血红蛋白的提取和分离基础知识
《血红蛋白的提取和分离》 讲义
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、引言血红蛋白是人体内一种重要的蛋白质，它在氧气运输和二氧化碳代谢中发挥着关键作用。
对血红蛋白的提取和分离是生物化学和医学研究中的重要操作，有助于深入了解其结构与功能，为疾病诊断和治疗提供依据。
二、血红蛋白的基本性质血红蛋白是一种由珠蛋白和血红素组成的结合蛋白，相对分子质量约为 64500。
它在红细胞中含量丰富，每个红细胞中约含有 28 亿个血红蛋白分子。
血红蛋白的主要功能是携带氧气和二氧化碳，其与氧气的结合具有可逆性，在氧分压高的肺部结合氧气，在氧分压低的组织释放氧气。
三、提取血红蛋白的材料选择1、新鲜血液通常选用哺乳动物的新鲜血液，如猪、牛、羊等。
新鲜血液能保证血红蛋白的活性和完整性。
2、抗凝处理在采集血液时，需要加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，以防止血液凝固。
四、血红蛋白提取的原理1、离心分离利用不同物质的密度差异，通过离心的方式将红细胞从血浆等成分中分离出来。
2、渗透破碎将红细胞置于低渗溶液中，使红细胞吸水膨胀破裂，释放出血红蛋白。
五、血红蛋白提取的步骤1、采集血液使用无菌采血针和采血管采集适量的新鲜血液，并立即与抗凝剂混合均匀。
2、离心分离红细胞将血液以一定的转速离心一段时间，使红细胞沉淀在离心管底部，上层为血浆等成分。
小心吸取上层液体，留下红细胞沉淀。
3、洗涤红细胞用生理盐水多次洗涤红细胞，去除血浆蛋白等杂质。
4、红细胞的破裂将洗净的红细胞缓慢加入到低渗溶液中，搅拌均匀，放置一段时间，使红细胞破裂。
5、离心获取血红蛋白溶液再次离心，使细胞碎片等沉淀，上清液即为血红蛋白溶液。
六、血红蛋白的分离方法1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称分子筛色谱法。
其原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，小分子物质能进入凝胶颗粒内部，而大分子物质则被排阻在颗粒外部，从而实现分离。
2、电泳法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
在血红蛋白的分离中，常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳等。
课题3 血红蛋白的提取和分离
④洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗
脱瓶，在50cm高的操作压下，
用300ml的20mmol/l的磷酸 缓冲液（pH为7.0）充分洗涤 平衡12小时。
注意：
液面不要低于凝胶表面， 否则可能有气泡混入。
不能发生洗脱液流干， 露出凝胶颗粒的现象。
3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面
打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口
（2）缓冲溶液的配制 通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比
例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液
在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是磷酸缓冲液，
目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)
5.电泳 （1）概念: 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 （2）原理 ①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所
带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。
（3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N‵—亚甲基 双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维 网状结构的凝胶 ②SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复 合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的是单条肽 链的分子量，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物， SDS所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩
SDS带有大量的负电荷
血红蛋白的提取和分离
血红蛋白的提取和分离1．蛋白质的分离方法(1)原理：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
(2)分离方法：①凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②电泳法：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2．实例——血红蛋白的提取和分离(1)样品处理与粗分离(2)纯化与纯度鉴定血红蛋白提取与分离中历次“除杂质”或“分离”的原理(1)凝胶色谱法：相对分子质量较大的分子先流出，分子质量较小的后流出，依此可对血红蛋白进行分离和纯化。
(2)透析法：利用透析袋只允许小分子透出的原理，去除小分子杂质，透析可实现对血红蛋白的“粗分离”。
(3)电泳法：利用分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
即不清楚血红蛋白释放时蒸馏水和甲苯的作用红细胞中依次加入蒸馏水和甲苯的作用：加入蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破；甲苯溶解细胞膜，从而使血红蛋白释放出来。
【练一练】血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。
请根据血红蛋白的提取和分离过程回答以下问题：(1)将上述实验流程补充完整：A为____________，B为_____________。
(2)洗涤红细胞的目的是去除____________；红细胞洗涤干净的标志是__________________。
释放血红蛋白的过程中起作用的试剂是__________________。
