菌株N3和TP-3的分类鉴定及保水效果研究

菌株N3和TP-3的分类鉴定及保水效果研究
黄海东;董瑞峰;班立桐;杨红澎;王玉;刘畅;王青
【摘要】用多相分类的方法对2株生物聚合物合成菌进行了鉴定,通过形态学、生理生化和16S rDNA系统进化分析,鉴定菌株N3为泛菌属,菌株TP3为鞘氨醇单胞菌属.N3和TP3合成的生物聚合物具有协效增粘性,将这两种菌剂混合喷洒在沙土表面,能够形成致密的结皮,从而显著提高沙土的持水能力;试验第15天,N3和TP3混合处理组的含水量为2.1%,是对照的10.5倍,是N3和TP3单独处理组含水量的3倍和1.6倍.这种由混合菌剂形成的结皮不会影响种子的萌发,且能增加幼苗的成活率.
【期刊名称】《天津农学院学报》
【年(卷),期】2010(017)003
【总页数】5页(P21-25)
【关键词】生物结皮;泛菌属;鞘氨醇单胞菌属;分类鉴定
【作者】黄海东;董瑞峰;班立桐;杨红澎;王玉;刘畅;王青
【作者单位】天津农学院,农学系,天津,300384;天津市花苗木服务中心,天
津,300300;天津农学院,农学系,天津,300384;天津农学院,农学系,天津,300384;天津农学院,农学系,天津,300384;天津农学院,农学系,天津,300384;天津农学院,农学系,天津,300384
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
我国是世界上荒漠面积较大和荒漠化危害严重的国家之一，全国荒漠化土地面积约占国土陆地面积的四分之一，因此，对土地荒漠化的控制与恢复研究在我国显得尤为迫切和重要[1]。

生物结皮由活的微小生物及其代谢产物（胞外聚合物）与沙粒
组成，是土壤颗粒与有机物紧密结合在土壤表层形成的一种壳状体。

土壤结皮是节水农业和荒漠化治理中一种重要的抗旱保水方法[2]。

在干旱荒漠化的土壤表面，
生物结皮的覆盖能提高表层土壤的稳定性，改善土壤保水状况，对防止土壤侵蚀、促进土壤演替具有重要作用[3－4]。

本文对2株合成生物聚合物的细菌进行了分类鉴定，并对其菌液在土壤表面形成结皮的能力和保水效果进行了研究。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
E.coli DH5α购自大连宝生物公司；菌株N3从发芽苦荞的幼茎上分离得到，菌株TP3从土壤中分离得到，由本实验室保藏。

1.1.2 培养基
斜面及平板培养基（g/L）：蔗糖10、蛋白胨2、牛肉膏1、琼脂15，pH 7.0～7.5。

种子培养基（g/L）：蔗糖10、蛋白胨0.5、酵母粉0.1、NaCl 0.2，pH 7.0～7.5。

发酵培养基（g/L）：蔗糖 40、蛋白胨 2、K2HPO4 0.3、NaCl 0.1，pH 7.0～7.5。

1.1.3 试剂
细菌全基因组 DNA提取试剂盒购自上海生工；PCR主要试剂购自赛百盛公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自V-gene公司；pGEM-T easy购自 Promega公司；SDS、Tris、酚、溶菌酶、RNase等购自上海生工；其它试剂均为分析纯。

1.1.4 供试种子及土样
供试大豆种子为农科6号，玉米种子为华单25，保水试验用土样取自天津农学院
试验田。

1.2 方法
1.2.1 菌株的形态特征及生理生化鉴定
在光学显微镜下观察细胞的个体形态，并测定其菌体大小。

细菌的革兰氏染色、芽孢染色、运动性观察、甲基红（M.R）、V-P测定、葡萄糖发酵、氧化酶、接触酶、脲酶、吲哚等试验参考文献[5]进行。

1.2.2 16S rDNA PCR扩增和序列测定
在液体培养基中分别接种N3和TP3，30 ℃摇床培养36 h，各取5 mL菌液离心，得到的菌体用0.5 mol/L NaCl洗1次，用1 g/L溶菌酶溶液悬浮菌体，37 ℃作
用30 min，用上海生工UNIQ-10试剂盒提取细菌基因组DNA。

