不同粗糙度SLA钛形貌对人牙龈成纤维细胞黏附及增殖的影响

不同粗糙度SLA钛形貌对人牙龈成纤维细胞黏附及增殖的影
响
江瑶;黎红;林炯;陈民;单晨阳
【摘要】目的:制作并形成不同粗糙度范围内的喷砂酸蚀的(sandblasting acid-etching,SLA)钛表面,观察表面形貌,分析亲水性,以及观察人牙龈成纤维细胞的黏附以及增殖情况.方法:利用氧化铝颗粒在纯钛表面喷砂酸蚀制作不同粗糙度的SLA钛表面,并与光滑钛表面进行对照研究,通过扫描电镜,轮廓测试仪、接触角测定仪分析表面形貌,并体外接种人牙龈成纤维细胞,采用扫描电镜及CCK-8方法分析细胞黏附及增殖情况.结果:三组SLA形貌呈微米凹坑的表面形貌,且随着粗糙度的增加,表面接触角增大,亲水性下降.在SLA钛表面细胞黏附良好,Ti组优于SLA组.第1-6h,细胞黏附数量无差异.第1-3d,Ti组细胞增殖优于SLA组.第1-5d,Ti250组增殖无优势.结论:通过喷砂酸蚀法形成具有微米结构的钛表面均具有良好的生物相容性,光滑钛0.07μm≤Ra≤0.09μm,有利于人牙龈成纤维细胞的黏附与早期增殖.
【期刊名称】《口腔颌面修复学杂志》
【年(卷),期】2019(020)002
【总页数】6页(P81-86)
【关键词】纯钛种植体;喷砂酸蚀;表面形貌;表面粗糙度;人牙龈成纤维细胞;亲水性【作者】江瑶;黎红;林炯;陈民;单晨阳
【作者单位】浙江中医药大学口腔医学院浙江 310000;浙江中医药大学口腔医学
院附属杭州口腔医院浙江 310000;浙江中医药大学口腔医学院浙江 310000;浙江中医药大学口腔医学院浙江 310000;浙江中医药大学口腔医学院浙江 310000【正文语种】中文
【中图分类】R780.2
纯钛因具有良好的生物相容性等优点，在口腔种植领域被广泛应用。

种植修复可增加人工修复体的存留率和稳定性，改进功能和美学效果，提升患者满意度[1]。

但
种植体成功与否不仅取决于骨结合是否良好，也取决于软组织封闭是否良好。

针对骨组织，成骨细胞是黏附于材料的主要细胞，随着种植体表面处理技术的不断发展，目前常见的口腔种植系统，如士卓曼等经喷砂酸蚀(SLA)等技术的应用，将微米级
粗糙形貌构建于钛表面，使种植体的骨接触面积得以进一步增加，有效促进了成骨细胞的粘附以及分化等[2]。

针对软组织，在对种植体长期稳定性的研究，由牙龈
成纤维细胞组成的结缔组织对形成良好的组织封闭具有重要意义。

而影响软组织结缔组织中牙龈成纤维细胞黏附增殖的因素有表面粗糙度，表面形貌，表面的化学成分以及亲水性等[3,4]，其中表面粗糙度更是重要因素之一。

临床上虽然软组织水
平种植体颈部仍以光滑表面为主，但也尚存争议，关于何种粗糙度及钛表面形貌更加适合牙龈成纤维细胞的生长仍然缺乏相关证据[5]，因此本研究通过SLA方法成功制备了三种微米级粗糙表面，并与光滑钛表面进行了对照研究。

采用了体外细胞实验进行了对比分析，进一步明确了上述三种钛表面对人牙龈成纤维细胞的附着生长有何影响，也进一步分析了粗糙度对于人牙龈成纤维细胞在SLA钛表面生物学
行为的影响。

1.材料与方法
1.1 主要试剂及材料99.9%乙醇，蒸馏水，37%浓盐酸，浓硫酸，纯钛片(99.5%，柏泰)，高纯氧化铝微粉(直径=45μm，125μm，250μm)(绿新源)，CCK-8增殖
试剂(七海生物)，人牙龈成纤维细胞(原代培养)，0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)，磷酸缓冲盐溶液PBS(诺森德)，胎牛血清FBS(四季青)，青霉素-链霉素(Gibco，美国)。