(3)在B过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_____________________________________________。
在蛋白质分离过程中，如果红色区带___________________________，说明色谱柱制作成功。
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白是红细胞中含有的一种蛋白质，具有运输氧气的重要功能。
血红蛋白的提取和分离，对于研究红细胞的结构和功能具有重要意义。
以下将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。
1. 血液采集
血液采集是血红蛋白提取和分离的第一步。
采集血液前需要做好消毒工作，以免造成感染。
通常采用采血针直接穿刺人体静脉进行采血。
采血过程中需要避免空气进入血管内，避免血液凝固。
2. 离心分离红细胞
血液样品采集后需要将其进行离心分离，从而将红细胞与其他血细胞分离开来。
离心分离的目的是利用红细胞在血液中的自身重量和密度不同来分离。
常用的离心分离方法是缓速离心法。
离心过程中，需要注意速度、时间和离心管的位置，避免红细胞和其他血细胞混合。
3. 血红蛋白提取
提取血红蛋白是将红细胞中含有的血红蛋白分离出来。
血红蛋白提取的常用方法是破细胞法和溶血法。
破细胞法是将红细胞破裂，使血红蛋白溶于液体中。
溶血
法是将红细胞置于一定浓度的盐水溶液中，使红细胞破裂，并分离出血红蛋白。
提取后的血红蛋白需要进行纯化和浓缩。
4. 血红蛋白性质分析
血红蛋白提取后需要进行性质和结构分析，从而了解血红蛋白的生化特性和分子结构。
常用的分析方法包括分子量测定、电泳分离和质谱分析。
这些方法不仅能够分析血红蛋白的基本结构和功能，还能够探究血红蛋白的异常变异和相关疾病。
以上是血红蛋白提取和分离的四个步骤，血红蛋白的提取和分离对于研究红细胞的结构和功能具有重要意义，未来还会有更多新的方法和技术被应用到血红蛋白的提取和分离研究中。
血红蛋白的提取与分离
血红蛋白的提取与分离血红蛋白是一种蛋白质，在红细胞中起着重要的运输氧气的作用。
血红蛋白结构复杂，可通过一系列的步骤进行提取和分离。
这篇文章将介绍血红蛋白的提取和分离过程。
1. 血红蛋白的提取血红蛋白的提取过程包括以下步骤：1.1 血液采集首先需要从供血者身体中采集血液。
在采集血液时需要使用无菌器材严格遵守卫生规范。
血液可以采用多种方式进行采集，如静脉采血或分离血浆和细胞等。
1.2 红细胞的分离红细胞是血液中含有血红蛋白的细胞，因此需要将其与其他细胞分离。
在现代分离技术中，离心、红细胞沉降法和滤纸法等都常用来分离红细胞。
1.3 血红蛋白的裂解在裂解血红蛋白之前，需要将红细胞中的膜蛋白和其他组分去除。
这个步骤可以通过再次采用离心、收集上清液的方式实现。
在获得裂解所需的含血红蛋白物质后，可以按照裂解液的pH值或添加特殊的裂解试剂来进行裂解。
1.4 血红蛋白的提取经过裂解后的血红蛋白可用于纯化和分离。
可以通过离心分离、色谱分离、电泳分离等方法来提取和分离血红蛋白。
2. 血红蛋白的分离对血红蛋白的分离过程包括以下步骤：2.1 血红蛋白的纯化纯化是分离血红蛋白的关键步骤，其目的是去除其他干扰因素，纯化血红蛋白。
可采用离心、柱层析、凝胶过滤等技术来实现血红蛋白的纯化。
2.2 血红蛋白的检测将提取和纯化得到的血红蛋白进行检测，以确保获得的血红蛋白的纯度。
检测过程中可以采用紫外吸收光谱法、电泳法等方法进行检测。
3.血红蛋白的提取和分离是一项关键的技术，在医疗和科研领域得到了广泛的应用。
这些步骤通常需要复杂的实验流程和严谨的实验技术，因此需要实验人员在实验过程中严格遵守相关的操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
血红蛋白提取和分离的四步
血红蛋白提取和分离的四步血红蛋白是存在于人类血液中的一种重要蛋白质，它承担着将氧气从肺部输送到身体各个组织和器官的重要功能。
因此，对血红蛋白的提取和分离具有重要的生物学意义和医学应用前景。
接下来将介绍血红蛋白提取和分离的四个步骤。
第一步：血样采集首先需要采集含有血红蛋白的血样。
一般来说，静脉采血是最常用的方法。
在采集血样之前，需要确保采血器具干净无菌，以避免外部微生物的污染。
同时，还要确保采集到的血样足够新鲜，以保证血红蛋白的活性和稳定性。
第二步：红细胞裂解将采集到的血样进行红细胞裂解，将红细胞膜破坏，释放血红蛋白。
一般可以使用生理盐水等溶液进行红细胞裂解。
在裂解的过程中，需要注意温度和pH值的控制，以确保血红蛋白的完整性和稳定性。
第三步：血红蛋白提取在红细胞裂解后，血液中的血红蛋白被释放出来，需要进行进一步的提取。
常用的提取方法包括离心、凝胶过滤、离子交换层析等。
通过这些方法，可以将血红蛋白从其他蛋白质和杂质中分离出来，得到比较纯净的血红蛋白样品。
第四步：血红蛋白分离最后一步是对提取到的血红蛋白进行分离。
根据血红蛋白的性质和不同的应用需求，可以选择不同的分离方法。
例如，可以利用凝胶电泳、高效液相色谱等技术对血红蛋白进行分离和纯化。
通过这些方法，可以得到高纯度的血红蛋白样品，为后续的研究和应用提供基础。
通过以上四个步骤，我们可以完成血红蛋白的提取和分离工作。
这些工作不仅有助于深入了解血红蛋白的生物学功能和结构特性，还为相关疾病的诊断和治疗提供了重要的基础。
希望在未来的研究中，可以进一步完善血红蛋白提取和分离的技术，为人类健康事业做出更大的贡献。
高中生物人教版选修一血红蛋白的提取和分离
【一题多变】 1．图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什
么？ 答案 负电荷，因为它们移向了阴极一端。 2．除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法 还有哪种？ 答案 琼脂糖凝胶电泳。
二、血红蛋白的提取和分离实验操作 1．样品的处理
(1)红细胞的洗涤 ①目的：去除杂蛋白。 ②方法 a．采集血样→b.低速短时间离心→c.吸取血浆→d.盐水洗 涤→e.低速离心→重复d、e步骤三次。
(3)作用 电泳利用了待分离样品中各种分子 带电性质 的差异及分子本 身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的 迁移速度， 从而实现样品中 各种分子的分离 。 (4)方法 常用的电泳方法有 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 测定蛋白质分子量时通常使用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 。
二、 血红蛋白提取和分离的实验操作与评价 1．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、
