化学抑杀菌剂的效果评价报告

中央民族大学生命与环境科学学院
微生物综合性设计实验报告
2011年12月10日
姓 名： 马妍蓉 学 号： 1043027 年 级： 10级 专 业： 生物科学类 小组成员： 安妮 杨志梅 马得财 指导教师： 周宜君
化学抑杀菌剂的效果评价
——常用药的抑杀菌的效果评价
Evaluation of bactericide effect of chemical inhibition
——Suppressing drugs commonly used evaluation
of the effect of sterilization
化学抑杀菌剂的效果评价
——常用抗菌药物的抑杀菌活性检测与评价
作者：马妍蓉
单位：中央民族大学城市：北京市邮编：100081
摘要：目的在人们日常生活中常用到各种抗病原体药物，包括各种抗生素和中药类复方抗菌药物等，本实验拟选取常用三种西药抗生素和一种中药复方抗菌药物进行实验，测定所用药剂不同浓度对不同菌种的抑杀效果，进行常用药抑杀菌的效果评价。

方法检测化学抑杀菌剂的作用活性的方法，通过杯碟法（管碟法）、滤纸片法（琼脂扩散纸片法）、石炭酸系数法及生长曲线测定等方法鉴定不同抑杀菌剂的作用效果。

同时采用杯碟法（管碟法）、滤纸片法（琼脂扩散纸片法）还可以检测物品（如食品中）是否含有化学抑杀菌剂。

结果链霉素：由于对革兰氏阴性菌有抑菌作用，阳性菌不敏感，所以大肠杆菌抑菌圈会比较明显，而枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌抑菌圈会较小。

四环素：阳性菌对其比较敏感，会形成较大抑菌圈，而大肠杆菌则不会。

卡那霉素：大肠杆菌较敏感，会形成较大抑菌圈，而枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌则不会有大肠杆菌的效果。

结论不同药剂不同浓度对不同病原菌效果不同。

头孢拉定是一种很有效的抑杀菌剂，在很低浓度就对病原菌起到有效作用。

单从抑杀菌效果来看，西药比中药效果要好一些。

关键词：化学抑杀菌剂, 大肠杆菌, 白色葡萄球菌, 抑杀菌实验, 有效浓度
Evaluation of bactericide effect of chemical inhibition ——Suppressing drugs commonly used evaluation
of the effect of sterilization
Abstract:Objective Commonly used in daily life to a variety of drug resistant pathogens, including various antibiotics and traditional Chinese medicine-based combination anti-bacterial drugs, this study intends to select three kinds of western medicine commonly used antibiotics and antibacterial drugs, one kind of Chinese herbal compound experiments measured at different concentrations used in different pharmaceutical The inhibition effect of killing bacteria, drugs commonly used to evaluate the effect of suppressing bacteria.Methods the role of chemical fungicide or test method of activity, through the cups and saucers method (pipe disc method), filter method (AGAR diffusion paper method), ShiTanSuan coefficient method and the growth curve hist ochemical method appraisal of the effect of the different suppression of fungicide. At the same time the cups and saucers method (pipe disc method), filter method (AGAR diffusion paper method) can also be examined items (such as food) or whether it contains chemical fungicide.results:because of gram-negative bacteria have antibacterial effect, positive fungus not sensitive, so escherichia coli antibacterial circle will be more obvious, and bacillus subtilis and white staphylococcus antibacterial circle will be smaller. Tetracycline: positive fungus is more sensitive to its, will form a larger antibacterial circle, and e. coli is not. Kanamycin: escherichia coli is sensitive, will form a larger antibacterial circle, and bacillus subtilis and white staphylococcus aureus, escherichia coli won't
have the effect. Conclusion Different concentrations of different agents for different pathogens different results. Cephradine is a very effective suppression fungicide, at very low concentrations of pathogens play an effective role on the right. Bactericidal effect solely from the inhibition of view, western medicine is better than the effect of a number of traditional Chinese medicine.
Keywords: Chemical suppression fungicide, E. coli, Staphylococcus albus, suppression sterilization experiments, the effective concentration
前言
【研究背景】
日常生活中人们常用到各种抗病原体药物，包括各种抗生素和中药类复方抗菌药物等。