1.2 主要仪器与设备自动抛光机(永发光)，喷砂机(JNSP-I型湿喷砂机)，数显恒温水浴锅(HH-1，科析)，探针式表面轮廓仪(DektaXT，Bruker，德国)，光学3D轮廓测量仪(Chotest)，光学接触角测量仪(ZJ-6900，致佳)，场发射扫描电镜
(SU8000，日立，日本)，细胞恒温培养箱(Thermo，美国)，酶标仪(BioTek，美国)。

1.3 试件制备制备1种规格的纯钛试件(圆形，直径15mm，厚度1mm)共80个，将试件随机分为A、B、C、D组，每组20个，各组试件的处理方法如下：A组：应用自动抛光机对其加以打磨抛光，并依次将纯钛试件置于蒸馏水、99.9%乙醇、蒸馏水中，同时分别进行10min超声，经由紫外线灭菌以及高温烘干后留存后备用，将其设为对照组Ti。

B组：将制备好的试件应用氧化铝粒喷砂处理(压力：
0.4MPa，喷砂直径：45μm)，依次置于蒸馏水、99.9%乙醇、蒸馏水中分别超声10min，再置于100℃，50%硫酸∶10%盐酸=1∶1混合，酸蚀20min，再次置
于蒸馏水、99.9%乙醇、蒸馏水中，同时分别进行10min超声，高温烘干，紫外
线灭菌后，设为实验组Ti45。

C组：将制备好的试件应用氧化铝颗粒喷砂处理(压力：0.4MPa，喷砂直径：125μm)，并依次将纯钛试件置于于蒸馏水、99.9%乙醇、蒸馏水中，同时分别进行10min超声，再置于100℃浓硫酸/浓盐酸混合酸中酸蚀20min，再次置于蒸馏水、99.9%乙醇、蒸馏水中分别超声10min，高温烘干，紫外线灭菌后，设为实验组Ti125。

D组：将制备好的试件应用氧化铝颗粒喷砂处理(压力：0.4MPa，喷砂直径：250μm)，并依次将纯钛试件置于蒸馏水、
99.9%乙醇、蒸馏水中，同时分别进行10min超声，再置于100℃浓硫酸/浓盐酸混合酸中酸蚀20min，再次置于蒸馏水、99.9%乙醇、蒸馏水中分别超声10min，高温烘干，紫外线灭菌后，设为实验组Ti250。

1.4 材料表面粗糙度的测量试件分为4组，每组10个样本，分别利用探针式轮廓测试仪检测A、B、C、D材料表面粗糙度(Ra)。

1.5 材料表面形貌及亲水性分析
1.5.1 材料表面形貌试件分为4组，分别在扫描电子显微镜(SEM)观察各组试件表面的微形貌；利用光学3D表面轮廓测试仪白光干涉模式下检测试件表面形貌，并分析扫描结果。

1.5.2 材料表面接触角的测量试件分为4组，每组8个样本，10sec内将1μL蒸
馏水滴于各组试件表面，利用光学接触角测量仪分析试件的表面接触角，每组样本表面测量3个不同位点。

1.6 人牙龈成纤维细胞在不同形貌材料表面的黏附及增殖分析
1.6.1 人牙龈成纤维细胞的培养牙龈取自因正畸或因手术原因需切除牙龈且牙龈无炎症的患者(20-35岁)，均经浙江中医药大学伦理委员会的批准。

采用组织块贴壁法培养出原代人牙龈成纤维细胞,当细胞长至培养瓶底80%左右时，0.25%胰酶消化，以1∶2或l∶3传代。

复苏第三代的人牙龈成纤维细胞，置于二氧化碳恒温培养箱中培养，温度37℃，CO2体积分数5%，2-3d换液。

实验中所用细胞均为
3-6代细胞。

1.6.2 扫描电镜观察细胞黏附形态将4组材料消毒灭菌后放入24孔板，每个孔接种5×104个/ml，细胞培养时间为1 d，将钛片夹出，纯水冲洗2遍后专用的电
镜固定液:2.5%戊二醛固定液2h，PBS洗2-3次，每次3min，饿酸固定30min，叔丁醇，乙醇梯度脱水：30%、50%、75%、95%脱水3min，100%酒精脱水
10min，临界点干燥，喷金扫描，1000、5000倍场发射扫描电镜观察拍照。

1.6.3 人牙龈成纤维细胞在不同形貌材料表面的黏附及增殖检测(CCK-8) 将4组材料消毒灭菌后各20个样本放入24孔板，每孔接种1×104个细胞，加入1ml DMEM培养液。

