金沙江河谷地区岩羊种群遗传多样性分析

金沙江河谷地区岩羊种群遗传多样性分析
朱睦楠;周材权
【摘要】岩羊为国家Ⅱ级保护动物.目前,由于人类活动范围日益扩大,其栖息地遭到了不同程度的破坏,岩羊种群数量和分布范围呈明显下降趋势.为了及时制定科学的保护策略必须了解它们的种群遗传结构.本文以粪便为研究材料,对来自金沙江河谷地区林线以上岩羊和林线以下矮个子岩羊共4个地理种群的169份有效样品进行线粒体CR全序列分析,共检测出210个变异位点,定义了4种单倍型,单倍型多样性为0.68,核苷酸多样性为0.0242,显示种群整体遗传多样性水平较低.基于最大简约法构建的系统发育树中,金沙江河谷地区的4个地理种群被划分到四川种群的2个亚分支中,但云南曲宗贡的部分岩羊和四川竹巴笼的矮个子岩羊单倍型存在共享现象.根据分子钟计算,林线上下岩羊分化时间在39 ～32万年前,在中更新世早中期(105 ～36万年前)气候影响下,导致岩羊在金沙江河谷高低海拔之间相互迁移.对于岩羊在历史上所表现出的潜在迁徙能力,我们建议将白马雪山自然保护区到竹巴笼自然保护区之间的金沙江河谷地区作为岩羊和矮个子岩羊的栖息地整体保护.【期刊名称】《四川动物》
【年(卷),期】2014(033)003
【总页数】5页(P342-346)
【关键词】岩羊;粪便;种群遗传多样性;金沙江河谷地区
【作者】朱睦楠;周材权
【作者单位】西华师范大学生命科学学院珍稀动植物研究所,西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川省环境科学与生物多样性保护重点实验室,四川南充
637009;西华师范大学生命科学学院珍稀动植物研究所,西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川省环境科学与生物多样性保护重点实验室,四川南充637009【正文语种】中文
【中图分类】Q959.8;Q16
过去根据形态学分类(Groves，1978；Corbet & Hill, 1991)认为，岩羊属包括岩
羊Pseudois nayaur和矮岩羊P. schaeferi两个种，隶属偶蹄目牛科山羊亚科，
主要分布于中亚地区的青藏高原及其他周边山脉。

但是，近些年来一系列利用线粒体和核基因为遗传标记的分子系统进化研究(Feng et al., 2001；Zhou et al., 2003；Zeng et al., 2008)表明：不支持矮岩羊的物种有效性并建议将其划分到岩羊的四川亚种中Pseudois nayaur szechuanensis。

矮岩羊只是岩羊的同物异名，为区分于岩羊特指它们是生活在金沙江河谷地区林线以下的矮个子岩羊(Allen，1940)。

岩羊作为我国Ⅱ级保护动物，主要包括2个亚种，即西藏亚种Pseudois nayaur nayaur (Wang & Hoffmann, 2000)和四川亚种(Wang et al., 1987)。

西藏亚种
主要分布在印度、巴基斯坦、尼泊尔等国家及我国的西藏，而四川亚种主要分布在我国的内蒙古、新疆、宁夏、青海、甘肃、四川和云南等省区(Shackleton，1997)。

由于过量捕猎和栖息地的破坏，岩羊种群数量呈逐渐下降的趋势。

任军让和余玉群(1990)在青海调查岩羊种群密度时，发现其密度只有3.4只/km2，郑生
武(1994)发现甘肃岩羊种群密度也只有3.3只/km2。

对于仅分布于横断山脉金沙
江干热河谷地带的两侧石壁草丛中的矮个子岩羊(吴毅等，1990)，数量在全国范
围内仅7000只左右，其中四川的总数为4000～5000只(胡锦矗，汪松，1994)。

由于这些岩羊的栖息地处于悬崖绝壁，地势险恶的高山峡谷之间，加上它们生性灵敏并且胆小，一旦受到惊吓就会逃跑，这对野外研究是一种巨大的挑战。

目前通过
野外观察对于矮个子岩羊的集群现象(申定健等，2007；龙帅等，2008)、生境选
择(申定健等，2009)、形态比较(刘延德等，2007)等方面都有所研究，但是对于
金沙江地区岩羊种群遗传结构等方面的研究未做过报道。