药店里各种中药西药里抗病原体类药物琳琅满目，各自的抑菌效果究竟如何、人们又应该如何选择仍然是个问题，为此，本实验小组进行了本次实验，拟对常用药进行抑杀菌的效果评价。

【研究目的】
本实验拟选取常用三种西药抗生素和一种中药复方抗菌药物进行实验，测定所用药剂不同浓度对不同菌种的抑杀效果。

进行常用药抑杀菌的效果评价。

【解决方法】
抗生素效价的测定是生产和药检部门都必须做的，测定方法都是严格按照国家药典规定的方法进行。

本实验使用的滤纸片法和国家药典中规定的管碟法相类似，先得出一个大致的有效浓度范围，然后继续在有效浓度范围中找出最小抑菌浓度，最后继续培养，判断药物是抑菌还是杀菌。

1.材料和方法
1.1 实验仪器
高压蒸汽灭菌锅，微波炉，恒温培养箱，分光光度计
1.2 实验材料
①牛肉膏蛋白胨培养基:
牛肉膏 1.5g
蛋白胨5g
Nacl 2.5g
琼脂9g
水500ml
pH 7.0-7.2
②几种常用药物：
A.链霉素（streptomycin）是一种氨基糖苷类药，经主动转运通过细菌细胞膜，与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体蛋白结合，干扰信息核糖核酸与30S亚单位间起始复合物的形成，抑制蛋白合成。

使DNA 发生错读，导致无功能蛋白质的合成；使多聚核糖体分裂而失去合成蛋白的功能，使大量氨基糖苷类物质进入菌体，细菌细胞膜断裂，细胞死亡。

链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、布鲁菌属、巴斯德杆菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对该品敏感。

链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。

各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对该品耐药。

B.卡那霉素是一种由卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)产生的氨基糖苷类抗生素，含三个组分：卡那霉素A、B和C，卡那霉素A为主要组分。

通过与30S核糖体亚单位结合而使细菌蛋白质合成发生错读。

大肠杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌对其敏感。

绿脓杆菌，革兰氏阳性菌（除金黄色葡萄菌外）、厌氧菌、非典型性分支杆菌、立克次体、真菌、病毒等对本品均耐药。

微生物对本品与其他氨基糖苷类药物间存在有一定的交叉耐药性。

C.四环素是从放线菌金色链球菌（Streptomyces aureofa-ciens）的培养液等分离出来的抗菌物质，四环素作用机制在于药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰－tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。

对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，是一种广谱抗菌素，对结核菌、变形菌等则无效。

四环素在高浓度条件下具杀菌作用。

对革兰氏阳性菌的作用优于革兰氏阴性菌，但肠球菌属对其耐药。

多年来由于四环素类的广泛应用,临床常见病原菌包括葡萄球菌等革兰阳性菌及肠杆菌属等革兰阴性杆菌对四环素多数耐药，并且,同类品种之间存在交叉耐药。

D.传统中药的抗菌活性
传统中药在维系人们的健康方面发挥重要的作用。

其中一些药物具有较强抗菌活性被人们所选用。

如双黄连（金银花、黄芩、连翘）是一种理想的抗病毒及细菌感染的中药新剂型，清热
解毒。

用于风热感冒发热，咳嗽，咽痛。

清热解毒口服液（含有石膏、知母、金银花、连翘、黄芩、栀子、龙胆、板蓝根、甜地丁、玄参、地黄、麦冬），为感冒类非处方药药品，清热解毒。

用于热毒壅盛所致发热面赤，烦躁口
渴，咽喉肿痛等症；流感、上呼吸道感染等。

黄连素是一种重要的生物碱，是我国应用很久的中药。

可从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取。

它具有显著的抑菌作用。

常用的盐酸黄连素又叫盐酸小檗碱。

黄连素能对抗病原微生物，
对多种细菌如痢疾杆菌、结核杆菌、肺炎球菌、伤寒杆菌及白喉杆菌等都有抑制作用，其中对
痢疾杆菌作用最强，常用来治疗细菌性胃肠炎、痢疾等消化道疾病。

