一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810087367.X
(22)申请日 2018.01.30
(71)申请人 东兰县委荣村伟造林下药材种植合
作社
地址 547400 广西壮族自治区河池市东兰
县东兰镇委荣村下宿屯13号
(72)发明人 韦宏明　
(74)专利代理机构 北京天奇智新知识产权代理
有限公司 11340
代理人 林鹏
(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
(54)发明名称
一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方
法
(57)摘要
本发明属于植物组织培养技术领域，公开了
一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，
该方法包括外植体的灭菌、初代培养、继代培养、生
根培养和炼苗五大步骤；本发明的组织培养方法
采用植物处理液进行外植体的灭菌，避免使用氯
化汞等化学试剂，保护环境，所培育的牛大力种
苗，适应性强，
成活率较高。

权利要求书1页 说明书8页CN 108142297 A 2018.06.12
C N 108142297
A
1.一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，其特征在于，该组织培养方法包括以下步骤：
(1)外植体的灭菌：选择色泽黝黑、肉质饱满、无病害情况的牛大力种子为外植体，用质量分数为75-80％乙醇溶液浸泡10min，在经流水冲洗15min，再于质量浓度为10-15％的植物处理液中浸泡15-20min进行灭菌，然后用无菌水摇荡洗涤3-5次，用无菌吸水纸将水分吸干；所述植物处理液的原料按照重量百分比计包括20-35％洋葱提取液、15-30％地榆提取液、15-30％柠檬桉提取液、8-20％大蒜提取液、5-10％青蒿提取液、5-10％艾草提取液；
(2)初代培养：将步骤(1)灭菌好的种子接种至专用培养基上进行种子萌发及幼苗生长，培养温度为25-30℃，光照强度200-300Lx，光照时间8-10h/d，培养时间15-25d；
(3)继代培养：将步骤(2)初代诱导培养获得的丛生芽切下2-3个芽体转接到专用培养基中进行继代培养，培养温度为25-29℃，光照强度600-900Lx，光照时间8-10h/d，培养时间20-35d；
(4)生根培养：将步骤(3)继代培养5-7代后的幼苗转接到培养袋中继续培养；
(5)炼苗：将步骤(4)所得生根幼苗放在大棚中进行炼苗，白天温度控制在20-25℃，晚上温度控制在12-18℃，光照为日光照射。

2.根据权利要求1所述的一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，其特征在于，所述植物处理液的原料按照重量百分比计包括：30％洋葱提取液、30％地榆提取液、15％柠檬桉提取液、10％大蒜提取液、8％青蒿提取液、7％艾草提取液。

3.根据权利要求1所述的一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，其特征在于，所述专用培养基是以MS培养基为基本培养基，并附加助剂；所述助剂占所述专用培养基总重量的2.0-
4.6％。

4.根据权利要求3所述的一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，其特征在于，所述助剂的原料按照重量百分比计包括6-12％6-苄氨基嘌呤、4-10％玉米素、1-4％a -萘乙酸、2-6％维生素B、5-15％柠檬酸、65-80％葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，其特征在于，所述维生素B包括维生素B 2、维生素B 3、维生素B 6；其重量比为5:3:2。

6.根据权利要求1所述的一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，其特征在于，所述专用培养基的pH为6.0-6.5。

权　利　要　求　书1/1页CN 108142297 A
一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法
技术领域
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法。

背景技术
[0002]牛大力，为豆科崖豆藤属植物，别名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯；其
《生草药性味甘、平，归肺、肾经，具有补虚润肺，强筋活络的作用。

牛大力的用药历史悠久，
备要》记载：“壮筋活络，补虚润肺；治腰腿疼，风湿麻痹，慢性肝炎，肺结核”。

《陆川本草》中记载：“清肺止咳，清凉解毒，治咳血，痢疾，温病身热口渴，头晕”。

70年代开始牛大力作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊等的原料用于中成药，在两广地区广泛应用。

[0003]一直以来，牛大力药材的来源都是依靠采集野生资源，从七十年代起至今经过连续三十多年的大量采挖，加之没有合理的规划和保护，致使近年来野生牛大力资源日益减少，目前牛大力野生资源已濒临枯竭，严重影响牛大力药材的可持续利用。

