋白质等变性失活。 造成蛋白质等变性失活。 潜热是指当 是指当1g100℃的水蒸汽变成1g100℃水时， 潜热是指当1g100℃的水蒸汽变成1g100℃水时， 释放出2255.2J 2255.2J（ =4.184焦耳 的热量。 焦耳） 释放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的热量。 各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程 度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、 度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、 自动排放冷空气、程序化显示） 自动排放冷空气、程序化显示） 饱和蒸汽压压力指示温度 直接利用温度探测器指示温度
培养基配制中的2 五、培养基配制中的2点说明
1、量微的药品（天平无法称量），以 量微的药品（天平无法称量）， ），以 溶液形式加入（ 溶液形式加入（先配制成一定浓度的溶 液）； 2、粘稠的药品和物品，称好后与称量 粘稠的药品和物品， 纸一起放入溶液中， 纸一起放入溶液中，待药品溶解后取出 称量纸；或利用减称量法完成（ 称量纸；或利用减称量法完成（从总药 品量中以减量称出所需要的量）。 品量中以减量称出所需要的量）。
实验二
培养基配制、 培养基配制、相关器皿 的包扎及消毒灭菌
本次实验的目的和要求
明确培养基制备原理 通过对培养基的配制，掌握配制培 通过对培养基的配制， 养基的一般方法和步骤 了解消毒、灭菌的原理及方法， 了解消毒、灭菌的原理及方法，掌 握干热灭菌和高压蒸汽灭菌 学习并练习相关器皿的包扎方法
内容一
四、培养基配制过程中需注意的事 项
先加水——易产生沉淀 先加水——易产生沉淀 逐一溶解——易产生沉淀 逐一溶解——易产生沉淀 调节pH——容易忘记 调节pH——容易忘记 加塞灭菌（或过滤除菌）——即时灭菌 加塞灭菌（或过滤除菌）——即时灭菌 煮过或加热过培养基，注意水的蒸发—— 煮过或加热过培养基，注意水的蒸发—— 补足
三、干热灭菌
火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种方 法。 通常所说的干热灭菌是在电热干燥 箱内利用高温干燥空气 160~170℃ 进行灭菌， （160~170℃）进行灭菌，此法适 用于玻璃器皿（吸管、培养皿等） 用于玻璃器皿（吸管、培养皿等） 的灭菌。 的灭菌。
干热灭菌需要注意的事项
不能对塑料器皿和培养基灭菌； 不能对塑料器皿和培养基灭菌； 控制好温度和时间（160~180℃ 控制好温度和时间（160~180℃，2小 ），防止包扎的报纸焦糊 防止包扎的报纸焦糊； 时），防止包扎的报纸焦糊； 灭菌过程（未完全冷下来， 灭菌过程（未完全冷下来，60 ℃以下 ） 不要打开烘箱门， 不要打开烘箱门，防止报纸着火或玻璃 器皿遇冷爆裂。 器皿遇冷爆裂。
各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程度的高低水位控制温度恒定控制时间控制度的高低水位控制温度恒定控制时间控制自动排放冷空气程序化显示自动排放冷空气程序化显示饱和蒸汽压压力指示温度饱和蒸汽压压力指示温度直接利用温度探测器指示温度直接利用温度探测器指示温度压力调节器安全阀排气口控制柄记录仪门垫圈放电器蒸汽阀蒸汽夹层蒸汽供给蒸汽供应阀温度感应器蒸汽废汽冷凝器蒸汽通入夹层蒸汽由夹层到灭菌室夹层冷凝水收集口蒸汽由夹层进入灭汽排出口蒸汽进口灭菌过程出气口冷空气和蒸汽灭菌时间压力表蒸汽排气阀温度计阀蒸汽供应阀11取出内筒检查水位
4、培养基的分类
（1）按成分分——对成分种类、量是否清楚 按成分分——对成分种类、量是否清楚 ——对成分种类 天然培养基 合成培养基（组合培养基） 合成培养基（组合培养基） 半合成培养基（也称半组合培养基） 半合成培养基（也称半组合培养基） （2）按物理状态分 固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)； 固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)；固 体基质的使用） 体基质的使用） 半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.7%） 半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.7%） 液体培养基（工业生产中的重要性） 液体培养基（工业生产中的重要性） 脱水培养基（也称预制干燥培养基） 脱水培养基（也称预制干燥培养基）
EMB EMB EMB EMB EMB EMB EMB EMB 在
大
肠
杆
菌
培
养
基
上
的
形
态
二、培养基的配方