临床主要用于治疗细菌性
痢疾和肠胃炎，它无抗药性和副作用。

③实验菌种：大肠杆菌，白色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，由中央民族大学生命与
环境科学学院微生物实验室提供。

④其它：滤纸片150个(直径6mm) ,移液枪和移液管，涂布棒，接种环，培养
皿（80个），试管及试管塞（12套）。

1.3试验方法
1.3.1菌悬液的制备
将6支装有培养基的已灭菌的试管拉斜面，斜面划线接种实验室提供的菌种，进行扩繁，每个菌种各2个斜面，然后恒温37℃培养24h。

扩繁后，刮下剩余菌种，尽可能的刮下斜面上的菌种，放入灭菌后的一支10ml的生理盐水中，以保持平板接种过程中，菌种浓度的一致
1.3.2涂布法接种
涂布法接种是一种常用的接种方法，每个培养基上接种定量的菌悬液，可以使培养基表面形成菌苔，用于检测化学因素对于微生物生长的抑杀作用。

1.3.3滤纸片法
利用滤纸对于不易挥发的化学药剂的吸附效用，通过移液枪使每个滤纸片上携带定量的药物溶液，贴负在培养基上，滤纸所携带的药剂就会渗透入培养基，对培养基上菌种有抑杀作用的药剂就会抑制菌的繁殖，从而形成菌的“真空带”，即抑菌圈。

统计计算抑菌圈的直径，抑菌圈直径大越大，该消毒剂的杀菌能力越强，进行各药剂抑杀菌效果的分析。

要注意保持滤纸片大小一致（6mm）、滤纸片吸附量一致（以移液器量取）、菌量控制合适能够形成菌苔。

1.3. 4 杯碟法
适用条件——不易挥发的化学药剂
工作原理——将牛津杯放置于含有待检测菌种的平板上，将试验药剂加入牛津杯中（200μL）,当药剂在琼脂中扩散，在不同浓度下对细菌的抑菌效力不同，产生可见的抑菌圈。

测定抑菌圈直径大小，抑菌圈直径大越大，该药剂的杀菌能力越强
注意事项——牛津杯放置要平。

加药剂量一致（以移液器量取）
菌量控制合理，以形成菌苔（107-109cfu/mL)
操作方法——平板的制作与接种方法:
1.取10-15mL培养基倒平板；取5mL培养基（46-55℃）与0.2mL菌悬液混合后到在已经制
好的平板上；
2.取15mL培养基倒平板，取0.2mL菌悬液涂布法接种。

