AB-8型大孔吸附树脂纯化复方桂枝茯苓丸中桃仁、赤芍提取物工艺

AB-8型大孔吸附树脂纯化复方桂枝茯苓丸中桃仁、赤芍提取
物工艺
郭先帅;刘冬云;朱婉婷;梁生旺;王淑美
【摘要】目的优选复方桂枝茯苓丸中桃仁、赤芍提取物的大孔树脂纯化工艺.方法以苦杏仁苷和芍药苷的吸附洗脱率为指标,采用单因素试验考察上样液质量浓度、径高比、洗脱剂等对桂枝茯苓丸中桃仁、赤芍提取物大孔树脂纯化工艺的影响.结果优选的纯化工艺为:上样液质量浓度200 mg/mL,树脂柱径高比1:9,树脂体积与上样量比0.77∶1,加4 BV水洗除杂,用体积分数30％乙醇洗脱,收集洗脱液6 BV.结论该纯化工艺合理稳定,可推广于大生产应用.
【期刊名称】《广东药学院学报》
【年(卷),期】2015(031)002
【总页数】4页(P167-170)
【关键词】复方桂枝茯苓丸;大孔吸附树脂;纯化工艺;苦杏仁苷;芍药苷
【作者】郭先帅;刘冬云;朱婉婷;梁生旺;王淑美
【作者单位】广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006;广东药学院中药学院,广东广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
复方桂枝茯苓丸是以《金匮要略》中桂枝茯苓丸为基础方，由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁等组成，功效为活血化瘀、缓消症块。

临床主要用于妇人瘀血阻络所致肿块、经闭、痛经、子宫肌瘤、卵巢囊肿、输卵管不通等疾病[1]。

若按传统的提
取工艺提取该方中的桃仁、赤芍，有杂质质量分数高、制剂服用量大等缺点。

大孔吸附树脂是具有大孔结构的高分子吸附剂，其物理化学性质稳定、选择性好、吸附速度快，在分离纯化中草药及中药复方方面有良好的分离效果[2]。

为了充分获取
桃仁和赤芍中的主要有效成分，本文在提取工艺已经确定的前提下，以苦杏仁苷和芍药苷为考察指标[3-4]，对纯化工艺的各参数条件进行考察，以优选AB-8型大
孔吸附树脂纯化桃仁、赤芍提取物的纯化工艺。

1．1 仪器
LC-20AT高效液相色谱仪含二元梯度泵(包括SPD-20A紫外-可见检测器，Lcsolution工作站，日本岛津公司)；KQ-3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器
有限公司)；AUW220D电子天平(日本岛津公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚
荣生化仪器厂)；DLSB-5/20低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)；SKG-02型电热干燥箱(黄石恒丰医疗器械有限公司)；DK-S26型电热恒温水浴锅(上海
精宏试验设备有限公司)。

1．2 药材与试剂
桃仁、赤芍药材购自广州致信药业有限公司，经广东药学院刘基柱副教授鉴定分别为蔷薇科植物桃Prunus persica(L．)Batsch的干燥成熟种子，毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall．的干燥根；苦杏仁苷对照品(批号：110820-200403)和
芍药苷对照品(批号：110736-200527)均购自中国药品生物制品检定所；甲醇(色
谱纯，天津四友生物医学技术有限公司)；屈臣氏蒸馏水，其他试剂为分析纯；
AB-8型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂)。

2．1 样品溶液制备及工艺验证
按处方量称取桃仁、赤芍药材，温浸(40～50℃)于10倍量水中30 min后，水浴
回流2次，每次1 h，滤过，合并2次提取液，减压浓缩后，用蒸馏水定容成一定质量浓度的样品溶液。

按上述方法制备3批样品，按“2．2．1”项下方法，测定苦杏仁苷、芍药苷的质量分数，并计算提取率。

结果测得苦杏仁苷质量分数分别为2．63%、2．71%、2．67%，提取率依次为 89．94%、90．36%、89．99%；芍药苷质量分数分别为2．56%、2．53%、2．48%，提取率依次为90．88%、90．83%、90．37%。

