简便烘干在水稻叶片DNA 大量提取中的应用

河南农业科学,2020,49(2):52-57Journal of Henan Agricultural Sciences
doi :10.15933/ki.1004-3268.2020.02.007
收稿日期:2019-08-10
基金项目:国家重点研发计划项目(2017YFD0100402);贵州省科技成果应用及产业化计划项目(黔科合成果[2018]4306);毕
节市科技支撑计划项目(毕科合字[2016]20号)
作者简介:田孟祥(1983-),男,贵州麻江人,助理研究员,硕士,主要从事水稻育种及栽培研究㊂E -mail:tmengxiang@
简便烘干在水稻叶片DNA 大量提取中的应用
田孟祥1,宫彦龙2,张时龙1,雷㊀月2,何友勋1,李佳丽2,余本勋1,
张大双2,叶永印1,闫志强2
(1.毕节市农业科学研究所,贵州毕节551714;2.贵州省水稻研究所,贵州贵阳550006)
摘要:为探索烘干法替代液氮冷冻法研磨水稻叶片提取DNA 的可行性,首先比较50ħ低温烘干
法与液氮冷冻法研磨水稻叶片提取DNA 的扩增效果,然后进一步分析不同温度(50㊁60㊁70㊁80㊁90ħ)烘干水稻叶片研磨提取DNA 的扩增效果,筛选最佳的烘干温度㊂结果表明,水稻叶片在
50~70ħ下烘干磨碎所提取的DNA 均能进行有效扩增,以50ħ效果最佳,其与液氮冷冻法研磨叶
片提取DNA 的扩增效果无明显差异㊂水稻叶片烘干法具有操作简单㊁费用低廉及实用性强等诸多优点,在DNA 大量提取中可较好地替代液氮冷冻法对叶片进行制备,具有一定的推广应用价值㊂关键词:水稻;叶片;简便烘干法;DNA 大量提取;液氮冷冻法
中图分类号:S511㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2020)02-0052-06
Application of Simple Drying in Extraction of Large
Amount of DNA from Rice Leaves
TIAN Mengxiang 1,GONG Yanlong 2,ZHANG Shilong 1,LEI Yue 2,HE Youxun 1,
LI Jiali 2,YU Benxun 1,ZHANG Dashuang 2,YE Yongyin 1,YAN Zhiqiang 2
(1.Bijie Institute of Agricultural Science,Bijie 551714,China;2.Guizhou Rice Institute,Guiyang 550006,China)
Abstract :In order to explore the feasibility of drying method instead of liquid nitrogen freezing method to
grind rice leaves to extract DNA,firstly the amplification effects of DNA extracted from grinded rice leaves by low temperature drying under 50ħand liquid nitrogen freezing were compared,and then the amplifi-cation effects of DNA extracted from leaf grinded by drying method under different temperature (50,60,70,80,90ħ)were further analyzed to screen the best drying temperature.The results showed that the DNA extracted from leaf grinded by drying method under 50 70ħcould be effectively amplified,the
effect was the best under 50ħ,and there was no significant difference between the amplification effects of the DNA extracted from leaf grinded by drying method and liquid nitrogen freezing method.The drying
method of rice leaves had many advantages,such as simple operation,low cost and strong practicability,which could replace the liquid nitrogen freezing method to prepare the leaves in the large-scale extraction
of DNA,and had good popularization and application value.
