浙江大学生物化学复习文档---包含历年真题

,1.易错PCRMVP途径3.基因推敲PDB5，密码子的偏好性同源建模7.分子伴侣简述蛋白质三维结构测定的一些方法9.简述PCR扩增前引物设计的一些基本原则简述全局转录系统工程的原理及应用1.易错PCR 是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。

理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。

通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR(sequentialermr-PronePCR)策略。

即将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。

由于易错PCR涉及的遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化 (asexualevolution)。

它虽然可以有效的产生突变，且操作方法简单，但其一般只适用较小的基因片段，且突4.蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）是一个生物大分子的数据库，如蛋白质和核酸。

这些数据包括X光晶体衍射或者NMR核磁共振显示以及由全世界生物学家和生物化学家上传，在网上，它们可以通过PBD 的会员组织（PDBe, PDBj, RCSB）免费获取。

PDB是由一个叫做世界蛋白质数据库（Worldwide Protein Data Bank, wwPDB）管理。

PDB是结构生物（如结构基因组学）的一个关键性资源。

大部分学术刊物，以及一些官方科研机构[如美国的国立卫生研究院（NIH）]，现在都要求科学家将它们研究的蛋白质、核酸结构上传到PDB5.编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。

不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。

更倾向于使用某一种密码子。

或者使用某一种密码子的概率大。

编码同一氨基酸的密码子称为同义密码子。

比如精氨酸有六种编码同义密码子（AGA，CGT，CGC，CGA，CGG，和AGG）。

但是在酵母基因组中，精氨酸的48%由密码子AGA确定，而其余五种编码精氨酸的同义密码子（CGT，CGC，CGA，CGG，和AGG）则以较低的大致相等的频率被使用（每种10%左右）。

类似地，果蝇以完全不同的密码子使用偏性编码精氨酸，即比起其它五种选择（每一种的出现频率约为13%）来说，果蝇更倾向于使用密码子CGC（33%）。

6，同源模建应该是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同一个家族的蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构，基本条件是模板蛋白与待预测蛋白序列同源。

7.分子伴侣：一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能。

主要有三大类：伴侣蛋白、热激蛋白70家族和热激蛋白90家族。

有一类分子伴侣属于热休克蛋白(HSP）在蛋白质的复性中起作用：HSP对蛋白跨膜运输，结构折叠也有重要作用8蛋白质的三维结构是指其二三四级结构。

X射线衍射—只能测定晶体结构。

核磁共振，圆二色性（CD），荧光偏振，拉曼光谱，扫描隧道显微术(STM)等。

蛋白质三级结构测定主要有X射线衍射法、核磁共振技术、三维电镜重构技术三种方法。

X线晶体衍射是最经典的测定生物大分子结构的方法。

蛋白质晶体衍射中最大的难点就在于蛋白质的结晶，也在一定程度上限制了它的发展。

NMR技术后起之秀，相对于X-RAY较为简单，近年来技术越发成熟，可测定蛋白质的分子量也在攀升，而且其分辨率也很高，三维电镜重构技术也是结构生物学研究中的一种较新的技术。

技术难点在于算法9.引物设计有三条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

10. 相同的细菌RNA 聚合酶负责细胞内所有基因转录过程的起始、延伸和终止；RNA 聚合酶的突变，就可能在全局范围内引起成百上千个受控基因转录水平的波动，从而在全局范围内产生转录突变库，经过有效的筛选就可以获得性能显著提升的细胞表型；优选的细胞表型反过来即可用于确定突变的RNAP 基因型，从而更清楚地明确细胞对外界环境压力响应的调控机制；该调控机制又可进一步用于细胞表型强化研究的理论指导——这就衍生了全局转录机器工程的新思路⑤。

与普通的菌株驯化诱变方法不同，基于RNAP 突变的全局转录机器工程方法首先人为赋予重组菌株以不同频度的大规模初始突变，经高通量筛选后获得的优选重组子将具有全局强化的目标细胞表型。

11.定向进化：认为不论进化的动力是由于外来原因还是内在动力，进化是有目的的，进化最终朝着一定方向进行的学说。

对属于某一群的动物如果把它们按所出现的地方由古老到新的顺序排列起来，则可以看到其形态是朝着一定的方向发生变化的。

12.代谢途径中乙酰辅酶A的作用：1.什么是G蛋白？描述生物通过G蛋白受体进行信号传导的机理。

G蛋白（GTP binding proteins）所有能与GTP结合的蛋白质都可以称为"G蛋白"，并不是都参与细胞信号传递。

所有的GTP结合蛋白都具有水解GTP生成GDP的能力，既具有GTP 酶的特性，所以把所有GTP结合蛋白都归属于"G蛋白超家族"（GTP-binding protein superfamily）。