3批样品工艺验证结果表明桃仁、赤芍水煎工艺较稳定可行。

2．2 苦杏仁苷、芍药苷质量浓度的测定
2．2．1 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(250 mm× 4．6mm，5μm)色谱柱；流动相：甲醇-水(体积比35∶65)；流速：1．0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：215 nm；进样量：20μL。

按照《中国药典》2010年版附录ⅥD项下高效液相色
谱法相关内容进行测定[5]。

色谱图见图1。

2．2．2 对照品溶液的制备精密称取苦杏仁苷对照品22．14mg、芍药苷对照品22．27mg，分别置于25 mL量瓶中，加入50%(体积分数，下同)甲醇溶解并稀
释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为0．886 mg/ mL的苦杏仁苷和质量浓度为0．891 mg/mL的芍药苷对照品溶液。

2．2．3 标准曲线的绘制分别精密吸取已配制好的苦杏仁苷、芍药苷对照品溶液0．2、0．5、1、2、2．5、4 mL，定容于10 mL的容量瓶中[6]。

按“2．2．1”项下的色谱条件测定峰面积。

以对照品色谱峰峰面积对进样量作图，得到回归方程为苦杏仁苷y＝923 552．5x＋6 766.9(r＝0.999 5)，芍药苷y＝821 844.8x＋17 677.2(r＝0．999 7)，表明苦杏仁苷在0．354～7．088μg、芍药苷在0．356～7．128μg范围内线性关系良好。

2．2．4 供试品溶液的制备称取30%(体积分数，下同)乙醇洗脱样品200 mg，
精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min后放冷，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀。

精密量取2 mL置于25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2．3 树脂预处理[7]
取大孔吸附树脂适量，加乙醇溶胀24 h，95% (体积分数，下同)乙醇湿法装柱，
然后以8倍量树脂体积(BV)通过树脂层，再用水洗至无醇味。

用3 BV质量分数5%HCl通过树脂层，水洗至中性，再用3 BV质量分数5%NaOH动态清洗，水
洗至中性，重复酸和碱洗2次，洗至乙醇洗脱液与水混合(体积比1∶3)不呈白色
混浊溶液为止，水洗后备用。

2．4 大孔树脂纯化桃仁、赤芍工艺参数考察
2．4．1 上样质量浓度的考察取“2．1”项下的方法制备样品溶液5份，用蒸馏水分别稀释成800、400、267、200、160、133 mg/mL的样品。

将不同质量浓度的上样液分别等流速通过A型大孔吸附树脂柱(柱体积10 mL)，动态吸附3 h，先用水洗至Molish反应呈阴性，再用95%乙醇洗脱至FeCl3-K3Fe(CN)6反应呈阴性，分别收集洗脱液。

按测定苦杏仁苷、芍药苷质量浓度的方法，计算其吸附-
解吸附率[吸附-解吸附率＝(洗脱液质量浓度/吸附量)×100%]。

结果测得6个质量浓度样品中苦杏仁苷的吸附-解吸附率分别为48%、59%、77%、83%、62%、50%，芍药苷的吸附-解吸附率依次为44%、58%、79%、85%、63%、49%。

可见，样品溶液质量浓度为200 mg/mL时，苦杏仁苷和芍药苷的吸附-解吸附率
最高，因此，确定该质量浓度为最佳上样质量浓度。

2．4．2 树脂径高比的考察取等量200 mg/mL样品溶液3份，分别通过树脂层，树脂柱径高比分别为1∶7、1∶9、1∶11，以相同流速进行动态吸附3 h，先用水洗至Molish反应呈阴性，再用95%的乙醇洗脱至FeCl3-K3Fe(CN)6反应呈阴性。