Key words :Rice;Leaf;Simple drying method;Extraction of massive DNA;Liquid nitrogen
freezing method
㊀㊀水稻是我国重要的粮食作物之一,其栽种面积约占粮食作物总面积的1/3,产量约占粮食产量的1/2,为中国60%以上的人口提供口粮[1]㊂水稻的研究工作对我国的粮食生产及安全有着极为重要的
意义㊂随着现代分子生物学的发展,分子技术已成为水稻研究的重要手段,以DNA 作为研究对象最为广泛,如基于DNA 的基因定位㊁基因克隆及各种分子标记的开发与应用等㊂目前,关于水稻DNA 提取
㊀第2期田孟祥等:简便烘干在水稻叶片DNA大量提取中的应用
方法的研究颇多,较早的主要是传统的CTAB法[2]和SDS法[3]㊂随着专家学者的不断探索,以上2种方法又各自衍生出了一些新的提取方法[4-6],甚至脱离了传统CTAB及SDS方法的束缚,发展了全新的提取方法,如TE煮沸法[7]㊁NaOH法[8-11]㊁TPS 法[12-14]㊁PCR缓冲法[15]等㊂水稻的DNA提取方法很多,但是,无论哪种提取方法,从操作程序步骤上来看,都可简要地概括为两大部分,一是材料(如叶片㊁种子等)的制备,二是提取试剂的加入㊂
叶片是水稻最常用㊁最易于进行DNA提取的组织,针对叶片的DNA提取方法最为多见㊂众所周知,叶片研磨得越细,越有利于DNA的浸出,所提取到的DNA量也越多㊂在提取DNA的叶片制备方面,发展了操作较为快捷的剪切法[16]㊁钢珠法[17]等,诸多新开发的DNA提取方法大都是建立在这2种叶片制备基础之上,但是,不管研究者对DNA需求量的多寡,传统的CTAB㊁SDS及其衍生方法最受青睐[18-21],使用人数最多,可能是由于这些方法提取的DNA质㊁量兼顾的原因㊂这些传统及其衍生提取方法,其普遍的1个特征就是水稻叶片需精心制备㊁磨细,以便后续加入试剂后DNA易于浸出㊂叶片的磨细制备工艺,目前主要有液氮冷冻后研磨㊁无须冷冻直接研钵研磨及真空冷冻干燥后研磨等3种㊂其中,无须冷冻直接研钵研磨操作繁琐,费工费时,效率低下,少有使用;干燥冷冻法仪器昂贵,一些实验室根本不具备使用条件,且其干燥冷冻效果也不太令人满意;液氮冷冻方法综合效果较佳,也较为实用和常用㊂利用液氮冷冻叶片,可使叶片受冻变脆利于研磨,同时在低温条件下也更利于组织细胞保护㊂然而,在实际工作中,使用液氮处理叶片,也表现出一些不便:在液氮冷冻叶片之前,需将叶片的附着水擦干,以免叶片冷冻不充分,影响后续研磨效果,无疑这一操作步骤,也制约着工作效率的提高;在常压下,液氮温度为-196ħ,稍有不慎易被冻伤,且由于温度极低,不宜长时间接触;为操作方便,使用过程基本置于开放环境中,而液氮极易挥发,有效利用率低,在常规条件下也不易储存;样品需浸没在液氮中受冻,使用量大,成本较高,甚至某些地方使用者附近无液氮销售,更是增加了使用困难等㊂鉴于以上液氮使用存在的一些不足,需要尝试寻找简便实用的替代方法㊂为此,研究烘干法替代液氮冷冻法研磨水稻叶片提取DNA的可行性,并分析不同烘烤温度烘干水稻叶片研磨提取DNA的扩增效果差异,以期筛选最佳的烘烤温度㊂该方法简便实用,可较好地替代液氮冷冻法制备叶片,进行DNA大量提取,有着重要的推广价值和实践意义㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀供试材料
水稻材料:纳雍五里香㊁毕粳43㊂
主要设备㊁工具:干燥箱㊁离心管㊁塑料研磨棒㊁离心管架等㊂
1.2㊀试验方法
1.2.1㊀水稻叶片制备㊀取水稻新鲜叶片约0.4g,放入2mL的离心管中,然后将该离心管置于干燥箱中进行烘烤,干燥箱温度设置5个处理,即50ħ㊁60ħ㊁70ħ㊁80ħ和90ħ;烘烤时间为24h,取出离心管,放在离心管架上(固定),用塑料研磨棒伸入离心管内,上下来回敲击叶片,搅碎叶片成粉状㊂每个处理设置3个重复㊂以直接液氮冷冻研磨水稻新鲜叶片为对照㊂
