MEW06产几丁质酶响应面发酵条件优化研究

MEW06产几丁质酶响应面发酵条件优化研究
几丁质又称壳多糖，它广泛存在于甲壳类动物的外壳、软体动物的器官（例如乌贼的软骨）、昆虫的甲壳和围食膜以及真菌类的细胞壁中。

其降解产物几丁寡糖的生理生化功能越来越引起人们的注意, 但是工业上制备几丁寡糖步骤多，成本高。

因此，使用几丁质酶来生物降解几丁质生产几丁寡糖是一条切实可行的途径［1, 2］o
粘质沙雷氏菌（Seiratia marcescens）亦称灵杆菌，广泛分布于自然界中，是水和土壤中的常居菌群，属于沙雷氏菌属。

粘质沙雷氏菌作为高产几丁质酶的菌种，能产生蛋白分子量分别为21 kDa> 36 kDa> 48kDa、52kDa和57 kDa的5种几丁质酶［3, 4］。

以本室从自然界中筛选到的一株高产几丁质酶的菌株（经鉴定为粘质沙雷氏菌, 命名为MEW06）为材料，对该菌株的摇瓶发酵条件进行单因素实验，得到了最适的pH值、装液量、接种量、最适温度和转速，在此基础上，通过Plackett -Burman设计、最陡爬坡试验和响应而法Box- Behnken设计试验，对MEW06产几丁质酶的发酵培养基条件进行优化，以提高MEW06产几丁质酶的能力，为进一步研究该菌株的实际应用提供实验依据。

2材料与方法
2.1微生物菌株
本研究从武汉沙湖水样中，筛选得到能高产几丁质酶的粘质沙雷氏菌MEW06。

2.2仪器与试剂
细粉几丁质购于上海Sigma公司;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、硫酸锌等均购于国药化学基团化学试剂有限公司；电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；高速离心机（Centrifuge5415D, Eppendorf）;恒温摇床培养箱（HZQ-Q,哈尔滨东胜电子技术开发有限公司）。

2.3培养基
基础培养基：细粉几丁质10 g、蛋口月东10 g、K2 HP04 0.7 g、KH2P04 0.3 g、MgS04-7H20 0.5 g、FeS04.7H20 0.01 g 和ZnSO4、0.01 g,去离子水溶解定容至1000 mL, pH 6.8。

发酵初始培养基：同基础培养基。

2.4实验方法
2.4.1几丁质酶活力的测定方法
（1）N-乙酰葡萄糖胺标准曲线的绘制：将N-乙酰-D-氨基葡萄糖（NAG）标准液、蒸馆水和3, 5-二硝基水杨酸（DNS）试剂依次加入带塞的试管，配制成不同含量的N-乙酰氨基葡萄糖反应液。

混匀后，沸水浴10 mine充分冷卻后，以0号管为对照调零，在535 nm
测定吸光度值。

每个试管重复3次。

将三组数据取平均值，绘制成标
准曲线，见图2。

线性方程为丫一-0.0249+0.153X（线性相关系数R2-0.9940）o
几丁质酶酶活的定义为：一个单位的几丁质酶酶活定义为37C°下2h产生1 jjmol NAG所需几丁质酶的酶量。

（2）发酵上清液几丁质酶活力的测定方法。

采用3, 5 —二硝基水杨酸（DNS）法测定。

挑取水解胶体几丁质效果比较大的菌落，接种到初筛培养基中，于30C°, 150r/min培养3d后,4C°, ***** r/min 离心收集上清液，并做如下处理：取2 mL上清液沸水浴15 mm,作为第1组（注意密封，防止溶液体积明显减少）;另取ImL不做处理，作为第2组。

吸取1 mL的第1组发酵上清液，加入500 uL配置好的2%胶体几丁质（pH6.0）, 500 IJ LPBS缓冲液（PBS终浓度为50mM, pH 7.2〜7.4）。

空白对照用第2组发酵上清液替换第2组发酵上清液。

混合均匀后，37C°水浴反应2h。

*****「/min离心5 min。

分别取上清 1 mL加入相同体积的DNS溶液沸水浴10 mine稀释10倍后，测定稀释液在535 nm处的吸光值。

对照NAG标准曲线，求出几丁质酶的活性（图2）。

菌株发酵上清液的酶活力（E）—第2组发酵上清液酶活力（E2）-第1组发酵上清液酶活力（EI）。

将MEW06菌株接种到基础培养基中，以培养基初始pH 7.0,装液量35%,接种量3%,培养温度30C°,转速150 r/min为初始条件。

分别以2.0%的甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉和粉末几丁质作为基础培养基中的碳源，研究不同碳源对产几丁质酶活的影响，并选择最适碳源。