分别在1h，6h，1d、3d、5d时间点进行测量，相应的时间点
用镊子取出材料片，将材料片移入新的24孔，PBS冲洗2次，每孔加500μl培养基，设置一孔不含钛片的培养基，每个孔加入50μl CCK-8孵育2h。

从每个孔吸
出200μl加入新的96孔板中，孔板周围用培养液充填;酶标仪测量(450nm)测量
吸光度值，每组材料重复测量3次。

1.7 统计学分析采用SPSS17.0将测得的粗糙度数据，表面接触角以及所得OD值进行单因素方差分析和多重比较，检验水准α=0.05，P<0.05差异具有统计学意义。

2.结果
2.1 粗糙度如图1所示，制作的四种试件表面，三种SLA形貌，测量粗糙度如下：Ti组Ra=0.08±0.01μm，Ti45组Ra=0.67±0.1μm，Ti125组
Ra=1.66±0.08μm，Ti250组Ra=2.9±0.13μm，通过SPSS17.0进行单因素方差分析和多重比较得出，P<0.001，各组之间差异有统计学意义。

2.2 表面形貌-光学3D表面轮廓测量仪如图2所示，光学3D表面轮廓测试仪下
四组试件的三维形貌表现出不同的特点。

Ti组为对照组，虽为光滑组但不是绝对
的光滑，表面仍可看到细小的沟纹；根据三维重建的图可发现，所有SLA的试件
表面均呈现大小不等的微米凹陷。

随着喷砂颗粒的直径越大，粗糙度增加，微米凹陷的深度更深。

其中Ti250组的的微米凹陷深度相比Ti及Ti125组更加明显。

图1 四组试件的粗糙度(***P<0.001)
图2 轮廓测试仪观察四组试件三维形貌(0.49×0.49μm2)
2.3 表面形貌-扫描电镜(SEM) 观察4组试件表面形貌如图3。

可见微小机械划痕
分布于光滑钛(Ti组)试件表面；可见深浅不一的微米凹坑分布于Ti45组试件表面，
直径多约为2μm；Ti125组试件表面同样呈现大小不一的微米凹坑，但凹坑较
Ti45组致密，直径为1-3μm凹坑；Ti250组试件表面凹坑大小不一，深浅不一，较Ti45组致密，与Ti125组相当，直径约为2-3μm。

2.4 亲水性分析四组试件的接触角镜下照片为图4所示，最终测量结果如图5所示，接触角Ti250组>Ti125组>Ti45组>Ti组，4组之间存在统计学差异
(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。

接触角大小和亲水性成反比，因而4组试件的表面亲水性Ti组>Ti45组>Ti125组>Ti250组。

图3 扫描电镜观察四组试件表面形貌(×5000)
图4 四组试件的表面接触角测量镜下照片
图5 四组试件的表面接触角(***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05)
2.5 扫描电镜下人牙龈成纤维细胞黏附形态如图6所示，1000倍下在Ti组材料表面，细胞呈梭形，扁平状，单排排列，平坦铺展细胞伪足长且连成网状，在Ti45组，Ti125组，Ti250组材料表面，细胞形态各异，生长方向具有差异性，其中可见细胞形成了垂直或角连接，呈簇状，表面细胞伪足插入微孔内，较Ti组数目少且长度短。

图6 四组试件表面人牙龈成纤维细胞的黏附形态(×1000)
2.6 人牙龈成纤维细胞在材料表面黏附及增殖情况通过CCK-8实验，根据酶标仪测定的OD值绘制柱状图(图7)发现，在人牙龈成纤维细胞黏附早期1h、6h时发现，Ti组，Ti45、Ti125组，Ti250组表面细胞数量差异无统计学意义。

在细胞增殖早期1d时发现，对照组光滑组Ti组的细胞数量最多，大于Ti250组、Ti45、Ti125组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

而在细胞接种3d时发现，Ti组、Ti45组及Ti125组细胞数量之间差异无统计学意义，但均多于Ti250组，结果差异具有统计学意义(P<0.05)。

细胞接种5d时发现，Ti组表面增殖速率与Ti45组差异无统计学意义，Ti45与Ti125组SLA钛表面细胞差异无统计学意义，但均大于
Ti250组SLA钛表面，结果差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.讨论
图7 各个时间点HGF在不同材料上的黏附增殖情况(**P<0.01，*P<0.05)
随着口腔技术的不断发展，各种表面改性的方法被应用于种植体穿龈部分的研发，如大颗粒喷砂酸蚀(SLA)、酸碱复合处理、阳极氧化法、微弧氧化，以及羟基磷灰
石涂层的应用等。