[0004]目前，牛大力的培育方法主要有种子培养、扦插培养、组织培养。

其中，种子培养对种子要求较高，批量采集困难，若种子发芽率低，亏损大；扦插培养成活率低，批量培养困难。

而组织培养是目前研究的重点，选择优良的牛大力种子培育种苗，采用组织培养的模式进行培养，繁育速度快，成活率高。

发明内容
[0005]本发明的发明目的在于提供一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，本发明的组织培养方法采用植物处理液进行外植体的灭菌，避免使用氯化汞等化学试剂，保护环境，所培育的牛大力种苗，适应性强，成活率较高。

[0006]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007]一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，该组织培养方法包括以下步骤：[0008](1)外植体的灭菌：选择色泽黝黑、肉质饱满、无病害情况的牛大力种子为外植体，用质量分数为75-80％乙醇溶液浸泡10min，在经流水冲洗15min，再于质量浓度为10-15％的植物处理液中浸泡15-20min进行灭菌，然后用无菌水摇荡洗涤3-5次，用无菌吸水纸将水分吸干；所述植物处理液的原料按照重量百分比计包括20-35％洋葱提取液、15-30％地榆提取液、15-30％柠檬桉提取液、8-20％大蒜提取液、5-10％青蒿提取液、5-10％艾草提取液；
[0009](2)初代培养：将步骤(1)灭菌好的种子接种至专用培养基上进行种子萌发及幼苗生长，培养温度为25-30℃，光照强度200-300Lx，光照时间8-10h/d，培养时间15-25d；[0010](3)继代培养：将步骤(2)初代诱导培养获得的丛生芽切下2-3个芽体转接到专用培养基中进行继代培养，培养温度为25-29℃，光照强度600-900Lx，光照时间8-10h/d，培养时间20-35d；
[0011](4)生根培养：将步骤(3)继代培养5-7代后的幼苗转接到培养袋中继续培养；
[0012](5)炼苗：将步骤(4)所得生根幼苗放在大棚中进行炼苗，白天温度控制在20-25℃，晚上温度控制在12-18℃，光照为日光照射。

[0013]在本发明中，进一步的，所述植物处理液的原料按照重量百分比计包括：30％洋葱提取液、30％地榆提取液、15％柠檬桉提取液、10％大蒜提取液、8％青蒿提取液、7％艾草提取液。

[0014]在本发明中，进一步的，所述专用培养基是以MS培养基为基本培养基，并附加助剂；所述助剂占所述专用培养基总重量的2.0-4.6％。

[0015]在本发明中，进一步的，其特征在于，所述助剂的原料按照重量百分比计包括6-12％6-苄氨基嘌呤、4-10％玉米素、1-4％a-萘乙酸、2-6％维生素B、5-15％柠檬酸、65-80％葡萄糖。

[0016]在本发明中，进一步的，所述维生素B包括维生素B2、维生素B3、维生素B6；其重量比为5:3:2。

[0017]在本发明中，进一步的，所述专用培养基的pH为6.0-6.5。

[0018]洋葱是隶属于石蒜科、葱属的二年生草本植物，洋葱中含有植物杀菌素如大蒜素等，杀死葡萄球菌、链球菌及其他细菌，具有很强的杀菌能力。

洋葱提取液的制备方法包括如下步骤：先将洋葱洗净，放入榨汁机内，加入水，加水量是洋葱质量的1-1.5倍，压榨10-20min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物。

[0019]地榆是蔷薇科地榆属多年生草本植物，其根中含多种鞣质成分，如地榆素等，其水浸提取液能在1min内杀死伤寒、副伤寒A和B的病原菌和痢疾杆菌的各菌系。

地榆提取液的制备方法包括如下步骤：将地榆磨粉，称重，放入反应器内，加入水，加水量是地榆重量的2-3倍，加热至沸腾后开始计时，回流提取2-3h；冷却后过滤，收集滤液，滤渣用地榆重量1倍的水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述地榆提取液。

[0020]柠檬桉是常绿大乔木，含有丰富的芳香类物质，其含有的杀菌素可杀死肺炎球菌、痢疾杆菌、结核病和流感病毒。

柠檬桉提取液的制备方法包括如下步骤：取柠檬桉叶片，切碎，称重，放入反应器内，加入水，加水量是柠檬桉叶片重量的2-3倍，加热至沸腾后开始计时，回流提取2-3h；冷却后过滤，收集滤液，滤渣用地榆重量1倍的水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述柠檬桉提取液。