在相同的初始条件下，分别以2.0%的酵母粉、牛肉膏、玉米浆、豆粕、硫酸鞍和氯化镀作为基础培养基中的氮源, 研究不同氮源对产几丁质酶活的影响，并选择最适氮源。

2.4.3
Plackett - Burman 设计
通过SAS9.2统计分析软件对L9 （34 ）正交实验分析，选取8个发酵培养基的主要成分（淀粉、胶体几丁质、蛋白月东、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O> FeSO4.7H20 和ZnS04）作为8 个因子，每个组分设置低水平°一T和高水平J”的2个水平，采用8因子2水平的Plackett - Burman设计，对MEW06产几丁质酶的条件进行优化。

相关Plackett - Burman设计的条件如表1所示--10］。

2.4.4最陡爬坡路径实验
通过SAS 9.2统计分析软件对Plackett - Burman设计分析，选取3个影响最大因素（淀粉、胶体几丁质和K2 HP04）作为最陡爬坡路径法的最大增长的方向。

采用通过三因素试验次数N7的最陡爬坡路径试验，对MEW06产几丁质酶酶条件进行优化。

最陡爬坡路径试验条件如表2所示［8-20］。

2.4.5响应而Box - Behnken试验设计优化
通过最陡爬坡路径试验的结果选取3个影响最大因子（淀粉、胶体几丁质和K2 HP04）的最优组合作为BOX- Behnken试验的3个因素，每个因子分别设置低（一2）、中（0）和高（2） 3个水平，采用3因素3水平的BOX- Behnken试验设计对MEW06产几丁质酶活进行优化。

相关Box- Behnken设计的条件如表3所示。

3结果与分析
不同碳源对MEW06产几丁质酶活的影响见图2o将2%细粉几丁质、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和可溶性淀粉分别作为基础培养基中的碳源，氮源为2%蛋口月东，最适培养条件下，培养3d后, 4C。

，***** r/min离心收集上清液，依次测定MEW06摇瓶发酵上清液几丁质酶活。

碳源影响酶活由高到低依次为：可溶性淀粉蔗糖甘油葡萄糖细粉几丁质麦芽糖乳糖。

因此，选择可溶性淀粉作为最佳碳源。

不同氮源对MEW06产几丁质酶活的影响见图3o将2%蛋口月东、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、豆粕、硫酸镀和氯化镀作为基础培养基中的氮源，碳源为2%细粉几丁质，最适培养条件下，培养3d后，4C。

，***** r/min离心收集上清液，依次测定MEW06摇瓶发酵上清液几丁质酶活。

氮源对酶活的影响由高到低依次为：蛋口腺酵母粉牛肉膏豆粕玉米浆硫酸镀氯化镀。

因此，选择蛋白腺作为最佳氮源。

3.2
Plackett- Burman 试验设计
培养基中的8个因素（淀粉、胶体几丁质、蛋白月东、K2 HP04、KH2P04、MgS04-7H2 0> FeS04・7H2 0 和ZnS04）被选择采用八因子二水平的Plackett - Burman试验设计（试验次数N二12）进行一阶优化，筛选对MEW06摇瓶发酵条件优化最显著性影响的3个因素。

Plackett- Burman试验设计的结果如表4所示。

最高的几丁质酶酶活（第N二I组）达到了186.45 U/mLo采用SAS 9.2软件对表4结果进行分析，分析结果见表5。

表中t值0时，优化培养基时应倾向于选择T水平，t值0优化培养基时应倾向于选择水平。

因此，培养基配方优化为：淀粉（1）、胶体几丁质（-1）、蛋口腺（-2）、K2 HPO4 （・2）、KH2 P04 ⑴、MgS04.7H20（-l）> FeS04-7H20（-l）和ZnSO4 （-l）o表中的P「值为显著性概率，当P「0.05时，说明此因子影响显著，当P「0.02時，说明此因子影响极显著，Pr值越小时，说明此因子影响越显著。

