利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910647121.8
(22)申请日 2019.07.17
(71)申请人 福州大学
地址 350108 福建省福州市闽侯县上街镇
福州大学城学院路2号福州大学新区
(72)发明人 陈宪　李璟　
(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人 饶文君　蔡学俊
(51)Int.Cl.
G01N 27/327(2006.01)
G01N 33/574(2006.01)
G01N 33/53(2006.01)
C12Q 1/6825(2018.01)
(54)发明名称利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法(57)摘要本发明公开了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，利用了DNA与RNA碱基互补配对原则，首先，设计了具有发夹结构的功能探针，当目标物（待测样品microRNA）存在时，特异性核酸内切酶（DSN酶）切割DNA -RNA杂交体的DNA部分得到8-17DNAzyme。

然后，8-17DNAzyme能特异性识别固定在电极表面的H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点进行切割。

最后，电极表面被DNAzyme特异性切割后与电极表面相连的DNA序列依次与序列Link1、Link2、H3和H4自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。

所建立的方法灵敏度高，可用于复杂体系
的microRNA的直接检测。

权利要求书2页 说明书6页序列表2页 附图3页CN 110274941 A 2019.09.24
C N 110274941
A
1.一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1；双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分， H1探针被切割得到游离的8-17DNAzyme序列，而microRNA被释放出来继续与未反应H1探针杂交循环切割，实现第一次目标循环；然后将发夹探针H2固定在金电极上；当金属离子存在时，前述8-17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大；电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链；最后，六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对microRNA的超灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）针对目标microRNA设计双功能探针H1，所述探针为发夹结构的DNA探针；设计固定在电极表面的探针H2，该发夹探针5'端修饰巯基；
（2）双特异性核酸内切酶（DSN酶）特异性切割：将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min；使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，得到8-17DNAzyme序列，并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割，实现目标循环放大；其中DSN缓冲液包含：0.2U DSN，50 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1 mM DTT，pH 8.0；
（3）电极预处理：将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡，然后依次用0.3μm 和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨，然后用超纯水冲洗干净，分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，直到在0.95V 出现一个尖锐的还原峰，在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰，用超纯水冲洗电极，氮气吹干，备用；食人鱼溶液为98％硫酸和30％双氧水按3：1的体积混合；
（4）捕获探针H2的固定：在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP、pH 8.0的10mM Tris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液，得到捕获探针H2固定液；将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面，室温孵育120min，H2可通过S-Au键固定在电极表面，再用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；
（5）电极表面空白位点封闭：将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤（4）所得电极表面，室温孵育120min，封闭电极表面的非特异性活性位点，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；
（6）8-17DNAzyme的切割循环：将步骤（2）微量离心管中的溶液滴加于步骤（5）处理好的电极表面，孵育90min，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，氮气吹干；
（7）DNA自组装电化学生物传感器的构建：将步骤（6）得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后，依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液，10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液，10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液，分别反应90min、90min和120min，超纯水冲洗，氮气吹干；
（8）电化学检测microRNA信号：将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气，再将步骤（7）所得电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描
检测。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针H1序列为：CACCCACTACCCATCTTT ACCAGACAGTGTTACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTG；
所述探针H2为：SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2TTTTTCCACCACATTCAAATTCACCAACTATrAGGAAGAGA TGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述Link1序列为：CCA ACTAAC CCCATATAGTTGGTGAAT；
所述Link2序列为：ATGGGGTTAGTT GGATCGCCT CATACTGTCTCAAGG ACCACCGCAT；
所述H3序列为：TCTCAAGGACCACCGCAT CTCTAC ATGCGGTGGTCCTTGAGA CAGTATGAG GCG A；
所述H4序列为：GTAGAG ATGCGGTGGTCCTTGAGA TCGCCT CATACTG TCTCAAGGACCACCGCAT。

4.如权利要求1或2所述方法制备获得电化学生物传感器。

5.如权利要求4所述电化学生物传感器用于microRNA的检测。

利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备
方法
技术领域
[0001]本发明涉及电化学检测技术领域，具体提供了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法。