2．凝胶色谱操作
3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度 的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺 凝胶电泳。
4．结果分析与评价
项目
分析
①分层明显→样品处理完成
血液样 品的处
理
②分层不明 显的原因
洗涤次数少，未能 除去血浆蛋白 离心速度过高或 时间过长
(2)原理 ①由多孔球体 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 通道 。 ②当 相对分子质量 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质 量 较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 较长，移 动速度 较慢 ，而相对分子质量 较大 的蛋白质无法进入凝胶 内部的通道，只能在 凝胶外部移动，路程 较短 ，移动速度 较快 ，从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以 分离。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是人体内一种极其重要的蛋白质，负责运输氧气到身体的各个部位。
对血红蛋白的分离和提取，不仅有助于我们深入了解其结构和功能，还在医学诊断、疾病研究以及生物制药等领域具有重要意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先得准备好相应的材料和试剂。
新鲜的血液是必不可少的，通常可以从健康的志愿者或动物身上获取。
此外，还需要一系列的化学试剂，如磷酸盐缓冲液、生理盐水、抗凝剂等等，以及各种实验仪器，如离心机、分光光度计、电泳设备等。
在实际操作中，第一步是采集血液样本。
为了防止血液凝固，需要在采集过程中加入适当的抗凝剂。
采集后的血液要尽快进行处理，以保证血红蛋白的活性和完整性。
接下来就是红细胞的分离。
这通常通过离心的方法实现。
将采集到的血液放入离心机中，以适当的转速和时间进行离心。
由于红细胞的密度较大，会沉淀在离心管的底部，而上层则是血浆和白细胞等成分。
小心地吸取上层液体，留下沉淀的红细胞。
然后，对红细胞进行裂解，以释放出其中的血红蛋白。
这可以通过加入低渗溶液来实现。
低渗溶液会使红细胞的细胞膜破裂，从而释放出细胞内的物质，包括血红蛋白。
裂解后的混合物中含有大量的杂质，需要进一步的纯化处理。
纯化血红蛋白的方法有多种，常见的有盐析法、凝胶过滤法和离子交换层析法等。
盐析法是利用不同蛋白质在不同盐浓度下溶解度的差异，来分离和纯化蛋白质。
在血红蛋白的纯化中，可以逐渐增加盐的浓度，使其他杂质蛋白沉淀，而血红蛋白则留在溶液中。
凝胶过滤法是根据蛋白质分子大小的不同来进行分离的。
将裂解后的混合物通过装有特定凝胶的层析柱，大分子的蛋白质先被洗脱出来，小分子的则后洗脱，从而实现血红蛋白与其他小分子杂质的分离。
离子交换层析法则是基于蛋白质的带电性质进行分离。
选择合适的离子交换树脂，使血红蛋白能够与树脂结合，而其他杂质蛋白则不结合或结合较弱。
通过改变洗脱液的离子强度或 pH 值，将血红蛋白洗脱下来，达到纯化的目的。
在整个分离和提取过程中，每一步操作都需要严格控制条件，如温度、pH 值、离子强度等，以确保血红蛋白的活性和纯度。
血红蛋白的提取和分离书本知识背记材料
【血红蛋白的提取和分离】一、基础知识（一）凝胶色谱法1、凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。
2、凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。
3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
（二）缓冲溶液1、缓冲溶液的作用是能够抵制外界酸或碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变。
2、缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成的。
3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
（三）电泳1、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
2、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
电泳利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3、两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于分子大小，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一）样品处理1、红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（500r/min），然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%），缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种在红细胞中负责运输氧气的重要蛋白质。
对于血红蛋白的分离和提取，这不仅在生物化学和医学研究中具有重要意义，也在临床诊断和治疗中发挥着关键作用。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要准备合适的材料。
通常，我们会选择新鲜的血液作为起始原料。
为了避免血液凝固，会在采集血液的过程中加入适当的抗凝剂，比如肝素或柠檬酸钠。
接下来就是红细胞的分离。
这一步可以通过离心的方法来实现。
将采集到的血液放入离心机中，以一定的转速和时间进行离心。
由于红细胞的比重较大，经过离心后，它们会沉淀在离心管的底部，而血浆和白细胞等则位于上层。
然后，小心地吸取上层的血浆和白细胞，留下底部的红细胞。
得到红细胞后，下一步就是破坏红细胞以释放出其中的血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法。
将红细胞置于低渗溶液中，由于细胞内外的渗透压差异，红细胞会膨胀并破裂，从而释放出细胞内的血红蛋白。
然后是去除杂质。
这其中包括细胞膜碎片、其他细胞内的蛋白质和核酸等。
可以通过再次离心的方式，将杂质沉淀下来，而上清液中则含有较纯的血红蛋白。
在分离和提取血红蛋白的过程中，还需要用到一些特殊的试剂和设备。