3.放置牛津杯方法：将无菌的牛津杯放置于平板上，使底与平板紧密接触。

4.加药剂方法：以移液器取200μL（此为最高用量）加入牛津杯中。

5.37℃24h正置培养，观察测量抑菌圈直径。

2.结论
2. 1滤纸片法和杯碟法的比较及确定抑菌范围结果
2.1. 1滤纸片法和杯碟法的比较及确定抑菌范围结果图
图1滤纸片法和杯碟法比较不同浓度的抗生素对各菌种的作用效果
注：
A四环素（A1 100ug/mL,A2 50ug/mL,A3 25ug/mL,A4 12.5ug/mL,A5 6.25ug/mL）
B链霉素（B1 100ug/mL,B2 50ug/mL,B3 25ug/mL,B4 12.5ug/mL,B5 6.25ug/mL）
C卡那霉素（C1 100ug/mL,C2 50ug/mL,C3 25ug/mL,C4 12.5ug/mL,C5 6.25ug/mL)
E清热解毒口服液（20uL）
D生理盐水
2.1. 2滤纸片法和杯碟法的比较及确定抑菌范围结果表
白色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌
滤纸片法杯碟法滤纸片法杯碟法滤纸片法杯碟法A1 10.0,9.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 11.0,10.0 6.0,6.0
A2 6.0,6.2 7.4,8.0 7.0,8.0 6.0,6.0 9.0,8.0 11.0,12.5 A3 6.0,6.0 6.0,6.0 8.9,10.0 6.0,6.0 8.0,7.8 11.5,11.5 A4 6.0,6.0 6.0,6.0 9.8,9.0 6.0,6.0 7.0,7.0 6.0,6.0
A5 6.0,6.0 13.0,10.5 8.5,6.7 8.5,8.0 7.0,6.8 9.0,11.0 B1 14.8,15.2 18.5,17.5 13.0,14.0 15.6,15.0 22.0,17.0 22.0,6.0 B2 14.5,14.0 7.0,8.5 6.0,6.7 13.5,14.0 17.0,14.5 11.0,13.0 B3 14.8,15.5 13.0,6.0 12.9,13.0 6.0,15.0 14.0,15.5 16.0,15.5 B4 8.0,7.8 6.0,6.0 8.0,8.0 6.0,6.0 10.0,9.5 11.0,12.5 B5 6.0,6.0 17.5,20.0 9.2,9.0 12.5,11.0 13.5,15.5 8.5,9.0
C1 9.4,9.2 6.0,6.0 7.0,7.2 6.0,6.0 8.5,9.0 6.0,6.0
C2 8.2,7.2 8.0,7.2 6.0,6.0 6.0,6.0 7.5,7.0 6.0,6.0
C3 6.2,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0
C4 6.0,6.0 6.0,6.0 8.7,8.9 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0
C5 6.0,6.0 9.5,10.2 8.5,8.0 10.0,11.2 8.5,8.0 11.0,11.2
E 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.8 6.0,7.2 7.0,6.0 6.0,6.8
D 6.0,6.2,6.0,6.0,6.0,6.0 6.0,6.2,6.0,6.0,6.0,6.0 6.0,6.0,6.3,6.4,6.0,6.0
表1滤纸片法和杯碟法的比较及确定抑菌范围结果表
注：
A四环素（A1 100ug/mL,A2 50ug/mL,A3 25ug/mL,A4 12.5ug/mL,A5 6.25ug/mL）
B链霉素（B1 100ug/mL,B2 50ug/mL,B3 25ug/mL,B4 12.5ug/mL,B5 6.25ug/mL）
C卡那霉素（C1 100ug/mL,C2 50ug/mL,C3 25ug/mL,C4 12.5ug/mL,C5 6.25ug/mL)
E清热解毒口服液（20uL）
D生理盐水
2.2.1 滤纸片法和杯碟法确定最小抑菌浓度图
图2滤纸片法确定三种抗生素最小抑菌浓度
注：
A四环素（A1 50ug/mL A2 40ug/mL A3 30ug/mL）
B链霉素（B1 6.25ug/mL B2 3.125ug/mL）