1.2.2㊀水稻DNA大量提取㊀将上述已制备好的水稻叶片粉状物加入1.5mL CTAB溶液(2%CTAB㊁1.4mol/L NaCl㊁0.2mol/L EDTA㊁0.1mol/L Tris Basic㊁pH值8.0),在65ħ下水浴1h,期间摇晃数次;12000r/min离心10min,取上清液1mL移至2mL的EP离心管中,弃去沉淀;加入苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇溶液(25ʒ24ʒ1)1mL,摇床水平摇动15min; 12000r/min离心10min,小心吸取上清0.7mL至2mL的EP离心管中;加入氯仿ʒ异戊醇溶液(24ʒ1) 0.7mL,摇床水平摇动15min;12000r/min离心10min,取上清液0.4mL至已灭菌1.5mL的EP离心管中,加40μL的3mol/L NaAC(pH值5.2),再加入0.8mL的-20ħ的无水乙醇,在-20ħ静置1h;在-10ħ下,12000r/min离心10min,弃上清液,加入0.5mL75%乙醇洗涤2次;将离心管放置超净工作台中风干,加入0.3mL超纯水溶解备用㊂1.2.3㊀PCR扩增及电泳检测㊀采用陆艳婷等[22]报道的香味基因Badh2的四引物标记对本研究所介绍方法提取的DNA质量进行鉴定,四引物序列如下,ESP:5ᶄ-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3ᶄ;EAP: 5ᶄ-AGTGCTTTACAAAGTCCCGC-3ᶄ;IFAP:5ᶄ-CAT-AGGAGCAGCTGAAATATATACC-3ᶄ;INSP:5ᶄ-CTG-GTAAAAAGATTATGGCTTCA-3ᶄ㊂以上四引物在同一PCR管里进行扩增,纯合非香稻可获得长度为585㊁355bp的2条带,纯合香稻可获得长度为577㊁257bp的2条带㊂
PCR扩增体系为20μL,包括DNA2μL(10~ 100ng/L)㊁四引物各0.5μL(2μmol/L)㊁10ˑTaq Buffer2μL㊁Mg2+1.2μL㊁dNTP Mixture0.4μL(2.5
35
河南农业科学第49卷
mmol /L)㊁Taq DNA 聚合酶0.4μL (2.5U /μL )㊁dd H 2O 12μL㊂以上引物和其他PCR 组分试剂均
购自生工生物工程(上海)股份有限公司㊂反应程序为:95ħ预变性5min;95ħ变性30s,60ħ退火
复性30s,72ħ延伸30s,循环31次;72ħ延伸10min,10ħ2min㊂将产物取出备用㊂
电泳检测:将扩增产物用约2%的琼脂糖凝胶
(TBE 缓冲液)于120V 电压下电泳30min,用Gill-green 核酸染料染色;用生工生物工程(上海)股份
有限公司生产的DNA 分子质量Marker B(100bp㊁200bp㊁300bp㊁400bp㊁500bp 和600bp)为对照,电
泳结束后将凝胶置于凝胶成像系统GEL DOC XR 中观察并拍照㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀烘干法和液氮冷冻法的叶片制备效果、效率
分析
水稻叶片烘干后变脆,用塑料研磨棒伸入试管里,上下敲击,很容易就把叶片击碎成粉状,简单快速㊂而用液氮冷冻的叶片,亦可磨成粉状,但需研磨时间稍长,且要在液氮冷冻处理前把附着在叶片上的水擦干,否则叶片冷冻不充分,难以磨细;另外,在叶片被液氮冷冻取出后,应迅速研磨,一旦液氮蒸发完,叶片变软,将导致研磨困难,操作连续紧凑,工作强度大;再者,液氮极冷,稍有不慎易被液氮冻伤,不宜长时间接触㊂可见,就操作性而言,上述2种不同的水稻叶片制备方法,以烘干法较为简便,效率高,可操作性强㊂烘干法磨样情况如图1所示