而表面粗糙度，表面形貌是影响细胞存活、附着、生长最具影响力的因素，决定细胞的形态、功能和增殖情况[6]。

而SLA技术运用于种植体穿龈部分，与软组织的结合目前研究较少，尤其是与不同的粗糙度形貌与牙龈成纤维细胞黏附增殖的研究尚无足够证据。

Kokubu[7]认为大颗粒喷砂酸蚀(SLA)表面能促
进成纤维细胞的附着，而Akihiro[8]发现在SLA表面人牙龈成纤维细胞比机械处
理表面黏着斑蛋白(Vincinlin)表达量少以及肌动蛋白(F-actin)的连续性弱，认为两者之前的差别与喷砂的氧化铝颗粒的大小有关。

在种植体材料粗糙与光滑的定义上，Wennerberg[9]进行了分类，认为Ra<1μm为光滑，Ra>1μm为粗糙，按粗糙
程度分为微粗糙(0.5-1μm)，中度粗糙(1-2μm)，高度粗糙(2-3μm)[10]。

所以本
文通过喷砂酸蚀的方法，成功形成了3种不同范围的粗糙度的SLA表面形貌，粗
糙度分别为Ti45组Ra=0.67±0.1μm，Ti125组Ra=1.66±0.08μm，Ti250组
Ra=2.9±0.13μm，可为研究SLA种植体穿龈部分与软组合结合的关系提供一定的参考依据。

目前人牙龈成纤维细胞的黏附与材料表面的亲水性的研究较少，一般认为细胞更易黏附于亲水性的表面。

Nothdurft[11]也认为高亲水性的表面，细胞的黏附与增殖更为明显。

但LAiY认为亲水性强的材料表面，人牙龈成纤维细胞表达的纤连蛋白水平比亲水性弱的表面低[12]。

Gitten[13]认为亲水性可通过影响蛋白质和其他生物大分子的黏附，细胞与黏附层的相互作用，以及细菌黏附及菌斑生物膜的形成来影响附着细胞的生物学行为。

本实验通过亲水性的检测发现光滑钛表面亲水性能相
对较好，而随着粗糙度的增加，亲水性下降，推测是因SLA处理的钛表面暴露于
空气中，会在微观结构上存有一层碳化组织，使材料表面表现为疏水特质[14]。

本实验在扫描电镜下发现亲水性能最佳的光滑钛表面人牙龈成纤维细胞铺展面积大，细胞伸出的伪足目多且长，连成网状，说明在光滑钛表面细胞可良好地黏附，且黏附牢靠。

而在实验组材料表面发现，细胞也可良好地黏附，细胞形态各异，呈三维立体状，生长方向各异，围绕材料表面微米凹陷排列，这是因为相对于光滑钛表面，细胞需较多的时间适应粗糙的钛表面[15]。

但亲水性并不是影响细胞黏附与增殖的唯一因素，因此在之后的细胞黏附及增殖实验中发现，在细胞黏附1h及6h时发
现各组材料活细胞黏附数量无明显差异。

在细胞增殖早期1d时，光滑的纯钛表面表现出活细胞数量增加，均大于粗糙的三组SLA钛表面，推测因光滑纯钛表面不
仅亲水性能佳，可促进细胞黏附基因的表达[13]，Dorkhan[16]发现在1d时，光滑钛表面成纤维细胞黏附的数量较多。

而在细胞接种3d及5d时发现，高度粗糙
度SLA钛表面细胞数量较少，Kunzler[17]通过实验研究，发现随着增加材料表面的粗糙度，成纤维细胞的增殖减少，这与本实验的结果类似。

推测因为高度粗糙钛表面亲水性能较差，初期细胞附着量少，且粗糙度并不是越大越好，粗糙度振幅过大，表面越不平整反而不利于细胞的黏附与增殖。

因此本实验说明在光滑钛表面和SLA钛表面，细胞均能良好地黏附，而光滑的钛表面更适合HGF的黏附及早期增殖。

也说明了在人牙龈成纤维细胞增殖期间，表面粗糙度与亲水性相互影响，且细胞增殖早期亲水性对细胞的生长影响较大，而过于粗糙的钛表面在促进细胞黏附与增殖方面未显优势。

本实验成功采用大颗粒氧化铝喷砂酸蚀的方法，成功形成了3种不同粗糙度的
SLA表面形貌，分别为Ti45组Ra=0.67±0.1μm，Ti125组Ra=1.66±0.08μm，Ti250组Ra=2.9±0.13μm，包括微粗糙，中度粗糙以及高度粗糙范围，并通过与光滑钛表面体外HGF对照实验得出结论。