[0021]大蒜辛辣味浓，其含硫化合物具有较强的抗菌消炎作用，对多种球菌、杆菌、真菌和病毒等均有抑制和杀灭作用。

大蒜提取液的制备方法包括如下步骤：先将大蒜洗净，放入榨汁机内，加入水，加水量是大蒜质量的1-1.5倍，压榨10-20min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物。

[0022]青蒿中含有青蒿素等，对多种细菌有抑制作用。

青蒿提取液的制备方法包括如下步骤：将青蒿洗净，称重，切碎，放入反应器内；在反应器内加入摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加入的1％盐酸水溶液的量是青蒿重量的2-3倍，加热至沸腾后开始计时，回流提取1-2h；自然冷却，再向提取罐内加入摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，1％氢氧化钾水溶液的添加量与1％盐酸水溶液的添加量相同，加热至沸腾后开始计时，回流提取1-2h；热过滤，收集滤液，滤渣用青蒿重量的1倍的水，冲洗三次，合并滤液，将滤液在70-80℃减压浓缩，得到所述青蒿提取液。

[0023]艾草多年生草本或略成半灌木状，具有浓烈香气，能驱赶蚊虫。

艾草提取液的制备
方法包括如下步骤：将艾草洗净，称重，切碎，放入反应器内；在反应器内加入摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加入的1％盐酸水溶液的量是青蒿重量的2-3倍，加热至沸腾后开始计时，回流提取1-2h；自然冷却，再次向提取罐内加入摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，1％氢氧化钾水溶液的添加量与1％盐酸水溶液的添加量相同，加热至沸腾后开始计时，回流提取1-2h；热过滤，滤渣用青蒿重量的1倍的水，冲洗三次，合并滤液，将滤液在70-80℃减压浓缩，得到所述艾草提取液。

[0024]由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0025](1)本发明方法中牛大力种子用植物处理液进行灭菌，与传统氯化汞灭菌相比，虽然氯化汞灭菌使用方便，灭菌效率高，但是氯化汞有毒，后处理麻烦；而本发明的植物处理液作为灭菌剂，其以洋葱提取液、地榆提取液、柠檬桉提取液、大蒜提取液、青蒿提取液、艾草提取液为原料，洋葱提取液和大蒜提取液对大多数细菌、真菌具有较强抑制作用，地榆提取液和柠檬桉提取液对杆菌、病原菌有较强的灭杀作用，再配合青蒿提取液和艾草提取液使用，六大成分具有很好的融合性，相互配合使用，对大多数真菌、细菌具有很好的灭杀作用，且避免使用汞类化合物来灭菌，保护环境，符合人们要求。

[0026](2)本发明的方法在种苗培养中使用了专用培养基，所述专用培养基是以MS培养基为基本培养基，MS培养基中硝酸盐含量高，营养成分丰富，能满足植物细胞的营养和生理需要；并配合助剂中6-苄氨基嘌呤、玉米素、a-萘乙酸、维生素B2、维生素B3、维生素B6、柠檬酸、葡萄糖共同使用；其中6-苄氨基嘌呤人工合成细胞分裂素，玉米素是一种天然的细胞分裂素，两者共同作用，进一步促进牛大力种子细胞分裂，阻止叶绿素和蛋白质降解，保持细胞活力；a-萘乙酸是一种广谱植物生长调节剂，其配合6-苄氨基嘌呤和玉米素的作用下，促进牛大力种苗分化，促进牛大力种苗生根；维生素B2、维生素B3、维生素B6配合使用，提高辅酶活性，对碳水化合物、蛋白质、脂肪的代谢起促进作用；柠檬酸调节培养基的pH值；葡萄糖补充培养基中碳源；多种成分共同作用，使本发明的专用培养基营养丰富，复合牛大力种苗生长需求，有利于提高牛大力种苗的成活率。

[0027](3)本发明方法利用牛大力种子获得无菌苗，以无菌苗为外植体，通过组织培养促进侧芽不断萌发进行快速增殖，实现牛大力种苗大规模培育；工艺简单易行，操作简单，增殖速度快；且培育的种苗适应性强，具有较高的成活率，为牛大力种苗的规模化、工厂化生产奠定了基础，可行性高。

具体实施方式
[0028]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合实施例，进一步阐述本发明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0029]本发明所用的原料均可从市面上购买。