C卡那霉素（C1 10ug/mLC2 8.5ug/mL C3 6.5ug/mL）
E清热解毒口服液（E1 40uL E2 60uL E3 80uL）
D 生理盐水
图3 杯碟法确定三种抗生素和中药对三种菌的的最小抑菌浓度
注：
A四环素（A1 50ug/mL A2 40ug/mL A3 30ug/mL）
B链霉素（B1 6.25ug/mL B2 3.125ug/mL）
C卡那霉素（C1 10ug/mLC2 8.5ug/mL C3 6.5ug/mL）
E清热解毒口服液（E1 40uL E2 60uL E3 80uL）
D 生理盐水
图4滤纸片法确定三种抗生素和中药对大肠杆菌的最小抑菌浓度注：
A四环素（A1 50ug/mL A2 40ug/mL A3 30ug/mL）
B链霉素（B1 6.25ug/mL B2 3.125ug/mL）
C卡那霉素（C1 10ug/mLC2 8.5ug/mL C3 6.5ug/mL）
E清热解毒口服液（E1 40uL E2 60uL E3 80uL）
D 生理盐水
图5 杯碟法确定三种抗生素和中药对白色葡萄球菌的最小抑菌浓度
注：
A四环素（A1 50ug/mL A2 40ug/mL A3 30ug/mL）
B链霉素（B1 6.25ug/mL B2 3.125ug/mL）
C卡那霉素（C1 10ug/mLC2 8.5ug/mL C3 6.5ug/mL）
E清热解毒口服液（E1 40uL E2 60uL E3 80uL）
D 生理盐水
图6杯碟法确定同一浓度的三种抗生素对三种菌的最小抑菌浓度的抑制效果
注：
A四环素(A1 50ug/mL )B 链霉素(B1 6.25ug/mL )C卡那霉素(C1 10ug/mL)D生理盐水
2.2. 2滤纸片法和杯碟法确定最小抑菌浓度表
白色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌
滤纸片法杯碟法
滤纸片
法
杯碟法
滤纸片
法
杯碟法
A1 6.0,6.0 7.0,7.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.5,6.0 6.0,6.0
A2 6.0,6.0 6.9,7.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0
A3 6.0,6.0 6.5,6.3 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0
B1 6.9,6.0 12.2,11.3 6.0,6.0 7.3,7.2 8.0,7.9 8.0,8.0
B2 6.0,6.0 6.3,6.7 6.0,6.0 7.0,6.5 7.2,7.6 8.3,7.0
C1 6.0,6.0 6.5,6.3 6.0,6.0 6.1,6.2 6.0,6.0 9.0,8.5
C2 6.0,6.0 6.7,6.6 6.0,6.0 6.1,6.3 6.0,6.0 7.8,7.5
C3 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 7.3,7.2
E1 6.0,6.0 7.1,7.0 6.0,6.0 7.8,8.3 6.0,6.0 10.0,9.0
E2 6.0,6.0 7.0,7.1 6.0,6.0 10.0,11.0 6.0,6.0 12.0,12.1
E3 6.0,6.0 7.3,7.2 6.0,6.0 12.0,12.3 6.0,6.0 12.0,11.8
D 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0 6.0,6.0
表2 滤纸片法和杯碟法的三种抗生素及中药的最小抑菌浓度
注：
A四环素（A1 50ug/mL A2 40ug/mL A3 30ug/mL）
B链霉素（B1 6.25ug/mL B2 3.125ug/mL）
C卡那霉素（C1 10ug/mLC2 8.5ug/mL C3 6.5ug/mL）
E清热解毒口服液（E1 40uL E2 60uL E3 80uL）
D 生理盐水
2.3. 1观察三种抗生素以及清热解毒口服液对不同菌种的作用效果是抑制其生长还是杀灭作用：
观察我们组的用滤纸片法培养24H的结果知，
枯草芽孢杆菌：A1（50ug/ml的四环素）和A2(40ug/ml的四环素)的抑菌圈内没有再次生长出菌落，但A3（30ug/ml的四环素）的抑菌圈内发现再次长出了稀疏的枯草芽孢杆菌。