例如，为了保持蛋白质的活性和稳定性，可能会使用缓冲溶液来控制反应体系的酸碱度和离子强度。
常见的缓冲溶液有磷酸盐缓冲液、TrisHCl 缓冲液等。
同时，还可能会用到层析技术来进一步纯化血红蛋白。
层析技术有多种类型，如凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等。
凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析则是利用蛋白质所带电荷的差异；亲和层析则是基于蛋白质与特定配体之间的特异性结合。
在进行凝胶过滤层析时，将含有血红蛋白的样品加到填充有特定凝胶颗粒的层析柱上。
较小的分子能够进入凝胶颗粒内部的孔隙，而较大的分子则被排除在外，从而实现分离。
离子交换层析则是根据血红蛋白的带电性质进行分离。
层析柱中填充的离子交换剂带有特定的电荷，当带有相反电荷的血红蛋白通过层析柱时，会与离子交换剂结合。
生物选修血红蛋白的提取和分离
实验结束后，应按照规定正确 处理实验废弃物，确保实验室
和环境安全。
安全防范措施
防毒防害
在实验过程中，应佩戴合适的个人防护装备，如化学防护 眼镜、化学防护服、化学防护手套等，防止有毒有害物质 侵入人体。
防机械伤害
在实验过程中，应避免使用不合适的工具或设备，防止机 械性损伤。同时，应定期检查实验室设备是否完好无损。
防火防爆
在实验过程中，应远离火源和易燃易爆物品，避免使用明 火加热和产生火花。同时，应定期检查实验室消防设施是 否完好有效。
防触电
在实验过程中，应避免接触带电设备和线路，防止触电事 故发生。同时，应定期检查实验室电气设施是否符合安全 标准。
THANKS
感谢观看
离心机、分液漏斗、研钵、滤纸 、尼龙布、蒸发皿、玻璃棒
实验原理
血红蛋白是一种含铁的蛋白质，具有与氧结合的能力，因此具有运输氧的功能。
通过将红细胞破碎，分离出血红蛋白，可以研究其结构和功能。
在实验中，利用不同物质在溶剂中的溶解度不同进行分离，采用离心、过滤和蒸发 等方法提取和分离血红蛋白。
实验步骤
生物选修血红蛋白 的提取和分离
contents
目录
• 血红蛋白简介 • 血红蛋白的提取 • 血红蛋白的分离 • 血红蛋白的应用 • 实验注意事项与安全防范措施
01
血红蛋白简介
血红蛋白的组成
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，其 中珠蛋白是由两条α-珠蛋白和两条β珠蛋白组成的四聚体，血红素则是一 个含铁卟啉的化合物。
生物传感器
血红蛋白可用于生物传感器的制备，通过与特定物质结合，实现对氧气、二氧 化碳等物质的检测。
生物燃料
血红蛋白可以作为生物燃料的生产原料，通过发酵等技术将其转化为可再生能 源。
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第15课时血红蛋白的提取和分离1.归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。
(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。
(3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。
(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。
2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。
3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。
课堂导入蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。
因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。
探究点一蛋白质分离技术生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。
1.蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。
2.分离的方法(1)凝胶色谱法Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。
Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)①蛋白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
(2)电泳①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
②原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
③常用方法a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状的不同而不同，从而得以分离。
b.聚丙烯酰胺凝胶电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
(3)缓冲溶液①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱或稀释的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。
②缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。
调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
小贴士缓冲溶液常见的有三类1弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。
2多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。
3弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。
归纳提炼凝胶色谱法和电泳法凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。
电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。
活学活用1.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因( )A.分子带电性质的差异B.分子的大小C.分子的形状D.分子的变性温度[问题导析] 电泳法是在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