一个实验班共配置3种固体培养基： 一个实验班共配置3种固体培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基 高氏1 高氏1号培养基 马丁氏培养基
按照老师的划分进行，每个实验小组都要准 按照老师的划分进行， 几个实验小组配1种培养基， 备，几个实验小组配1种培养基，供全班使 用
2、培养基制备原则和方法
四个原则：目的明确；营养协调； 四个原则：目的明确；营养协调； 物理化学条件适宜；经济节约。 物理化学条件适宜；经济节约。 C/N： C/N：指在微生物培养基中所含的碳 源中碳原子摩尔数与氮源中的氮原 子摩尔数之比。 子摩尔数之比。 四种方法：生态模拟；参阅文献； 四种方法：生态模拟；参阅文献； 精心设计；试验比较。 精心设计；试验比较。
（3）按培养基对微生物的功能分
基础培养基：含有一般微生物生长繁殖需要的基 基础培养基： 本营养物质。 本营养物质。 选择性培养基： 选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求 或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基， 或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基， 具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能， 具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能， 广泛用于菌种筛选等领域。 投其所好、 广泛用于菌种筛选等领域。“投其所好、取其所 ——高通量筛选的建立 高通量筛选的建立。 抗”。——高通量筛选的建立。 鉴别性培养基： 鉴别性培养基：在培养基中加入有能与目的菌的 无色代产物发生显色反应的指示剂，从而达到只 无色代产物发生显色反应的指示剂， 须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出 目的菌菌落的培养基。——直观、专一性（伊红 目的菌菌落的培养基。——直观、专一性（ 直观 美兰培养基，EMB） 美兰培养基，EMB）
培养基及无菌水的制备
一、培养基的相关知识介绍
1、培养基的定义和组成
培养基：指由人工配制的、 培养基：指由人工配制的、适合微 生物生长繁殖或产生代谢产物用的 混合营养基质（反映培养基的2 混合营养基质（反映培养基的2个 作用？）。 作用？）。 包括六大营养要素：碳源、氮源、 包括六大营养要素：碳源、氮源、 无机盐、生长因子、能源、 无机盐、生长因子、能源、水。
3、调pH 5~10%NaOH、1~5%HCl溶液将培养基 用5~10%NaOH、1~5%HCl溶液将培养基 pH调到所需范围 根据需要用精密H试 调到所需范围， 的pH调到所需范围，根据需要用精密pH试 纸或pH计来确定 计来确定。 纸或pH计来确定。 4、包扎 有一定规范要求） （有一定规范要求） 5、灭菌 高压蒸汽灭菌：121.3℃,15～30min） （高压蒸汽灭菌：121.3℃,15～30min）
1、牛肉膏蛋白胨培养基 （分离、培养细菌用） 分离、培养细菌用） ——500ml/ 500ml/组 ——500ml/组
牛肉膏 蛋白胨 NaCl 水 琼脂 pH
3.0g 10.0g 5.0g 1000ml 15～20g 15～ 7.4～ 7.4～7.6
2、高氏1号培养基 （分离、培养放线菌用） 高氏1 分离、培养放线菌用） ——500ml/ ——500ml/组 500ml/组 20g 可溶性淀粉 NaCl 0.5g KNO3 1.0g K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01g 15～25g 15～ 琼脂 1000ml 水 pH 7.4～ 7.4～7.6 临用时无菌操作在800ml培养基中加入 临用时无菌操作在800ml培养基中加入 3%的K2Cr2O7溶液1ml 3%的 溶液1ml
高温灭菌或消毒的方法
过滤除菌技术（正压和负压之分） 过滤除菌技术（正压和负压之分）
滤膜过滤器——微孔滤膜（醋酸纤维、 滤膜过滤器——微孔滤膜（醋酸纤维、硝酸 微孔滤膜 纤维、火棉胶、有机大分子物质）， ），孔径 纤维、火棉胶、有机大分子物质），孔径 0.22和0.45um。 0.22和0.45um。 玻璃滤器——玻璃粉烧结板 G1~G6） 玻璃粉烧结板（ 玻璃滤器——玻璃粉烧结板（G1~G6） 蔡氏（Seitz）滤器——多层石棉纤维板 蔡氏（Seitz）滤器——多层石棉纤维板 整体为金属制成） （整体为金属制成） 其它（不常见）——陶瓷 硅藻土制滤烛形： 陶瓷、 其它（不常见）——陶瓷、硅藻土制滤烛形： ——张伯伦 Chamberland） ——张伯伦（Chamberland）滤器 张伯伦（ ——伯克菲尔德 Berkefeld） ——伯克菲尔德（Berkefeld）滤器 伯克菲尔德（ ——曼德勒尔 Mandler） ——曼德勒尔（Mandler）滤器 曼德勒尔（