背景技术
[0002]microRNA是一种小的非蛋白编码RNA分子，通过与靶mRNA中的合成序列结合，从而抑制转录后基因表达。

microRNA在许多生物学过程中发挥着重要的作用，并与各种疾病，尤其是癌症相关。

microRNA被认为是癌症诊断、预后和治疗监测的潜在生物标志物。

因此，开发灵敏度高、选择性好的检测策略是生物医学研究的迫切需求，尤其是对癌症的早期诊断和药物新靶点的发现有重要意义。

[0003]目前，microRNA的传统检测方法主要有三种，定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、诺瑟杂交（Northern blot）和高通量测序。

qRT-PCR方法基于基因扩增阳离子技术，具有较高的检测灵敏度，但由于抑制剂、热误差和标本间交叉污染等直接影响检测结果的准确性，限制了qRT-PCR的进一步应用。

而northern blotting和高通量测序，则需要进行一系列复杂的操作，耗时长，且检测灵敏度较低。

[0004]本发明公开了一种超灵敏的检测方法，利用双特异性核酸内切酶及和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测。

发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种利用双特异性核酸内切酶（DSN酶）和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法，并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测方法。

所述方法是通过便捷，灵敏的信号放大策略，利用特异性核酸内切酶（DSN酶）和DNAzyme的特异性切割后进行DNA自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。

所建立的方法具有高的灵敏度，可用于复杂体系的microRNA的直接检测。

[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
包括以下步骤：首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1；双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，H1探针被切割得到8-17DNAzyme序列，而microRNA被释放出来继续与未反应的H1探针杂交循环切割，实现第一次目标循环；然后将发夹探针H2固定在金电极上；当金属离子存在时，前述8-17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割，H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大；电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链；最后，六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上，通过检测六氨合钌的电化学信号，实现对microRNA的超灵敏检测。

[0007]具体步骤为：
（1）针对目标microRNA设计功能探针H1，所述探针为发夹结构的DNA探针，序列结构为从5'端到3'端依次为颈部1、环部1、环部2、环部3、颈部2序列。

所述的第一部分为自由序列颈部1和环部1序列，所述的第二部分环部2为能特异性识别目标microRNA并与之杂交的序列，所述第三组成部分环部3和颈部2碱基序列为8-17DNAzyme，能在金属Mg2+离子存在时，特异性识别固定在电极表面的捕获探针H2（该发夹探针5'端修饰巯基）并切割序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点。

[0008]（2）双特异性核酸内切酶（DSN酶）特异性切割：将6μL含有不同浓度microRNA的DSN 缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min（其中DSN缓冲液包含：0.2U DSN，50 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1 mM DTT，pH 8.0），使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分，得到8-17DNAzyme序列，并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割，实现目标循环放大。

[0009]（3）电极预处理：将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液（98％硫酸和30％双氧水按3：1的体积混合）浸泡，然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨，然后用超纯水冲洗干净，分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，直到在0.95V左右出现一个尖锐的还原峰，在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰，用超纯水冲洗电极，氮气吹干，备用。

[0010]（4）捕获探针H2的固定：在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的pH 8.0、10mM Tris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液，得到捕获探针H2固定液。

将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面，室温孵育120min，H2可通过S-Au键固定在电极表面，再用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干。

[0011]（5）电极表面空白位点封闭：将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤（4）所得电极表面，室温孵育120min，封闭电极表面的非特异性活性位点，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干。

[0012]（6）8-17DNAzyme的切割循环：将步骤（2）微量离心管中的溶液滴加于步骤（5）处理好的电极表面，孵育90min，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，氮气吹干。

步骤（2）反应得到的8-17DNAzyme序列可以在金属Mg2+离子存在时，特异性识别固定在电极表面的H2探针形成杂交体，切割H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点， H2探针被切断成两部分，一部分与电极相连，一部分为游离的碱基序列，不再与8-17DNAzyme结合，游离的8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面H2探针，实现第二次循环放大。

[0013]（7）DNA自组装电化学生物传感器的构建：电极表面的H2被DNAzyme切断后，依然有部分碱基序列固定在电极表面上，这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装，形成一条dsDNA链。

具体操作是将步骤（6）得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后，依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液，10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液，10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液，分别反应90min、90min和120min，超纯水冲洗，氮气吹干。

[0014]（8）电化学检测microRNA信号：将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气，步骤（7）所得电极置于电化学工作检测液中，电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描。

[0015]DNA预处理：所有探针在使用前要经过预处理。

处理方法为将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到DNA浓度为100μM的溶液，再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。