[0030]实施例1
[0031]一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，具体步骤如下：
[0032](1)准备工作：1)制备植物处理液：将20份洋葱提取液、15份地榆提取液、30份柠檬桉提取液、15份大蒜提取液、10份青蒿提取液、10份艾草提取液混合均匀；加入900份无水乙醇，混合均匀后，得到质量浓度为10％的植物处理液；
[0033]其中，制备洋葱提取液包括如下步骤：称取30份洋葱，洗净放入榨汁机内，加入30份水，压榨10min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0034]制备地榆提取液包括如下步骤：将地榆磨粉，称取30份地榆磨粉，放入反应器内，加入60份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h，冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在70℃减压浓缩，得到所述地榆提取液；
[0035]制备柠檬桉提取液包括如下步骤：称取30份柠檬桉叶片，切碎，放入反应器内，加入60份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h；冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在70℃减压浓缩，得到所述柠檬桉提取液；
[0036]制备大蒜提取液包括如下步骤：称取30份大蒜，洗净放入榨汁机内，加入30份水，压榨10min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0037]制备青蒿提取液包括如下步骤：称取30份青蒿，切碎，放入反应器内，加入60份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1h；自然冷却，再向提取罐内加入60份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在70℃减压浓缩，得到所述青蒿提取液；[0038]制备艾草提取液包括如下步骤：称取30份艾草，切碎，放入反应器内，加入60份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1h；自然冷却，再向提取罐内加入60份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在70℃减压浓缩，得到所述艾草提取液；[0039]2)制备专用培养基：①制备助剂：将1.2份6-苄氨基嘌呤、1.0份玉米素、0.4份a-萘乙酸、0.1份生素B2、0.06份维生素B3、0.04份维生素B6、0.7份柠檬酸、6.5份葡萄糖混合均匀，备用；
[0040]②制备培养基：将2份①中制备助剂加入到98份MS培养基母液中，混合均匀后，用磷酸二氢钾或磷酸调节pH为6.0，分装，冷却后得到所述专用培养基；
[0041](2)外植体的灭菌：选择色泽黝黑、肉质饱满、无病害情况的牛大力种子为外植体，用质量分数为75％乙醇溶液浸泡10min，在经流水冲洗15min，再于质量浓度为10％的植物处理液中浸泡20min进行灭菌，然后用无菌水摇荡洗涤3次，用无菌吸水纸将水分吸干；[0042](3)初代培养：将步骤(2)灭菌好的种子接种至专用培养基上进行种子萌发及幼苗生长，培养温度为25℃，光照强度200Lx，光照时间10h/d，培养时间25d；
[0043](4)继代培养：将步骤(3)初代诱导培养获得的丛生芽切下2个芽体转接到专用培养基中进行继代培养，培养温度为25℃，光照强度600Lx，光照时间10h/d，培养时间35d；[0044](5)生根培养：将步骤(4)继代培养5代后的幼苗转接到培养袋中继续培养；[0045](6)炼苗：将步骤(5)所得生根幼苗放在大棚中进行炼苗，白天温度控制在20℃，晚上温度控制在12℃，光照为日光照射。