为了获取动物的遗传信息，传统的采样方法包括损伤性取样和非损伤性取样，对于濒危珍稀物种的研究是不利的，也违背了以保护濒危珍稀物种为研究目的的初衷。

为了避免传统的取样方法对野生动物所造成的伤害，越来越多的研究者选取非损伤性取样方法来收集样品。

这种方法能够在有效的避免影响和伤害野生动物的前提下，收集自然脱落的毛发、食物残渣、鳞片、粪便等作为样品可以满足实验需要。

然而，在实际采集非损伤性样品中，粪便样品比其他材料更易于采集并且也最具潜在的应用价值。

Hoss等(1992)发表的一篇文章：从棕熊粪便提取的DNA中成功扩增出
线粒体部分序列，标志着粪便DNA分析技术的建立。

之后越来越多的研究者采用非损伤性采样(主要是粪便)结合现代分子生物学技术研究濒危物种。

Palomares等(2002)利用粪便DNA提取和PCR扩增技术将野外收集到的伊伯利亚肉食动物猞
猁粪便内的线粒体DNA细胞色素b和控制区部分序列成功扩增来研究伊伯利亚猞猁现有分布情况。

本研究以线粒体控制区(CR)为遗传标记，采集活动于金沙江河谷地区林线以上岩羊及林线以下矮个子岩羊的粪便为材料，对这一区域分布的岩羊种群遗传结构进行初步研究，以确定各种群间的遗传多样性水平，为更好的保护这一稀有物种提供科学依据。

1.1 取样地点
2011年7月到10月沿金沙江河谷地带共收集到岩羊新鲜粪便226份，其中收集自云南白马雪山自然保护区曲宗贡(金沙江西岸)的岩羊粪便45份，罗尼神山(金沙江西岸)矮个子岩羊粪便60份；收集自四川巴塘县措普沟(金沙江东岸)岩羊粪便
55份，竹巴笼(金沙江东岸)矮个子岩羊粪便66份。

每份粪便样品分别保存在含有
5 mL无水乙醇的10 mL试管中密封，温室保存。

1.2 粪便DNA的提取方法
DNA提取参照张保卫等(2004)，并略做改进。

将一粒浸泡在无水乙醇无损的粪便转入10 mL的离心管，用90%～10%乙醇按浓度梯度依次换洗粪便，直到粪便中的色素洗尽。

用去离子水换洗样品，洗尽残留的乙醇后，用滤纸将样品的水分吸干转入到2 mL的离心管。

加入200 μL TE Buffer，100 μL 10%SDS，100 μL 0.5
M EDTA，10 μL蛋白酶K(20 mg/μL)密封离心管于55℃水浴4 h。

将消化液常
温3000 rpm离心2 min去除样品中的杂质，吸取350 μL上清液转入新的2 mL 离心管。

加入50 μL 3.5 M NaCl，200 μL 70℃预热的CTAB。

轻摇混匀后于70℃水浴10 min。

水浴后冷却到室温，加入等体积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，摇匀10 min。

4℃ 12 000 rpm 离心10 min。

取上清液加入等体
积的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，摇匀10 min。

4℃ 12 000 rpm 离
心10 min。

重复上一步直至两相界液面干净。

将上清液用PCR纯化试剂盒(上海
生工)处理纯化和收集DNA于4℃保存。

1.3 引物设计与PCR扩增
利用Primer Primer v5.0基于岩羊近缘物种序列设计的引物。

CR全序列由2个片段分开测序后再拼接：第一个片段设计的引物为CR-F1：5’-CCCCAAGACTCAAGGAAG-3’，CR-R1：5’-CTGCAGTTAAGTCCAGCT-3’；第二个片段设计的引物为CR-F2：5’-GACATCTGGGTTCTTTCT-3’，CR-R2：5’-AACTCGGGTTAATCGTAT-3’。

扩增反应体系为50 μL体系。

其中包括3 mM MgCl2，50 mM KCl，10 mM Tris-HCl(pH8.3)，250 μM dNTPs，1 U Taq 酶(Tiangen，Beijing)，0.2 μM引物，1 μg小牛血清，约为15 ng的DNA。