㊂
a.烘干法磨样前工具㊁材料准备;
b.烘干法磨样后情况
a.Tool and material preparation before sample grinding by drying method;
b.Sample grinded by drying method
图1㊀烘干法磨样情况
Fig.1㊀Sample grinded by drying method
2.2㊀水稻叶片在50ħ烘干磨碎与液氮冷冻研磨的
DNA 提取扩增效果分析
对于水稻来说,叶片是提取DNA 的最佳组织㊂一般用于水稻DNA 大量提取的叶片,需要被磨碎㊁磨细,主要采用的方法有3种,即新鲜叶片于研钵中
直接研磨㊁叶片液氮冷冻后研磨及冷冻干燥机冷冻后研磨,由于直接研磨效率低和冷冻干燥机昂贵等原因,以液氮冷冻后研磨最为普遍㊂利用液氮冷冻的作用,一方面是让叶片冻脆便于研磨,另一方面则
是保护组织细胞减少降解㊂干燥箱对叶片进行烘烤处理,也可达到叶片变脆利于研磨的效果,操作上更便捷高效,是否也能提取出合格的DNA 呢?本研究进行了试验探索,基于能烘干和低温保护组织考虑,设置烘烤温度为较低的50ħ,同时以液氮冷冻研磨
法为对照㊂
利用以上2种方法研磨叶片组织提取DNA,为了更好地对比扩增效果,本研究使用了对DNA 质量要求较高的四引物扩增受阻突变体系PCR 技术,使用的水稻材料为纳雍五里香,PCR 扩增产物的电泳检测图谱见图2㊂由图2可知,50ħ烘干磨碎与液
氮冷冻研磨水稻叶片提取的DNA 均能有效扩增出577㊁257bp 2条带,且扩增效果相当,表明50ħ烘
干磨碎与液氮冷冻研磨水稻叶片提取DNA 的PCR 扩增效果无明显差异,因此,50ħ下烘干水稻叶片
提取DNA 方法切实可行
㊂
M:Marker B;1 3:液氮冷冻法提取的DNA;4 6:50ħ
烘干法提取的DNA
M:Marker B;1 3:DNA extracted from leaf grinded by liquid nitrogen
freezing method;4 6:DNA extracted from leaf grinded by
drying method under 50ħ
图2㊀50ħ烘干法和液氮冷冻法研磨叶片
提取的DNA 扩增效果
Fig.2㊀Amplification effects of DNA extracted from leaf
grinded by 50ħdrying method and liquid nitrogen
freezing method
2.3㊀不同温度烘烤水稻叶片提取DNA 的扩增效果分析
在干燥箱50ħ环境下烘干水稻叶片提取的
DNA,经PCR 扩增后发现,其扩增效果与液氮冷冻磨样提取法无明显差异㊂随着烘烤温度的增加,烘干叶片的时间相对减少,然而,温度提高很可能会影响DNA 的提取质量㊂为探讨较高烘烤温度对DNA 提取质量的影响,笔者又设置了60ħ㊁70ħ㊁80ħ
和90ħ4个不同温度,并以50ħ为对照㊂
4
5
㊀第2期田孟祥等:简便烘干在水稻叶片DNA大量提取中的应用
由图3可知,60ħ烘干水稻叶片提取的DNA (毕粳43)和70ħ烘干水稻叶片提取的DNA(纳雍五里香)均能进行有效扩增,两者扩增效果差异不明显,但条带亮度不及50ħ烘干水稻叶片提取DNA的效果好,可能是由于温度高导致DNA降解的缘故,而80ħ和90ħ烘干水稻叶片提取的DNA 未能进行有效扩增㊂试验结果表明,在温度不高于70ħ的条件下对水稻叶片进行烘干磨碎提取DNA,可用于常规PCR扩增,以50ħ最佳
㊂
M:Marker B;1 3:50ħ烘干法提取的DNA;4 6:60ħ烘干法提取的DNA;7 9:
70ħ烘干法提取的DNA;10 12:80ħ烘干法提取的DNA;13 15:90ħ烘干法提取的DNA