[0046]实施例2
[0047]一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，具体步骤如下：
[0048](1)准备工作：1)制备植物处理液：将25份洋葱提取液、20份地榆提取液、25份柠檬桉提取液、14份大蒜提取液、8份青蒿提取液、8份艾草提取液混合均匀；加入800份无水乙醇，混合均匀后，得到质量浓度为11％的植物处理液；
[0049]其中，制备洋葱提取液包括如下步骤：称取30份洋葱，洗净放入榨汁机内，加入35
份水，压榨15min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0050]制备地榆提取液包括如下步骤：将地榆磨粉，称取30份地榆磨粉，放入反应器内，加入70份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h，冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述地榆提取液；
[0051]制备柠檬桉提取液包括如下步骤：称取30份柠檬桉叶片，切碎，放入反应器内，加入70份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h；冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述柠檬桉提取液；
[0052]制备大蒜提取液包括如下步骤：称取30份大蒜，洗净放入榨汁机内，加入35份水，压榨15min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0053]制备青蒿提取液包括如下步骤：称取30份青蒿，切碎，放入反应器内，加入70份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.5h；自然冷却，再向提取罐内加入70份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.5h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在75℃减压浓缩，得到所述青蒿提取液；
[0054]制备艾草提取液包括如下步骤：称取30份艾草，切碎，放入反应器内，加入70份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.5h；自然冷却，再向提取罐内加入70份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.5h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在75℃减压浓缩，得到所述艾草提取液；
[0055]2)制备专用培养基：①制备助剂：将1.0份6-苄氨基嘌呤、0.8份玉米素、0.3份a-萘乙酸、0.1份生素B2、0.06份维生素B3、0.04份维生素B6、0.7份柠檬酸、7.0份葡萄糖混合均匀，备用；
[0056]②制备培养基：将3份①中制备助剂加入到97份MS培养基母液中，混合均匀后，用磷酸二氢钾或磷酸调节pH为6.2，分装，冷却后得到所述专用培养基；
[0057](2)外植体的灭菌：选择色泽黝黑、肉质饱满、无病害情况的牛大力种子为外植体，用质量分数为76％乙醇溶液浸泡10min，在经流水冲洗15min，再于质量浓度为11％的植物处理液中浸泡18min进行灭菌，然后用无菌水摇荡洗涤3次，用无菌吸水纸将水分吸干；[0058](3)初代培养：将步骤(2)灭菌好的种子接种至专用培养基上进行种子萌发及幼苗生长，培养温度为26℃，光照强度220Lx，光照时间9h/d，培养时间20d；
[0059](4)继代培养：将步骤(3)初代诱导培养获得的丛生芽切下2个芽体转接到专用培养基中进行继代培养，培养温度为26℃，光照强度700Lx，光照时间9h/d，培养时间30d；[0060](5)生根培养：将步骤(4)继代培养6代后的幼苗转接到培养袋中继续培养；[0061](6)炼苗：将步骤(5)所得生根幼苗放在大棚中进行炼苗，白天温度控制在22℃，晚上温度控制在15℃，光照为日光照射。

[0062]实施例3
[0063]一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，具体步骤如下：
[0064](1)准备工作：1)制备植物处理液：将30份洋葱提取液、30份地榆提取液、15份柠檬桉提取液、10份大蒜提取液、8份青蒿提取液、7份艾草提取液混合均匀；加入700份无水乙醇，混合均匀后，得到质量浓度为12.5％的植物处理液；
[0065]其中，制备洋葱提取液包括如下步骤：称取30份洋葱，洗净放入榨汁机内，加入40份水，压榨18min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0066]制备地榆提取液包括如下步骤：将地榆磨粉，称取30份地榆磨粉，放入反应器内，加入80份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取2.5h，冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述地榆提取液；
[0067]制备柠檬桉提取液包括如下步骤：称取30份柠檬桉叶片，切碎，放入反应器内，加入80份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取2.5h；冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述柠檬桉提取液；
[0068]制备大蒜提取液包括如下步骤：称取30份大蒜，洗净放入榨汁机内，加入40份水，压榨18min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0069]制备青蒿提取液包括如下步骤：称取30份青蒿，切碎，放入反应器内，加入80份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.6h；自然冷却，再向提取罐内加入80份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.6h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在75℃减压浓缩，得到所述青蒿提取液；
[0070]制备艾草提取液包括如下步骤：称取30份艾草，切碎，放入反应器内，加入80份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.8h；自然冷却，再向提取罐内加入80份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取1.8h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在75℃减压浓缩，得到所述艾草提取液；
[0071]2)制备专用培养基：①制备助剂：将0.8份6-苄氨基嘌呤、0.7份玉米素、0.2份a-萘乙酸、0.15份生素B2、0.09份维生素B3、0.06份维生素B6、0.5份柠檬酸、7.5份葡萄糖混合均匀，备用；
[0072]②制备培养基：将4份①中制备助剂加入到96份MS培养基母液中，混合均匀后，用磷酸二氢钾或磷酸调节pH为6.3，分装，冷却后得到所述专用培养基；
[0073](2)外植体的灭菌：选择色泽黝黑、肉质饱满、无病害情况的牛大力种子为外植体，用质量分数为78％乙醇溶液浸泡10min，在经流水冲洗15min，再于质量浓度为12.5％的植物处理液中浸泡17min进行灭菌，然后用无菌水摇荡洗涤4次，用无菌吸水纸将水分吸干；[0074](3)初代培养：将步骤(2)灭菌好的种子接种至专用培养基上进行种子萌发及幼苗生长，培养温度为28℃，光照强度260Lx，光照时间9h/d，培养时间20d；
[0075](4)继代培养：将步骤(3)初代诱导培养获得的丛生芽切下3个芽体转接到专用培养基中进行继代培养，培养温度为28℃，光照强度800Lx，光照时间9h/d，培养时间26d；[0076](5)生根培养：将步骤(4)继代培养6代后的幼苗转接到培养袋中继续培养；[0077](6)炼苗：将步骤(5)所得生根幼苗放在大棚中进行炼苗，白天温度控制在24℃，晚上温度控制在16℃，光照为日光照射。

