免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测培训ppt课件

人淋巴细胞比重： 1.070 淋巴细胞分层液： 1.077 人红细胞比重： 1.092
免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测
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稀释的血液
分层液
离心前
离心后
稀释的血浆
单个核细胞 分层液 粒细胞 红细胞
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免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测
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＊离心时要配平 ⑵ 另取一支滴管， 仔细吸出位于血浆和分离液之
免疫学补体参和反应T 细胞数量和其功能检
测
Part I 补体参与的反应
补体的溶血反应
Part II T细胞数量及其功能检测 E花环形成试验－－数量测定 淋巴细胞转化试验： 功能
形态学方法 3H—TDR掺入法 MTT比色法
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复习
MBL
Part I 补体参与的反应
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6.高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花 环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E 花环阳性。
正常参考值： EtRFC ：64.4±6.7％； EaRFC ：23.6±3.5％； EsRFC ：3.3±2.6％
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1．抗原： 2%绵羊红细胞； 2．抗体(溶血素)； 3．补体：健康豚鼠新鲜血清 4 ．生理盐水、 24孔板等。
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步骤
1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、将24孔板放在37℃温箱内15-30min，观察并记录结果。
孔号 SRBC 溶血素 补体 NS
1
3滴

3滴
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结果
T 淋巴细胞
SRBC
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淋巴细胞转化试验 －－
原理 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原( 如PHA 、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代 谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大 并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现 象。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞 免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。
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第4次 实验课内容
1. 免疫标记技术： ELISA 2. 免疫病理实验 3. 实验课考试
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3滴 3滴
2
3滴
3滴
－ 6滴
3
3滴
－
3滴 6滴
4
3滴
－
－ 9滴
结果:
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Part II T细胞数量及其功能检测
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2.E花环形成试验 原理
• 人外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞 (SRBC)表面糖肽相结合的受体－E受体(CD2分子) ，可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有 的表面标志。
正常参考值： 80％
未转化淋巴细胞 转化的淋巴细胞 红细胞
淋巴细胞转化实验 瑞氏染色 10×40
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3H—TDR掺入法 －－－淋巴细胞转化试验
T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生 有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中 加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TDR)，可 以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁 计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖 程度。
. 三种方法
– 形态学方法、 3H-TdR掺入法、 MTT比色法
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形态学方法：〔镜下观察〕 －－－淋巴细胞转化试验
根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构 造与核仁的有无。
成熟小淋巴细胞： 核染色深、没有核仁，胞浆少、染色
为轻度嗜碱性；
过渡型淋巴细胞： 大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，
胞浆比较多，但是出现核仁；
淋巴母细胞： 体积增大，形态不规则，核变大、核质染
色疏松，有核仁1－2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；
其他细胞： 中性粒细胞在培养72消失后，绝大部分衰变
或死亡呈碎片。
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• 淋巴细胞转化率：
转化的淋巴细胞
×100％
转化的淋巴细胞＋未转化的淋巴细胞
补体激活的三条途径
途 径
IC+C1q
MBL+病原体配基 细菌+C3
膜攻击复合物
细胞溶解
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1.补体的溶血反应
原理
绵羊红细胞(SRBC )作为抗原与其相应抗体 (溶血素) 结合后，通过经典途径激活补体， 产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生 溶血反应。
u材 料
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MTT
Formazan
Insoluble
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实验报告
1. 补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。 2. E花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察
结果。 3. 绘制淋巴细胞转化试验(形态学法)镜下观察
结果。
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间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液 的试管→→→2000rpm离心5mins 。 (3)弃上清(倾倒时液体不要回流)，将沉淀的淋 巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml ，重复离心两 次。
2.弃去上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液 (约0.1ml) 与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合(分 清枪头) →→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。
• 检测T细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况 。
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步骤：
(动作轻柔；分清滴管及枪头！！！)
1.淋巴细胞悬液的制备：
⑴取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血3ml，用
滴管贴管壁(倾斜30°)轻轻叠加于3ml分离液上
(界面要清晰)
→→→
配平后
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13mins。
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3. 取出试管， 500rpm离心5mins。(注意此步非常 关键， 转速一定要慢，一启动即关，来回数次即 可) ,室温静置2-3mins
4. 吸去100-150ul上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴 加1滴(50ul)戊二醛，轻轻混匀静置5mins。
5. 取一滴(25ul)液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染 液，加盖玻片。
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MTT比色法 －－－淋巴细胞转化试验
MTT为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖 时通过线粒体能量代谢，将MTT代谢成蓝紫色 的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的 量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异 丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程 度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。