关于布鲁氏菌试管凝集试验课件

器材与试剂
虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂 玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量 加样器、混合棒或牙签
试验方法
在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎 红平板抗原0.03ml，充分混匀，在5分钟内 观察结果。
(四) 结果判定
有二种方法，第一种是，出现可见的凝集反应就判为阳 性；
血清学检查既可协助早期诊断，还可 确定是IgM抗 体，可以用凝集试验或抗人球蛋白试 验检测．
感染３周后，患者血清中出现IgG抗体， 可以用补体结合试验，荧光抗体或 ELISA检测．
虎红平板的凝集反应（RBPT）
原理
该试验又称为班氏孟加拉红平板凝集 试验。由于所用的抗原是酸性 （PH3.6—3.9）带色的抗原，该抗原 与被检血清作用时能抑制血清中的IgM 类抗体的凝集活性、检查出的抗体是 IgG类，因此提高了该项反应的特异性。
遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂 的加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要 按要求，否则都影响结果。每份血清和抗原均要 有对照。
高渗盐水作凝集反应，一般浓度在10~12%，一 般切记人血清不能用高渗盐水。
作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即 稀释度低的血清管内(或血清量多的格)不发生凝 集，而稀释度高的管内(或血清量少的格)出现凝 集，这叫做前带现象。如果某血清在平板凝集反 应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做 几个管，多采用几个稀释度。
此法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检 疫；
此法有一定敏感性，检查牛的阳性率稍高于绵羊、 山羊。
因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检 查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合 试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白 （Coomb’s0）试验有较高的吻合率。
该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备 抗原应予以检查、标化方可应用。
“++++”完全凝集，上清液100%清亮
“+++” 几乎完全凝集，上清液75%清亮 “++”显著凝集，上清液50%清亮 “+” 微量凝集，液体25%清亮 “-” 无凝集，液体不清亮 确定每份血清滴度是以出现“++”及以上的
凝集现象的最高血清稀释度
诊断标准
没有进行过菌苗接种的人、畜血清试验的标准是： 人、牛、马、鹿、骆驼等大家畜血清为1：
对照管的制作: 抗原对照（适当稀释的抗原加石碳酸盐水） 被检血清对照 阴性对照（阴性血清稀释后加抗原） 阳性对照（阳性血清稀释到原有滴度加抗原）
然后将试验管和对照管充分 混匀后，放于37℃温箱中 20-22小时后取出，在室温 下放置2个小时，以比浊管 为标准判定结果。
结果的判定
判定比浊管的制备:每次试验须配制比浊 管作为判定的标准依据.
100%
0.75
75%
0.50
50%
0.25
25%
0.00
0%
标记
++++ +++ ++ ＋ －
结果记录
根据各管中上层液体的清亮程度记录结果， 特别是50%清亮度（++）对判定结果关系 较大，一定要与比浊管对比判定
血清对照为清亮透明无沉淀,抗原对照为均 匀混浊在两种对照管都成立的情况下，才 可判定试验管，否则应重做。对沉淀需要 经验判定。
操作步骤
加入抗原:先以0.5%石碳酸生理盐水将抗原原液做 适当稀释（一般是作1:10稀释）,稀释后的抗原加 入各稀释的血清管（第一管不加，作为血清对 照）,每管0.5毫升,混匀。加入抗原后，第二管至 第五管每管总量为1毫升，从第二管起血清稀释度 分别为1:25 1:50 1:100 1:200，从第一管再吸出 0.5毫升，剩1毫升。
关于布鲁氏菌试管凝 集试验
免疫学基础
由于布鲁氏菌培养的营养条 件苛刻而且时间长，所以布 鲁氏菌的血清学诊断越来越 受到重视。
主要是根据相应抗原抗体可以
在体外发生特异性结合并呈现可见 反应的原理,用已知抗原(或抗体)检 测体液中未知的抗体(或抗原).由于 试验时通常是用患者血清作为待检 材料,所以检测抗原抗体的体外试 验又称为血清学试验或血清学反应.
试管凝集试验
1897年莱特氏等(Wright)与其同 事发现患该病的病人血清与马尔 他细菌的培养物产生了凝集现象， 遂称之为莱特氏凝集反应，成了 迄今常用的血清学诊断方法之一。
设备及试剂
试管凝集抗原 被检血清 0.5%的石碳酸生理盐水 吸管 试管 试管架 孵箱
操作步骤
被检血清的稀释:一般情况下,每份血清用5支小试 管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理盐水,第二管不 加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸 管吸取被检血清0.2毫升,加入第一管中,混匀。混 匀后, 以该吸管吸取第一管中血清加入第二和第 三管各0.5毫升，以该吸管将第三管混匀，并吸 取0.5毫升加入第四管,依次稀释到第五管,混匀后 从第五管吸出0.5毫升弃去.如此稀释后,从第二管 起血清稀释度分别为1:12.5 1:25 1:50 1:100
另一种用“+”表示凝集程度按下列标准用加号记录反应 强度：
++++：出现大的凝聚片或小的粒状物，液体完全透明， 100%凝集
+++：有明显的凝聚片，液体几乎完全透明，75%凝集 ++：有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集 +：液体混浊，只有少量粒状物，25%凝集 -：液体均匀混浊
评价
100( ++)及以上者为阳性，1：50(++)为可疑。 猪、羊(绵羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：
50(++)及以上者为阳性，1：25(++)为可疑。 对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查，
以便进一步确定诊断。
影响试验结果的因素及注意事项
受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处 温度不能超过10℃，采血后应于3—4日内进行检 查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。
配制方法是:取本次试验用的抗原稀释液 （一般1:10）5-10毫升，加入等量的 0.5%石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下 表配制比浊管
比浊管的配制
试管凝集反应标准比浊管配制
管号 抗原稀释液（ml） 生理盐水（ml） 透明度
1 2 3 4 5
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
1.00