三种SLA形貌呈微米凹坑的表面形貌，
且随着粗糙度的增加，纯钛表面接触角增大，亲水性下降，各组之间差异有统计学意义。

SLA钛表面人牙龈成纤维细胞均能良好地黏附生长，光滑的纯钛表面
0.07μm≤Ra≤0.09μm时，有利于人牙龈成纤维细胞的黏附与早期增殖。

细胞增
殖早期，亲水性对细胞生长的影响较大，高度粗糙的SLA钛表面在促进细胞黏附
与增殖方面未显优势。

参考文献
【相关文献】
[1]张戎，刘洪臣.种植体表面涂层制备技术及其对骨质疏松下骨结合的影响研究进展[J].口腔颌面修复学杂志，2018，19(2):119-123
[2]陈佳希，邵水易，邱憬.喷砂酸蚀与双重酸蚀钛表面对成骨细胞行为影响的对比研究[J].口腔医学，2018，38(4):295-299
[3]王闻天，孟维艳，周延民，等.不同钛合金表面形貌对成纤维细胞生物学行为的影响[J].实用口腔医学杂志，2014，30(2):151-155
[4]Borges AM,LO Benetoli,MA Licinio,et al.Polymer films with surfacesunmodified and modified by non-thermal plasma as new substrates for cell adhesion[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2013,33(3):1315-1324
[5]Ramaglia L,GDi Spigna,G Capece,et al.Differentiation,apoptosis,and GM-CSF receptor expression of human gingival fibroblasts on a titanium surface treated by a dual acidetched procedure[J].Clin Oral Investig,2015,19(9):2245-2253
[6]王丽波，韦纪英.种植体表面特征对软组织附着的研究进展[J].现代医药卫生，2016，(3):405-406
[7]Kokubu E,DW Hamilton,T Inoue,et al.Modulation of human gingival fibroblast adhesion,morphology,tyrosine phosphorylation,and ERK 1/2 localization on
polished,grooved and SLA substratum topographies[J].J Biomed Mater Res
A,2009,91(3):663-670
[8]Furuhashi A,Y Ayukawa,I Atsuta,et al.The difference of fibroblast behavior on titanium substrata with different surface characteristics[J].Odontology,2012,100(2):199-205
[9]Wennerberg A,C Hallgren,C Johansson,et al.A histomorphometric evaluation of screw-shaped implants each prepared with two surface roughnesses[J].Clin Oral Implants
Res,1998,9(1):11-19
[10]王燕，王国平，夏露.钛种植体表面粗糙度研究进展[J].中国口腔种植学杂志，2012，
17(2):90-94
[11]Nothdurft FP,D Fontana,S Ruppenthal,et al.Differential Behavior of Fibroblasts and Epithelial Cells on Structured Implant Abutment Materials:A Comparison of Materials and Surface Topographies[J].Clin Implant Dent Relat Res,2015,17(6):1237-1249
[12]Lai Y,J Chen,T Zhang,et al.Effect of 3D microgroove surface topography on plasma and cellular fibronectin of human gingival fibroblasts[J].J Dent,2013,41(11):1109-1121
[13]Gittens RA,L Scheideler,F Rupp,et al.A review on the wettability of dental implant surfaces II:Biological and clinical aspects[J].Acta Biomater,2014,10(7):2907-2918
[14]刘鑫.亲水性处理粗糙钛表面对成骨细胞黏附影响[D].上海交通大学，2008
[15]Tete S,VL Zizzari,B Borelli,et al.Proliferation and adhesion capability of human gingival fibroblasts onto zirconia,lithium disilicate and feldspathic veneering ceramic in
vitro[J].Dent Mater J,2014,33(1):7-15
[16]Dorkhan M,T Yucel-Lindberg,J Hall,et al.Adherence of human oral keratinocytes and gingival fibroblasts to nanostructured titanium surfaces[J].BMC Oral Health,2014,14:75 [17]Kunzler TP,T Drobek,M Schuler,et al.Systematic study of osteoblast and fibroblast response to roughness by means of surface-morphology
gradients[J].Biomaterials,2007,28(13):2175-2182。