答案D解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。
探究点二血红蛋白的提取和分离每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离蛋白质的方法。
1.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
2.样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白；②方法：采集血样，低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中：①加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破；②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜；③置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂；④红细胞破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层：②将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。
(4)透析①原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为，透析12 h。
③目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。
b.用于更换样品的缓冲液。
3.凝胶色谱柱的制作(1)取长40 cm，内径为 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
(2)柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。
(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。
(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。
4.凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量↓(2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液↓(3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上↓(4)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内↓(5)洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密5.纯度鉴定——电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。
鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
归纳提炼实验注意事项(1)红细胞的洗涤①离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。
②重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。
(2)色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2 h。
这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。
(3)凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。
①在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。
因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
②在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
(4)蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。
根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。
活学活用2.下列说法不正确的是( )A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内[问题导析] 透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
答案D解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。
透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质( )A.路程较长，移动速度较慢B.路程较长，移动速度较快C.路程较短，移动速度较慢D.路程较短，移动速度较快答案D解析凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
2.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是( )A.维持溶液浓度不变B.维持溶液酸碱度不变C.催化蛋白质分离过程顺利完成D.无实际意义答案B解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。
3.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的叙述，正确的是( )A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为的磷酸缓冲液中透析12 h答案C解析红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水，血红蛋白释放中加入蒸馏水，透析时缓冲液pH应为而不是。
4.凝胶色谱柱制作成功的标志是( )A.凝胶装填紧密、均匀B.凝胶色谱柱中有气泡C.洗脱中，红色区带均匀一致地移动D.洗脱中，红色区带偏向左边移动答案C解析洗脱过程中，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
5.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
据图回答下列问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。