计算洗脱物中苦杏仁苷、芍药苷的吸附-解吸附率。

结果测得3个径高比苦杏仁苷
的吸附-解吸附率分别为76%、81%、72%，芍药苷的吸附-解吸附率分别为69%、84%、75%。

结合苦杏仁苷、芍药苷的吸附-解吸率和实际生产的需要，确定最佳树脂柱径高比为1∶9。

2．4．3 上样量与树脂体积比的考察[8]取200 mg/ mL样品溶液通过树脂层(树脂柱径高比为1∶9，湿树脂体积为10 mL)，以相同流速进行动态吸附，分段收集流出液，从每份中取适量测定苦杏仁苷、芍药苷的质量浓度。

结果见图2。

可见，苦杏仁苷在累积上样量达到65 mL时开始有明显泄露，芍药苷在达85 mL 时有明显泄漏。

因此，应以苦杏仁苷的明显泄漏量计算，确定最大上样量为13 g，最佳上样量与树脂体积比为1∶0．77。

2．4．4 水洗脱用量的考察按上述确定的工艺，取等量200 mg/mL样品液6份
分别通过树脂层进行动态吸附。

先分别用1、2、3、4、5、6 BV水洗脱去除杂质，再用95%乙醇洗脱至薄层检识呈阴性，收集95%乙醇洗脱液。

结果测得苦杏仁苷的质量分数分别为15．7%、20．4%、23．5%、27．8%、27．5%、27．6%，芍药苷的质量分数依次为12．8%、21．6%、24．3%、26．1%、26．3%、26．2%。

由此可知，用4 BV水清洗树脂柱，能够有效去除杂质。

2．4．5 洗脱剂的选择按上述确定的工艺，取等量200mg/mL样品液4份分别
上样进行动态吸附。

待吸附3 h后用4 BV水洗脱，然后分别用30%、50%、70%、95%(体积分数，下同)乙醇洗脱至薄层检识呈阴性。

收集不同比例乙醇洗脱液，减压浓缩至干，称定质量，测定苦杏仁苷、芍药苷的质量分数。

结果见表1。

可见，30%、70%和95%3种比例洗脱溶剂中目标成分的质量分数差别不大，但30%乙醇的出膏率要比后两者的低，考虑到实际生产成本，选择30%乙醇为洗脱
溶剂。

2．4．6 洗脱剂用量的考察按上述确定的工艺，取样品溶液通过大孔树脂进行动
态吸附。

用4 BV水洗后，用30%乙醇洗脱，分段收集洗脱液，每10 mL收集一
次，共10份，每份取适量测定溶液中苦杏仁苷、芍药苷的质量浓度。

以苦杏仁苷、芍药苷的质量浓度对应洗脱体积绘图。

结果见图3。

可见，当洗脱溶剂为60mL时，可以同时将苦杏仁苷和芍药苷洗脱完全，即洗脱
溶剂的用量为6倍树脂体积。

2．5 纯化工艺验证
按上述最终确定的优化工艺平行制备3批样品，按“2．2．1”项下方法测定苦杏仁苷、芍药苷的质量分数。

结果测得桃仁、赤芍纯化物的出膏率分别为7．98%、7．43%、7．61%，其中苦杏仁苷的质量分数分别为26．90%、31．62%、28．89%，芍药苷的质量分数分别为28．41%、26．68%、24．63%。

表明优
选的桃仁、赤芍提取物的纯化工艺合理、稳定。

在大孔吸附树脂分离纯化中草药的应用中，吸附-解吸附的条件对大孔吸附树脂吸
附工艺的好坏有直接影响，因而应综合考虑各种影响因素，从而优选最佳吸附-解
吸附条件，取得最佳分离效果[9]。

随着大孔吸附树脂柱反复使用次数的增加，不能被洗脱剂有效洗脱下来的杂质会不断积聚，从而造成大孔吸附树脂的吸附能力下降，因此，在连续使用大孔树脂达到一定时间后，须对树脂进行再生处理以保证分离纯化的效果。

本研究结果表明，AB-8型大孔吸附树脂对芍药苷的吸附量大、解吸容易，确定的吸附与洗脱条件简单易行，用于桂枝茯苓丸中桃仁、赤芍水提物的有效部位的分离富集，取得了良好的效果，为建立可控的生产工艺流程和创新药物的开发研制提供参考。

【相关文献】
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