因此，八个因素对MEW06产几丁质酶活影响的排序为：淀粉K2 HP04 胶
体几丁质ZnS04FeS04.7H20 MgS04.7H20 KH2P04 蛋口腺。

因此，选择淀粉、K2 HP04和胶体几丁质作为进一步优化的三个因子。

3.3最陡爬坡路径试验
最陡爬坡路径试验设计结果如表6所示，MEW06发酵产几丁质酶，其酶活随着淀粉、胶体几丁质和K2 HP04的添加量增加而增加。

当实验号N二3时，淀粉20 g/L,胶体几丁质0.8/1000 wt/vol和K2 HP040.56 g/L时，MEW06发酵产几丁质酶的酶活达到最高为191.19 U/mLo之后，MEW06发酵产几丁质酶的活力，随着淀粉、胶体几丁质和K2 HP04的添加量增加而减少。

当实验号N二7时，粉40 g/L, 胶体几丁质1.6/1000 wt/vol 和K2 HP04 1.12 g/L 时，MEW06 发酵产几丁质酶活又出现了升高。

当实验号N二3时，MEW06发酵产几丁质酶活达到了最高，因此，选择此实验编号为响应面BOX-Behnken试验设计的中心点。

3.4响应面BOX- Behnken试验设计
响应面BOX - Behnken试验设计优化结果如表7所示。

采用SAS 9.2得到响应而BOX- Behnken试验设计优化分析结果如图4所示。

采用SAS9.2对三个因素的等值线图和响应而图如图5,6和7所示。

使用SAS9.2对Plackett - Burman试验设计优化得到的三个最重要影响因素淀粉，胶体几丁质和K2 HP04）进行一步的二阶优化，将得到的实验数据将进行二次回归拟合，根据方差分析，分析研究各因素之间的主效应和交互效应，求解方程组，最后代入相应的转换公式, 求得三个因素的最佳水平。

采用SAS 9.2对表7中数据进行分析得到一个二次回归拟合方程如下：
丫二- 1647. 35+165. 7547X1+*****. 3X2+912.1905 X3 - 5*****XIXI+*****X1X2 -16*****X1X3 - 3.9733E8X2X2 - *****.7X2X3-227.2109X3X3
分别对三个变量求一阶偏导数，整理二次回归拟合方程,令丫二O, 可以得到如下三元一次方程组:
对XI 求一阶偏导数：1165.7547 - 5.*****X1+***** X2- 16.*****X3=0 对X2 求一阶偏导数：”*.3十仙- 3.9733E8X2-***** 7X3=0
对X3 求一阶偏导数：922.1905 -16. ***** XI -*****.7 X2 - 227.2109X3=0
解方程组可知：X」17.5, X2二0.0008以及X3二0.56。

在此组合下MEW06发酵产几丁质酶活，理论值丫二200.13 U/mLo
为了验证理论值的正确性，采用上述优化组合，对MEW06进行摇瓶发酵，测得MEW06发酵产几丁质酶的酶活为297.32 U/mL,与理论的误差为1.40%,实验表明：通过单因素实验、Plackett - Burman 试验设计优化、最陡爬坡实验和响应IM BOX - Behnken试验设计，来优化MEW06产几丁质酶的发酵条件是可行的。

MEW06在优化培养基条件下，发酵上清液产几丁质酶活比优化前提高了 2.58倍（优化前产几丁质酶活为76.42 U/mL）o
因此，MEW06发酵产几丁质酶的最终优化配方为：在基础培养优化条件的基礎上（初始pH7,接种量3%,温度31C°,装液量35%）, 培养基的优化条件为：淀粉17.5 g/L,胶体几丁质8/1000 wt/vol,蛋白腺20g/L, K2HP04 0.56 g/L> KH2 P04 0.375 g/L> MgS04-7H20 0.5 g/L、FeS04・7H2 0 0.02 g/L、ZnS04 0.01 g/Lo
4讨论
几丁质是昆虫的围食膜、植物病原线虫卵壳和植物真菌细胞壁的重要组成部分，其主要是作为支撐身体结构的骨架，对机体起到保护作用。

几丁质酶可以以植物病害虫机体中的几丁质为标靶，应用到植物病虫害防治，前景十分广阔。

本实验室从自然界中筛选到一株能够高效产几丁质酶的粘质沙雷氏菌MEW06,通过采用响应而法对其发酵条件进行优化，使得优化后产酶的酶活比优化前提高了 2.58倍，高到197.32 U/mLo但是, MEW06菌株在抑制细菌和植物病源真菌的生长，以及杀灭秀丽隐杆线虫以及鞘翅目昆虫等方而的应用，以及在降解几丁质得到几丁寡糖方而的应用，还有待进一步研究，MEW06菌株有望在农业生防方面具有广阔的应用
前景。