具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min，然后插入冰中半小时，使探针形成发夹结构。

[0016]双功能探针H1溶液的制备：5μL 10μM的H1探针溶液溶于5μL 的含200mM NaCl的pH 8.0 100 mM Tris-HCl缓冲液。

疏基己醇溶液的制备：取疏基己醇加至超纯水中，制成2mM的疏基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用。

[0017]杂交探针缓冲液的制备：将0.5μL 10μM、的H3探针溶液和0.5μL 10μM的H4探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0018]连接探针Link1缓冲液的制备：将1μL 10μM的Link1探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2的pH 8. 0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0019]连接探针Link2缓冲液的制备：将1μL 10μM的Link2探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0020]DSN缓冲液：0.2U DSN （DSN酶溶于50% DSN storage buffer和50%甘油 ）、50 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1 mM DTT，pH 8.0。

[0021]电化学检测液的制备：pH 8.0的10mM Tris-HCl中含有10μM六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用。

[0022]电化学工作站为CHI660C，采用三电极系统，工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极。

冲洗电极所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

[0023]本发明所用试剂均市售可得。

[0024]本发明适用于肿瘤细胞中microRNA-141的检测。

[0025]本发明的优点在于：
本发明提供的一种利用双特异性核酸内切酶（DSN酶）和DNAzyme切割循环的DNA自组装电化学生物传感器制备方法，巧妙设计实验方案，将生物信号转化为电化学信号，实现对目标物检测信号的多次放大，microRNA的检测限低至1fmol，实现了对肿瘤标志物microRNA-141的高灵敏检测。

该检测方法具有高度的选择性，具有广阔的应用前景，具有高度特异性。

附图说明
[0026]图1.为本发明的构建流程示意图。

[0027]图2.为实施例中不同浓度目标物的电流响应。

[0028]图3.为实施例中不同浓度目标物的电流响应标准曲线图。

[0029]图4.为分析方法的特异性(a)空白、 (b) microRNA -200a、 (c) microRNA -429、 (d)单碱基错配的microRNA -141和(e) microRNA -141的选择性。

具体实施方式
[0030]实施例1、检测待测样品中是否含有microRNA -141
图1为本发明的构建流程示意图
下面实施例采用microRNA -141为待测microRNA，microRNA -141的核苷酸序列为UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG。

[0031]一、待测样品
本发明的实施例采用的是浓度为1fM至10pM的一系列溶液作为待测样本，本发明的待测样本也可以来源于血浆或血清，具体方法如下：
所有电化学检测均在 CHI660C 电化学工作站上进行。

三电极系统包括：完成 DNA 自组装的金电极（工作电极），铂丝电极（对电极），银-氯化银（Ag/AgCl ）参比电极。

电化学检测在六氨合钌（RuHex ）溶液中进行。

先将 RuHex 溶液通氮除氧 15 min，再将完成组装的电极浸泡其中2 min，使溶液中带正电的 RuHex通过静电作用吸附到带负电荷的 DNA 磷酸骨架上。

然后用方波伏安法进行扫描，扫描电位范围-0.6 ~ 0 V，脉冲幅度 0.05 V，脉冲宽度 0.05 s。

[0032]二、一种利用双特异性核酸内切酶（DSN酶）和DNAzyme切割循环的DNA自组装电化学生物传感器制备检测microRNA -141的方法
（1）针对目标microRNA设计双功能探针H1，所述探针为发夹结构的DNA探针；设计固定在电极表面的探针H2，该发夹探针5'端修饰巯基；
（2）双特异性核酸内切酶（DSN酶）特异性切割：将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min；使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA -RNA杂交的DNA部分，得到8-17DNAzyme序列，并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割，实现目标循环放大；其中DSN缓冲液包含：0.2U DSN，50 mM Tris -HCl，10mM MgCl 2，1 mM DTT，pH 8.0；
（3）电极预处理：将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡，然后依次用0.3μm 和0.05 μm的Al 2O 3粉末在抛光绒布打磨，然后用超纯水冲洗干净，分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后将电极置于0.5M的H 2SO 4溶液中，在-0.35-1.6V电位下扫描，直到在0.95V 出现一个尖锐的还原峰，在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰，用超纯水冲洗电极，氮气吹干，备用；食人鱼溶液为98％硫酸和30％双氧水按3：1的体积混合；
（4）捕获探针H2的固定：在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP、pH 8.0的10mM Tris -HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液，得到捕获探针H2固定液；将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面，室温孵育120min，H2可通过S -Au键固定在电极表面，再用10mM pH 8.0的Tris -HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；
（5）电极表面空白位点封闭：将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤（4）所得电极表面，室温孵育120min，封闭电极表面的非特异性活性位点，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；
（6）8-17DNAzyme的切割循环：将步骤（2）微量离心管中的溶液滴加于步骤（5）处理好的电极表面，孵育90min，用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，氮气吹干；
（7）DNA自组装电化学生物传感器的构建：将步骤（6）得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后，依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液，10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液，10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液，分别反应90min、90min和120min，超纯水冲洗，氮气吹干；
（8）电化学检测microRNA信号：将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气，再将步骤（7）所得电极置于电化学检测液中，电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描检测。