在研究信号传递时特指与细胞表面受体偶联的异三聚体G蛋白（heterotrimeric GTP binding protein）。

激素配体与G蛋白偶联受体结合后导致受体构象改变，其上与Gs结合位点暴露，受体与Gs在膜上扩散导致两者结合，形成受体-Gs复合体后，Gsα亚基构象改变，排斥GDP，结合了GTP而活化，α亚基从而与βγ亚基解离，同时暴露出与环化酶结合位点；α亚基与环化酶结合而使后者活化，利用ATP生成cAMP。

cAMP产生后，与依赖cAMP的蛋白激酶（PKA）的调节亚基结合，并使PKA的调节亚基和催化亚基分离，活化催化亚基，催化亚基将代谢途径中的一些靶蛋白中的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，将其激活或钝化。

这些被磷酸化共价修饰的靶蛋白往往是一些关键调节酶或重要功能蛋白，因而可以介导胞外信号，调节细胞反应。

2.三羧酸循环。

乙酰-CoA进入由一连串反应构成的循环体系，被氧化生成H₂O和CO₂。

由于这个循环反应开始于乙酰CoA与草酰乙酸(oxaloaceticacid)缩合生成的含有三个羧基的柠檬酸，因此称之为三羧酸循环或柠檬酸循环(citratecycle)。

在三羧酸循环中，柠檬酸合成酶催化的反应是关键步骤，草酰乙酸的供应有利于循环顺利进行。

其详细过程如下：1、乙酰-CoA进入三羧酸循环乙酰CoA具有硫酯键，乙酰基有足够能量与草酰乙酸的羧基进行醛醇型缩合。

首先柠檬酸合酶的组氨酸残基作为碱基与乙酰-CoA作用，使乙酰-CoA的甲基上失去一个H+，生成的碳阴离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击，生成柠檬酰-CoA中间体，然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸，使反应不可逆地向右进行。

该反应由柠檬酸合酶(citratesynthase)催化，是很强的放能反应。

由草酰乙酸和乙酰-CoA合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点，柠檬酸合酶是一个变构酶，ATP是柠檬酸合酶的变构抑制剂，此外，α-酮戊二酸、NADH能变构抑制其活性，长链脂酰-CoA也可抑制它的活性，AMP可对抗ATP的抑制而起激活作用。

2、异柠檬酸形成柠檬酸的叔醇基不易氧化，转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇，就易于氧化，此反应由顺乌头酸酶催化，为一可逆反应。

3、第一次氧化脱羧在异柠檬酸脱氢酶作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸(oxalosuccinicacid)的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)、NADH和CO2，此反应为β-氧化脱羧，此酶需要镁离子作为激活剂。

此反应是不可逆的，是三羧酸循环中的限速步骤，ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，而ATP，NADH是此酶的抑制剂。

4、第二次氧化脱羧在α-酮戊二酸脱氢酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰-CoA、NADH·H+和CO₂，反应过程完全类似于丙酮酸脱氢酶系催化的氧化脱羧，属于α?氧化脱羧，氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酰coa的高能硫酯键中。

α-酮戊二酸脱氢酶系也由三个酶(α-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)和五个辅酶(tpp、硫辛酸、hscoa、NAD+、FAD)组成。

此反应也是不可逆的。

α-酮戊二酸脱氢酶复合体受ATP、GTP、NADH和琥珀酰-CoA抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的调控。

5、底物磷酸化生成ATP在琥珀酸硫激酶(succinatethiokinase)的作用下，琥珀酰-CoA的硫酯键水解，释放的自由能用于合成gtp，在细菌和高等生物可直接生成ATP，在哺乳动物中，先生成GTP，再生成ATP，此时，琥珀酰-CoA生成琥珀酸和辅酶A。

6、琥珀酸脱氢琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase)催化琥珀酸氧化成为延胡索酸。

该酶结合在线粒体内膜上，而其他三羧酸循环的酶则都是存在线粒体基质中的，这酶含有铁硫中心和共价结合的fad，来自琥珀酸的电子通过fad和铁硫中心，然后进入电子传递链到O₂，丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，所以可以阻断三羧酸循环。

7、延胡索酸的水化延胡索酸酶仅对延胡索酸的反式双键起作用，而对顺丁烯二酸(马来酸)则无催化作用，因而是高度立体特异性的。

8、草酰乙酸再生在苹果酸脱氢酶(malicdehydrogenase)作用下，苹果酸仲醇基脱氢氧化成羰基，生成草酰乙酸(oxalocetate)，NAD+是脱氢酶的辅酶，接受氢成为NADH·H+(图4-5)。

在此循环中，最初草酰乙酸因参加反应而消耗，但经过循环又重新生成。

所以每循环一次，净结果为1个乙酰基通过两次脱羧而被消耗。

循环中有机酸脱羧产生的二氧化碳，是机体中二氧化碳的主要来源。

在三羧酸循环中，共有4次脱氢反应，脱下的氢原子以NADH+H+和FADH2的形式进入呼吸链，最后传递给氧生成水，在此过程中释放的能量可以合成ATP。