B1（6.25ug/ml的链霉素）与B2(3.125ug/ml的链霉素)的抑菌圈内没有再次生长出菌落； C1(10ug/ml的卡那霉素)与C2(8ug/ml的卡那霉素)的抑菌圈内没有再次生长出菌落，而
C3(6ug/ml的卡那霉素)的抑菌圈内再次长出极少的菌落。

白色葡萄球菌：A1（50ug/ml的四环素）与A2(40ug/ml的四环素)、A3（30ug/ml的四环素）都没有再次长出菌落。

B1（6.25ug/ml的链霉素）与B2(3.125ug/ml的链霉素)的抑菌圈内没有再次生长出菌落
C1(10ug/ml的卡那霉素)没有再次生长出菌落，而剩下的C2(8ug/ml的卡那霉素)、C3(6ug/ml的卡那霉素)都隐约观察到有极少的菌落生长。

大肠杆菌：A1（50ug/ml的四环素）与A3（30ug/ml的四环素）内没有发现有新菌落生成。

但在A2(40ug/ml 的四环素)内发现有极少数的菌落生成。

B1（6.25ug/ml的链霉素）内没有菌落生成，B2(3.125ug/ml的链霉素)内发现有新菌落生成。

讨论
3．1 滤纸片法
经过24h的培养，通过对抑菌圈大小的测量和比较了解到，三种抗生素对三种菌都有明显的抑制效果，抑菌圈直径分布在10~30mm之间，直径与药剂浓度呈正相关，其中链霉素效果最明显，而它们对白色葡萄球菌的抑制作用更好一些。

而中药的清热解毒口服液几乎没有抑菌圈出现，说明西药能在短时间内发挥药效，比中药效果好，如果想在短时间内消灭致病菌，最好选择西药抗生素，在人体能接受的条件下，适当加大剂量可增加药效。

3. 2实验反思
滤纸片实验中，大肠杆菌的抑菌圈均没有测量出数据，原因是在实验过程中，由于对移液枪的错误使用，使加入到培养基中的菌悬液超出实验所设计的加入的量，在对涂有大肠杆菌的平板贴滤纸片时，培养基表面还有大量的菌悬液，造成滤纸片无法吸收药品溶液。

致使在在观察抑菌圈时，无法有效测量抑菌圈直径。

结论
①不同药剂不同浓度对不同病原菌效果不同;
②单从抑杀菌效果来看，西药比中药效果要好一些。

致谢：
衷心感谢周宜君老师为我们提供充分的理论课基础，感谢刘越老师对我们实验的全程指导，感谢戴老师不辞辛苦的为我们准备各种所需物品，感谢学院为我们提供条件良好的实验设施，帮助我们打下良好的实验动手能力，培养了对科学探索一丝不苟的精神，让实验课真正实现了价值！
Thanks，
Thank ZhouYijun teacher provide adequate theory foundation for we; thank LiuWei teacher give the guidance in our experiment in the whole process;thanks to Miss Dai prepare all items required for us; thank our college provide conditions and good experimental facilities for we , help us lay a good experimental ability, our scientific exploration meticulous spirit has been trianed . let experiment to achieve a truly value!
参考文献
【1】徐文静等，吉林农业科学2008，33(3)：50—54
【2】 [英]S.P.德尼尔 N.A.霍奇、S.P.戈尔曼编，司书毅，洪斌，余利岩主译 ,《药物微生物学》，化学工业出版社，2010.10 163—179
(2).关于杯碟法
适用条件——不易挥发的化学药剂
工作原理——将牛津杯放置于含有待检测菌种的平板上，将试验药剂加入牛津杯中（200μL）,当药剂在琼脂中扩散，在不同浓度下对
细菌的抑菌效力不同，产生可见的抑菌圈。

测定抑菌圈直径大小，
抑菌圈直径大越大，该药剂的杀菌能力越强
注意事项——牛津杯放置要平。

加药剂量一致（以移液器量取）
菌量控制合理，以形成菌苔（107-109cfu/mL) 操作方法——平板的制作与接种方法:
1.取10-15mL培养基倒平板；取5mL培养基（46-55℃）与0.2mL菌
悬液混合后到在已经制好的平板上；
2.取15mL培养基倒平板，取0.2mL菌悬液涂布法接种。