[0033]DNA预处理：所有探针在使用前要经过预处理。

处理方法为：将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm，离心5min，加入适量默克水，得到DNA浓度为100μM的溶液，再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。

具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min，然后插入冰中半小时，使探针形成发夹结构。

[0034]双功能探针H1溶液的制备：5μL 10μM的H1探针溶液溶于5μL 的含200mM NaCl的pH 8.0 100 mM Tris-HCl缓冲液。

[0035]捕获探针H2固定液的制备：将含有1μL10μM的H2探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0036]疏基己醇溶液的制备：取疏基己醇加至超纯水中，制成2mM的疏基己醇封闭剂，冰箱4℃保存，备用。

[0037]杂交探针缓冲液的制备：将0.5μL 10μM的H3探针溶液和0.5μL 10μM的H4探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0038]连接探针Link1缓冲液的制备：将1μL 10μM的Link1探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2的pH 8. 0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0039]连接探针Link2缓冲液的制备：将1μL 10μM的Link2探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2 的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。

[0040]DSN缓冲液：0.2U DSN （DSN酶溶于50% DSN storage buffer和50%甘油 ）、50 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1 mM DTT，pH 8.0。

[0041]所述探针H1序列为：CACCCACTACCCATCTTTACCAGACAGTGTTACATCTCTTCTCCGAGCCGG TCGAAATAGTGGGTG；
所述探针H2为：SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2TTTTTCCACCACATTCAAATTCACCAACTATrAGGAAGAGA TGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述Link1序列为：CCA ACTAAC CCCATATAGTTGGTGAAT；
所述Link2序列为：ATGGGGTTAGTT GGATCGCCT CATACTGTCTCAAGG ACCACCGCAT；
所述H3序列为：TCTCAAGGACCACCGCAT CTCTAC ATGCGGTGGTCCTTGAGA CAGTATGAG GCG A；
所述H4序列为：GTAGAG ATGCGGTGGTCCTTGAGA TCGCCT CATACTG TCTCAAGGACCACCGCAT。

[0042]电化学检测液的制备：pH 8.0的10mM Tris-HCl中含有10μM的六氨合钌，混匀，冰箱4℃保存，备用。

[0043]电化学工作站为CHI660C，采用三电极系统,工作电极是金电极，对电极是铂丝电极，参比电极是银/氯化银电极。

冲洗电极所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液。

[0044]检测结果如图2所示，在1fM到10pM范围内，随着目标物浓度的增大，电化学信号增强，电流响应值增大。

图3为本实施例的电流响应标准曲线。

[0045]实施例2
为了评估本发明方法的特异性，用相同的实施例1实验步骤对几条不同序列的microRNA（包含(a)空白 (b) microRNA-200a（序列UAACACUGUCUGGUAACGAUGU）， (c) microRNA-429（序列UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU），(d)单碱基错配microRNA-141（序列UAACACUGUCUCGUAAAGAUGG）， (e) microRNA-141。

microRNA-141的浓度为10pM 进行检测。

[0046]检测结果如图4所示， 10pM microRNA-141(e)产生的电化学信号明显高于其他样品。

该结果表明，此方法具有很高的序列特异性，有望用于识别不同的microRNA序列。

[0047]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaactaacc ccatatagtt ggtgaat 27
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggggttag ttggatcgcc tcatactgtc tcaaggacca ccgcat 46
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctcaaggac caccgcatct ctacatgcgg tggtccttga gacagtatga ggcga 55<210> 6
序　列　表1/2页CN 110274941 A
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtagagatgc ggtggtcctt gagatcgcct catactgtct caaggaccac cgcat 55
序　列　表2/2页CN 110274941 A
图1
图2
图3
图4。