以基因组DNA
为模板，用细菌 16S rDNA通用引物 27F（5'-GAGAGT TTGATCCTGGCTCAG -
3'）和1541R（5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3'）扩增得到目的基因片断，经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pGEM-T easy载体连接，转化 E.coli DH5a，用X-
gal平板筛选含有插入 DNA片断的白色转化子，经限制性内切酶酶切鉴定后送北
京三博公司测序。

将得到的16S rDNA 序列与GenBank中的核酸数据进行BLAST比对，搜索得到与其同源性最高的相关序列，采用软件ClustalX1.8对所
获得的核苷酸序列进行分析，得到序列之间的相似值；用软件MEGA2.0计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树[6－7]。

图1 菌株N3和TP3的细胞形态特征
1.2.3 菌株的液体发酵
250 mL三角瓶装100 mL发酵培养基，接种后置于旋转式摇床上，180 r/min、30 ℃培养72 h，得到菌株N3和TP3的发酵液。

1.2.4 结皮的形成及保水效果
将150 g自然风干的沙土置于塑料杯中，分别加入20 mL水（CK）、灭菌后的发酵培养基、N3、TP3发酵液，以及两种发酵液的1︰1混合液，每个处理设3个
重复；室温下自然蒸发，并定时称重，观察结皮的形成和对水分蒸发的影响。

1.2.5 结皮对种子萌发和幼苗存活的影响
将颗粒大小和形状相近的大豆和玉米种子分别置于沙土中，各加入20 mL水以及
1︰1混合的N3和TP3发酵液，每个处理设3个重复；室温下放置，观察种子萌发和幼苗存活情况。

2 结果与分析
2.1 菌株的分类鉴定
2.1.1 菌落及菌体特征
在固体平板上30 ℃培养4 d，菌株N3形成的菌落直径为3～4 mm，圆形、边缘整齐、凸起、黄色、质地粘稠，且合成一种有一定流动性的黏液状聚合物。

将平板置于冰箱保存，该种黏液能将培养皿的上下盖粘连在一起。

N3菌体细胞形态为直杆状，大小为（0.3～0.8）μm×（0.9～1.5）μm，革兰氏阴性，无芽孢，胞内有
异染粒。

相同条件下，菌株TP3形成的菌落乳白色、隆起、边缘整齐，质地粘稠，菌落直径5～8 mm；TP3为革兰氏染色阴性，无芽孢、无鞭毛，胞内有异染粒，无类脂颗粒，抗酸染色阳性；培养初期，菌体分裂后不断开，形成长杆状，48 h
后TP3细胞形成分散的单个细胞，大小为（1.0～1.5）μm×（1.8～2.4）μm，菌体周围都有明显的纤毛状聚合物分泌（图1）。

2.1.2 生理生化特性
菌株 N3为兼性厌氧菌，其生长温度范围为8～40 ℃，pH生长范围为5.0～8.5，其他生理生化指标的实验结果如表1所示。

N3可以利用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、鼠里糖、树胶醛糖和甘油，不能利用淀粉、海藻糖和乙酸
盐为唯一碳源生长。

表1 菌株N3和TP3的生理生化特征注：“＋”为Positive；“－”为Negative 实验项目结果实验项目结果N3 TP3 N3 TP3葡萄糖氧化发酵发酵型氧化型精
氨酸双水解酶＋－氧化酶－－赖氨酸脱氨酶－－接触酶＋＋硝酸盐还原＋
＋脲酶－－淀粉水解－－H2S产生－－七叶苷水解＋＋吲哚产生－－ M.R. －－明胶液化－＋ V.P ＋－
菌株TP3好氧生长，在4～40 ℃的温度范围内和pH 4.0～8.5的范围内均可生长，其耐盐性较差，NaCl 浓度高于 1.2%就无法生长；TP3可以利用的碳源有糊精、
葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、D-绵子糖、D-海藻糖、丙酮酸甲酯、D-葡萄糖醛酸、－羟基丁酸、癸二酸、溴代丁二酸、琥珀酰胺酸、甘氨酰谷氨酸、尿刊酸等；其他生理生化指标的实验结果如表1所示。

2.1.3 16S rDNA序列测定及系统进化分析
PCR扩增得到菌株N3和TP3的16S rDNA片断，经DNA测序，长度分别为1 520 bp和1 480 bp，在GenBank/EMBL/DDBJ 中的序列登记号为GQ853415
和 DQ789172。