M:Marker B;1 3:DNA extracted from leaf grinded by drying method under50ħ;4 6:DNA extracted from
leaf grinded by drying method under60ħ;7 9:DNA extracted from leaf grinded by drying method under70ħ;
10 12:DNA extracted from leaf grinded by drying method under80ħ;13 15:DNA extracted from leaf
grinded by drying method under90ħ
图3㊀不同温度烘干水稻叶片提取的DNA扩增效果
Fig.3㊀Amplification effects of DNA extracted from drying leaves under different temperatures
3㊀结论与讨论
自从PCR技术诞生以来,分子标记在基因定
位㊁遗传多样性分析㊁种质鉴定㊁转基因检测及分子
标记辅助育种等方面得到了广泛应用,而DNA提取
是进行以上分子生物学研究的基础和前提条件[23]㊂
提取基因组DNA的质量直接关系到后期分子生物
学试验的成败㊂在水稻中,关于DNA的提取方法颇
多,特别是近年来,各种快速提取DNA的方法更是
层出不穷㊂但是,大部分研究还是更加倾向于使用
传统的CTAB法㊁SDS法及其衍生的一些新方法等
DNA大量提取法;这些方法满足了质量和数量兼顾
需求,可信度无可替代,奉为经典,应用率高㊂DNA
大量提取主要涉及两大部分,一是水稻叶片的制备,
二是制备之后加入相关试剂进行DNA提取,不少专
家学者对DNA提取方法进行了改进,但主要关注于
提取试剂的选择上,对前期的工作即水稻叶片制备
环节研究极少㊂水稻叶片制备也是影响DNA提取
效率和成败的关键因素,对于DNA的大量提取,需
要对叶片进行研磨,使其粉碎变细㊂液氮冷冻后研
磨是最常用的叶片制备方法,但其在实际应用中也
存在费用较高㊁储存不便等一些不足,特别是无法购
置到液氮的实验室,更是无法感受到液氮带来的恩
惠,实用性受限,新的替代方法渴求开发㊂本研究开
发了一种可用于DNA大量提取的水稻叶片简便制
备方法,其PCR扩增效果与液氮法相当,但可操作
性和实用性更强㊂其主要操作是将叶片放入2mL
的离心管中,于干燥箱内烘干变脆,然后用塑料研磨
棒伸入离心管内把叶片捣碎㊂针对烘干法,从防高
温导致叶片DNA降解方面考虑,首先设置为较低温
度即50ħ,试验结果表明,在此温度下所提取的
DNA扩增效果与液氮研磨提取法无明显差异;进而
又设置了60ħ㊁70ħ㊁80ħ及90ħ等4个不同温
度进行烘干试验,从结果来看,60ħ和70ħ提取的
DNA均能进行有效扩增,且两者扩增效果差异不明
显,但均不及50ħ的效果好,可能是高温导致DNA
降解的缘故;80ħ和90ħ下提取的DNA没有检测
到扩增条带,不宜使用㊂值得注意的是,本研究烘烤
处理时间统一设置为24h,其实,在以上提及的温度
中,烘干时间绰绰有余;温度高,烘干所需时间将减
少,较高烘烤温度烘干后及时取出,是否会提高
DNA的提取质量,仍需进一步研究㊂
基于PCR扩增目的进行的DNA大量提取,可
利用烘干法替代液氮冷冻法对水稻叶片进行制备,
依本试验验证,建议使用烘烤温度为50ħ;从干燥
箱取出,不宜长时间放置以免叶片吸水变软,影响研
55
河南农业科学第49卷
磨㊂烘干法所需设备易得,且具有操作简单㊁费用低廉及实用性强等诸多优点,既可少量操作,亦可批量进行,同时也弥补了液氮冷冻法操作复杂和费用较高等缺点,在DNA大量提取中具有较高的推广应用价值㊂
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