反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸1 min，进行40个循环。

PCR产物直接4℃保存。

扩增产物CR分别为1100 bp和700
bp左右。

1.4 PCR产物纯化与目的片段的测序
为了保证CR扩增的准确性，PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，将未能扩增的样品重复实验一次。

PCR产物纯化试剂盒(上海生工)纯化产物，然后将PCR产物送到上海Invitrogen公司进行测序。

1.5 数据处理
将所测DNA序列在GenBank数据库中进行Blast比较，以确保粪便样品与目标
物种一致。

测得的序列用SeqMan 和EditSeq(DNASTAR，Lasergene v 7.1)软
件进行拼接和校正。

同时还从GenBank数据库中下载来自西藏、四川和宁夏的8个岩羊线粒体CR单倍型全序列和采样数据一起分析。

定义西藏种群1种单倍型：CD(色达县)登录号JN840001；四川种群5种单倍型：GZ(甘孜县)登录号
JN840002，DB(丹巴县)登录号JN839995，KD1～KD2(康定县)登录号
JN839992～JN839993，YJ(雅江县)登录号EF420238；宁夏种群2种单倍型：HL1～HL2(贺兰山)登录号EF420240～EF420241。

利用ARLEQUIN v3.15 (Excoffier et al., 2005)计算核苷酸多样性(Nucleotide diversity，π)、单倍型多
样性(Haplotype diversity，h)；用MEGA v 4.0 (Tamura et al., 2007)的Kimura 双参数模型(Kimura，1980)计算单倍型之间的遗传距离。

以牛科动物已
校正的CR分子钟，每百万年10.6%基因替代速率结合分歧时间计算公式D=2αt (Li et al., 1981)计算金沙江河谷地带各种群之间的分化时间。

基于CR全序列用最大简约法(Maximum parsimony)，以野山羊Capra ibex作为外群(登录号
NC020623)。

利用PAUP v 4.0b软件(Swofford，2000)完成系统发生树的构建，MP以启发式搜索，聚类树中节点处的置信度用1000次自举法(Bootstrap)来完成。

2.1 岩羊和矮岩羊粪便样品鉴定
从金沙江河谷地带收集的岩羊粪便样品中，共有169份样品成功扩增和测序，其
中包括云南白马雪山自然保护区岩羊样品26份、罗尼神山矮个子岩羊样品45份，四川巴塘措普沟岩羊样品50份、竹巴笼矮个子岩羊样品48份。

测序结果经过SeqMan和EditSeq(DNASTAR，Lasergene v 7.1)软件处理，去除测序产物中的引物和重复序列后将两段产物进行拼接，得到的CR全序列长度为1226～1308 bp。

将所有CR序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，证明所有序列都来
自岩羊。

2.2 CR序列多态性
从所获取的CR全序列中，共定义了4个单倍型。

单倍型多态性(h)为0.68，核苷
酸多样性(π)为0.0242(表1)。

其中云南白马雪山自然保护区曲宗贡岩羊粪便DNA 中，有2个单倍型(QZG、BT)，单倍型多态性(h)为0.36，核苷酸多样性(π)为
0.0281，罗尼神山矮个子岩羊单倍型1个(LN)；四川巴塘措普沟岩羊单倍型1个(CPG)，竹巴笼矮个子岩羊单倍型也仅有1个并且与曲宗贡的其中一个单倍型(BT)共享。

这4个单倍型CR全序列已经提交到GenBank，登录号为KC309394～
KC309397。

利用Kimura双参数法计算各单倍型之间的遗传距离，4个单倍型遗传距离为0.005～0.084(表2)。

根据分歧时间的计算方法，结果显示林线以上的岩羊和林线以下的矮个子岩羊分歧时间大约在39万年前到32万年前之间。

2.3 基于CR全序列12个单倍型构建岩羊系统发育树
基于岩羊的CR全序列12个单倍型，以山羊属的野山羊作为外群，采用最大简约
法(MP)构建单倍型之间的系统发生树。