3.放置牛津杯方法：将无菌的牛津杯放置于平板上，使底与平板紧密接
触。

4.加药剂方法：以移液器取200μL（此为最高用量）加入牛津杯中。

5.37℃24h正置培养，观察测量抑菌圈直径。

7、关于菌液的浓度测定
采用比浊法测定：在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度呈反比，与光密度呈正比。

而光密度或透光度可以通过光电池测出。

采用倾注法或涂布法进行活菌计数
三、实验材料、仪器
材料：大肠杆菌，白色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌（浓度：107—109CFU/ mL ，
或者OD=0.65—1.0 ），滤纸(d=6mm)
培养基：营养琼脂培养基
仪器：分光光度计，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱，鼓风干燥箱箱，酒精灯，
打孔器，捈布棒，移液器，牛津杯，试管，三角瓶，无菌平板，
试剂：无菌生理盐水，链霉素100µg/mL，四环素100µg/mL，卡那霉素
100µg/mL，清热解毒口服液
四、实验步骤
1.培养基的配制：称量，溶解，灭菌
营养琼脂培养基
2：打孔几十个。

3：梯度稀释、添加抑菌剂
一、抗生素的稀释：
四环素，硫酸链霉素，卡那霉素
二倍稀释：100µg/mL，50µg/mL，25µg/mL，12.5µg/mL，6.25µg/mL 4：接种：
进行菌悬液的制备，用分光光度计测定其吸光度在0.65-1之间（600nm）。

涂布法进行接种，接种量0.2ML，贴滤纸片，杯碟法都选择40uL抑菌剂。

关于平行和对照的设计
每个浓度梯度设置二个平行试验，以等量生理盐水进行对照试验。

二、PH梯度调节：
PH：选20ug/ml
PH选5、6、7、8、9进行最适PH的选取。

①滤纸片法：吸附药剂剂量40μL，可以2-4片叠加；也可以在相应的溶液中
浸泡过夜；滤纸片要风干后贴在平板上
②杯碟法：每个小叠内盛放试剂40μL
三，静置培养24h,培养后进行结果观察。

2.观察结果：
1：测定抑菌圈直径的大小并确定最低药物作用浓度
采用滤纸片法测定，以出现的最小抑菌圈的浓度作为MIC。

采用涂布法测定，将不同浓度药液加入培养基中（确定终浓度），涂
布法接种，以不能出现菌落的最低药液浓度作为MIC。

2：是抑制细菌生长还是杀灭作用
取出滤纸片后，继续培养看是否有细菌生长。

3：采用t 检验方法比较任意两组的差异显著性用图和表的形式反映实验的结果。

结果判定——以直径为6mm为标准：
①以抑菌圈直径>7mm，为有抑制细菌作用；
②若抑菌圈直径<10mm，为低度敏感药物；
③若抑菌圈直径为10—15mm，为中度敏感药物；
④若抑菌圈直径>15mm，为高度敏感药物。

生长抑制率
抑制率（%）=（试验组抑菌圈直径-对照组抑菌圈直径）/对照组抑菌圈直
径×100%
五：实验预测
根据标准值进行预测
链霉素：由于对革兰氏阴性菌有抑菌作用，阳性菌不敏感，所以大肠杆菌抑菌圈会比较明显，而枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌抑菌圈会较小。

四环素：阳性菌对其比较敏感，会形成较大抑菌圈，而大肠杆菌则不会。

卡那霉素：大肠杆菌较敏感，会形成较大抑菌圈，而枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌则不会有大肠杆菌的效果。

参考文献
【1】徐文静等，吉林农业科学2008，33(3)：50—54
【2】[英]S.P.德尼尔N.A.霍奇、S.P.戈尔曼编，司书毅，洪斌，余利岩主译,《药物微生物学》，化学工业出版社，2010.10 163—179。