将 16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，菌株N3与肠杆菌科泛菌属（Pantoea sp.）的同源性较高，将其与泛
菌属全部8个种的菌株以及Pandoraea sp.的细菌进行遗传距离计算，用邻位相
连法构建系统进化树（图2），从中可以看出，菌株N3与泛菌属（Pantoea sp.）的菌株都划分在同一簇内，且与 Pantoea agglomerans DSM 3493的同源性最高，达到97.9%。

图2 菌株N3的16S rDNA序列系统进化树
从菌株TP3的系统进化树（图3）可以看出，该菌株可以明确地划分到鞘氨醇单
胞菌属（Sphingomonas sp.）中。

与TP3进化关系最接近的菌为S.pituitosa、
S.trueperi和S.azotifigens，但与S.azotifigens NBRC 15497T的同源性最高，达95.9%。

2.1.4 鉴定结果
结合形态学和生理生化特征指标，确定苦荞内生菌N3属于泛菌属，菌株TP-3属于鞘氨醇单胞菌属，TP-3与鞘氨醇单胞菌属其他菌株的同源性最高为95.9%，按照目前的分子分类标准，16S rDNA的同源性＜98%即认为是不同的种，而且
TP3在系统进化树上可以形成一个单独的分支，这些证据表明，TP3应该是鞘氨
醇单胞菌属的一个新种。

图3 菌株TP3的16S rDNA序列系统进化树
2.2 结皮的形成及保水效果
保水试验的第3天，由菌株N3和TP3合成的生物聚合物在沙土表面形成了一层
致密而坚硬的结皮，由于结皮的保水作用，水分蒸发量比对照明显减少，其含水量分别为7.1%和8.3%，明显高于对照6.6%的含水量；土样中加入培养基后激活了土样中的土著微生物，因此该处理的含水量为 6.7%，略高于对照。

N3发酵液粘
度较低，其结皮的保水效果并不是很显著，仅比对照的含水量高8%；但其合成的聚合物与TP3的聚合物有协效，源于两种高分子聚合物表面分子相互嵌合而产生
的协效性可以大幅度增加高分子溶液的粘度[8]。

随着时间的延长，这种协效增粘
性使两种发酵液混合处理的结皮更加致密；第 15天，N3和TP3混合处理组的含水量仍然有2.1%，为对照的10.5倍，为N3和TP3单独处理组含水量的3倍和1.6倍，表现出良好的保水功能。

图4 土壤含水量随时间的变化
到第17天，CK的含水量接近0，而N3、TP3混合处理组的土样含水量为1.8%；一直到第 29天，其含水量才接近0，与对照相比，土样持水时间延长了12 d。

从N3、TP3混合处理组中分离微生物，按菌落形态初步统计，结皮中能分离得到微
生物的种类多于对照，且能再次分离培养到菌株N3和TP3。

说明组成生物结皮的微生物仍然存活，当周围湿度很低时，它们会暂时停止生理活动，处于休眠状态，以度过干旱、贫营养等极端恶劣的环境。

2.3 N3、TP3混合结皮对种子萌发和幼苗存活的影响
以大豆和玉米作为供试作物，研究了N3、TP3混合结皮对种子萌发和出苗的影响。

结果如图 5所示，结皮处理的种子都可以正常发芽，幼苗在同一天出土，说明菌
株分泌的胞外聚合物不会抑制种子的萌发，结皮也不会阻碍幼苗的出土。

由于结皮良好的保水效果，喷洒N3、TP3混合菌剂的处理中，幼苗长势明显优于对照，说明N3、TP3混合结皮不会影响种子的萌发，且对幼苗的存活有利。

图5 结皮对种子萌发的影响
3 结论与讨论
在全球荒漠化问题日趋严重的情况下，土壤生物结皮在荒漠化治理中的生态作用和生物保水剂的开发应用越来越受到重视。

生物结皮能够促进荒漠化地区的生物多样性，并且在土壤稳定性、固氮作用、土壤肥力和水分渗入等方面起到了重要作用[9]。

本研究中的泛菌 N3和鞘氨醇单胞菌TP3都能合成具有增稠作用的胞外生物
聚合物，其菌液喷洒于沙土表面，都可以形成致密的结皮结构，并表现出一定的保水效果。

说明这两种细菌可以作为生物保水剂和荒漠化土壤生物结皮人工接种固沙技术的微生物菌种资源。

由于 N3和TP3合成的生物聚合物具有协效增粘性，将
此两种菌剂混合使用能形成更为致密的结皮，这种结皮不会影响种子的萌发，而且能提高幼苗的存活率。

参考文献：
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