[0078]实施例4
[0079]一种提高牛大力种苗成活率的组织培养方法，具体步骤如下：
[0080](1)准备工作：1)制备植物处理液：将35份洋葱提取液、15份地榆提取液、20份柠檬桉提取液、20份大蒜提取液、5份青蒿提取液、5份艾草提取液混合均匀；加入567份无水乙
醇，混合均匀后，得到质量浓度为15％的植物处理液；
[0081]其中，制备洋葱提取液包括如下步骤：称取30份洋葱，洗净放入榨汁机内，加入45份水，压榨20min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0082]制备地榆提取液包括如下步骤：将地榆磨粉，称取30份地榆磨粉，放入反应器内，加入90份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取3h，冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述地榆提取液；
[0083]制备柠檬桉提取液包括如下步骤：称取30份柠檬桉叶片，切碎，放入反应器内，加入90份水，加热至沸腾后开始计时，回流提取3h；冷却后过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，浓缩，得到所述柠檬桉提取液；
[0084]制备大蒜提取液包括如下步骤：称取30份大蒜，洗净放入榨汁机内，加入45份水，压榨20min，过滤，浓缩，得到所述洋葱提取物；
[0085]制备青蒿提取液包括如下步骤：称取30份青蒿，切碎，放入反应器内，加入90份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h；自然冷却，再向提取罐内加入90份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在80℃减压浓缩，得到所述青蒿提取液；[0086]制备艾草提取液包括如下步骤：称取30份艾草，切碎，放入反应器内，加入90份摩尔浓度为1％盐酸水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h；自然冷却，再向提取罐内加入90份摩尔浓度为1％氢氧化钾水溶液，加热至沸腾后开始计时，回流提取2h；热过滤，收集滤液，滤渣用30份水冲洗三次，合并滤液，将滤液在80℃减压浓缩，得到所述艾草提取液；[0087]2)制备专用培养基：①制备助剂：将0.6份6-苄氨基嘌呤、0.4份玉米素、0.1份a-萘乙酸、0.2份生素B2、0.12份维生素B3、0.08份维生素B6、0.5份柠檬酸、8份葡萄糖混合均匀，备用；
[0088]②制备培养基：将4.6份①中制备助剂加入到95.4份MS培养基母液中，混合均匀后，用磷酸二氢钾或磷酸调节pH为6.5，分装，冷却后得到所述专用培养基；
[0089](2)外植体的灭菌：选择色泽黝黑、肉质饱满、无病害情况的牛大力种子为外植体，用质量分数为80％乙醇溶液浸泡10min，在经流水冲洗15min，再于质量浓度为15％的植物处理液中浸泡15min进行灭菌，然后用无菌水摇荡洗涤5次，用无菌吸水纸将水分吸干；[0090](3)初代培养：将步骤(2)灭菌好的种子接种至专用培养基上进行种子萌发及幼苗生长，培养温度为30℃，光照强度300Lx，光照时间8h/d，培养时间15d；
[0091](4)继代培养：将步骤(3)初代诱导培养获得的丛生芽切下3个芽体转接到专用培养基中进行继代培养，培养温度为29℃，光照强度900Lx，光照时间8h/d，培养时间20d；[0092](5)生根培养：将步骤(4)继代培养7代后的幼苗转接到培养袋中继续培养；[0093](6)炼苗：将步骤(5)所得生根幼苗放在大棚中进行炼苗，白天温度控制在25℃，晚上温度控制在18℃，光照为日光照射。

[0094]对比例1：一种牛大力的组织培养方法，该方法与实施例3基本相同，区别仅在于所述外植体的灭菌过程采用无水乙醇灭菌。

[0095]对比例2：一种牛大力的组织培养方法，该方法与实施例3基本相同，区别仅在于所述外植体的灭菌过程采用氯化汞灭菌。

[0096]对比例3：一种牛大力的组织培养方法，该方法与实施例3基本相同，区别仅在于所。