从图1可以发现：四川种群和宁夏种群明
显分为两个大支系，金沙江河谷地区的4个采样地理种群又分别划分到四川种群
的两个亚支系中。

为了获取种群间遗传信息，利用粪便DNA分析技术研究栖息在金沙江河谷地区的林线以上岩羊和林线以下矮个子岩羊具有很高的应用价值。

从河谷地区的4个地
理种群所收集的226份粪便样品中，共有169份样品扩增并测序得到线粒体CR
全序列，有效样品率为74.7%。

尽管在收集粪便样品时，在当地导游的带领下追
寻它们的活动范围，第一时间用无水乙醇固定保存采集看似新鲜的粪便，但是岩羊的栖息地环境海拔高、紫外线强、雨水冲刷；矮个子岩羊的栖息地位于干热河谷，气温较高等环境因素不可避免的导致一部分样品无效。

因此，野外所收集到的样品的新鲜程度是后期获取遗传信息的一个关键要素。

以线粒体基因CR作为母系遗传标记，我们从金沙江河谷地带的169份岩羊有效
样品中仅发现了4种单倍型。

线粒体DNA单倍型在群体中所占的比例直接影响到核苷酸多态性的值，它的值越高则种群的遗传多样性越高。

经软件计算显示，河谷地区分布的岩羊种群整体上核苷酸多样性水平较低(π=0.0242)。

这一数据均低于
其他珍稀物种，如青藏高原红颈雪雀线粒体核苷酸多样性为0.042(Qu et al., 2005)，英国马鹿线粒体核苷酸多样性为0.056(Hmwe et al., 2006)。

栖息地环境的破坏，如当地牧民过度放牧、过量砍伐树木、人为的捕猎行为等都会严重影响到种群数量和繁殖(王淯，王小明，2003)；地理种群之间栖息地片段化，造成彼此
间长期缺少基因交流导致种群内部近亲繁殖，影响下一代适应环境的能力。

这些原因都可能导致整个种群单倍型多样性水平较高，而核苷酸多样性水平较低。

Allen(1940)对矮个子岩羊的宏观研究认为它们仅生活于海拔4000 m以下的草地、岩石和草丛，在森林中未曾发现有分布。

许多学者认为在海拔2800～4200 m 之
间分布的常绿阔叶林、亚高山针叶林将岩羊和矮个子岩羊的栖息地分隔开，阻碍了两者间的交流(Wang & Hoffman, 1987；Hass，1990)。

本研究发现林线以上的岩羊和林线以下矮个子岩羊之间的遗传距离有一定的差距，同时进化树显示，林线以上2个地理种群的岩羊和林线以下2个地理种群矮个子岩羊分别被划分到四川
种群的2个亚分支里，这些结果和宏观上的研究是一致的。

但是，云南曲宗贡林
线以上的部分岩羊和四川竹巴笼林线以下的矮个子岩羊在线粒体CR单倍型的共享
现象与这里的地理环境未形成对应关系。

通过分子钟计算显示，金沙江河谷地带林线以上的岩羊和林线以下的矮个子岩羊分歧时间大约在39万年前到32万年前之间，正处于中更新世早中期(105～36万年前)(曹兴山，1996)。

这一时期的全球气候不断波动的冰期和间冰期都会引起森林植被发生更替(杨怀仁，1987)，食物源
的变化引起岩羊和矮个子岩羊越过林线进行相互迁徙。

因此，为了更好的保护矮个子岩羊，可以将矮个子岩羊作为独立的保护管理单元(MU)，并在低海拔矮个子岩
羊种群与高海拔岩羊种群的林线之间建立人工廊道，为群体的迁移提供保障，这样将有利于增加各种群之间的基因交流，提高群体内部的遗传多样性。

我们建议将白马雪山自然保护区到竹巴笼自然保护区之间的金沙江河谷地带作为岩羊和矮个子岩羊的栖息地完整保护起来。

需要指出的是，本研究采样地点有限，粪便样品在收集过程中难免会出现重复采样，并且遗传标记只涉及到线粒体母系遗传。

因此，需要进一步扩大采样地点，结合核基因标记及个体鉴定技术进一步研究它们的种群结构。

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*通讯作者Corresponding author，E-mail:*****************。