参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定(DOC)
蔗糖酶的分离提纯讲解
蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。
2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。
【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。
蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。
它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H 葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。
在微生物中，酵母中的含量很丰富。
在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。
研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。
从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。
【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；CH 2OHH OHHHOHCH 20H(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计；(9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
加样，洗脱：
将平衡好的DEAE—Sepharose FF上端的水小心吸干，留 下一薄层液面，用长滴管将样品液5 ml，沿管壁环形慢慢 加进柱内，待样品液全部进入DEAE—Sepharose FF内， 只剩下一薄层液面时，用buff环形缓慢填满层析柱， 立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml，另一杯中装50ml buff含0.5mol/LNaCl），打开洗脱杯控制开关，开动磁力 搅拌器，用蠕动泵控制流速为3 ml/ 15min。 洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每6 min收集一管(约3~4ml)。洗脱至混合器中液体流完为止， 比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中， 均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液(Ⅳ) 测定酶活和蛋白量。(洗脱时，流速为0.5ml/分钟-1ml／分 钟、4ml接收一管)
干扰因素：
酚类、柠檬酸； 干扰双缩脲反应的基团； 氨基酸或肽的缓冲剂。 任何通过氮或碳原子把两个羰基连在一起的化合物都 能产生阳性结果
优缺点：
操作简便，灵敏度高，可测范围25-250微克蛋白质。 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度 稍有不同，标准曲线也不是直线形式。 可测范围25—250ug蛋白质，而紫外的范围大200— 2000ug。
九、实验结果与分析
附：仪器调节指标
恒流泵
流速：3ml/10min
核酸蛋白自动检测仪
纪录仪 自动收集器 上样量
A: 0.2
V: 20mv 走纸速度：0.5mm/min
6min/tube 共25tube 5ml
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
第二部分 DEAE-Sepharose FF柱层析
DEAE—Sepharose FF处理:（ 按说明书处理） 取适量DEAE- Sepharose Fast Flow，加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时， 用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性， 抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅 匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性， （DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。 浸入0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液中。
实验十四 酵母蔗糖酶
分离、 纯化、活力测定、电泳检测
蔗糖酶的提取纯化
一、实验目的和要求：
了解离子交换层析的基本原理。 掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。 熟悉有关生化技术的操作方法。
二、实验原理
蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等 量的葡萄糖和果糖。因此，每水解1 mol 蔗糖， 就生成2 mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法， 如Nelson 比色法、斐林试剂法等。 本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理， 乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶 （invertase），并对其性质进行测定。
1蔗糖酶的提取
实验报告课程名称：生物化学实验（甲）指导老师：杨劲树 同组学生姓名：一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理四、实验方法和步骤六、实验结果和分析一、实验目的和要求1. 掌握蔗糖酶的提取纯化的操作方法。
2. 熟悉有关生化技术的基本操作。
二、实验内容和原理1、酵母细胞破碎本实验采用研磨的方法。
通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。
由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。
三、实验材料和主要仪器1、实验材料：市售干酵母粉2、实验试剂：⑴ 石英砂⑵ 95%乙醇(-20℃）⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液3、实验仪器（1）电子天平（称量样品）（2）研砵（每组一套）（3）50ml 高速离心管（4支/组、离心管架1个/组）（4）托盘天平（离心管平衡用）（5）高速冷冻离心机（6）恒温水浴箱（50℃）（7）制冰机（8）1.5ml 离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架（9）－20℃冰箱实验名称：_ __________________姓名： 学号：四、实验方法和步骤1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉10g ，约3g 石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I ）,另留1ml 上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE 分析。
实验操作指导书：蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂：1. 啤酒酵母2. 二氧化硅3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下）4. 去离子水（使用前冷至4℃左右）5. 冰块、食盐6. 1N乙酸7. 95%乙醇三、仪器：1. 研钵1个2. 离心管3个3. 滴管3个4. 量筒50ml 1个5. 水浴锅1个6. 恒温水浴7. 烧杯100ml 2个8. 广泛pH试纸9. 高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。
二氧化硅要予先研细。
（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。
研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。
剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。
2. 热处理（1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
参考教案-蔗糖酶的提取纯化与鉴定.doc
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶（E. C. 3. 2. 1. 26）（卩一D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1, 2-糖苻键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖1.36〜1.60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆屮的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
蔗糖酶以阿种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%糖成分的糖蛋白。
在细胞脫内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含宥少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比PJ 酶多两个氨基酸，Ser和Met,它们的分子量也不同，外酶约为27万（或22万，与酵母的来源有关），内酶约为13.5万。
尽管这W种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分和似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量來测定。
一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。
比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。
（本实验以酵母为原料）一、教学0的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和幵展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。
本实验为学生提供一个较全而的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，里然操作难度较大，所需要的实IX!较长（64学吋），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化——生化实验文档资料文档
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3. 95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液 （四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
“蔗糖酶的分离纯化及鉴定”实验目标及PBL问题
实验一、蔗糖酶的提取及粗分离一、实验目标1. 选择含蔗糖酶丰富的、价廉物美的材料，采用提取得率比较高的方法进行蔗糖酶的提取，得到初提取液。
2. 对初提取液进行初步分离，为后续的纯化提供样品。
二、导学问题1．蔗糖酶的用途，研究蔗糖酶的意义？蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)叉称转化酶(Invertase)。
可作用于B-1，2糖苷键，将蔗糖水解为n葡萄糖和n果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值‘“。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
10分2．蔗糖酶有哪些性质？包括酶的适用pH和温度、等电点等。
蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5。
CuCl：对蔗糖酶有激活作用，而AgC]对蔗糖酶则其抑制作用，NaCI，KCl，FeSO。
对蔗糖酶活性无明显作用，但相对活力都保持在70％以上。
等电点5.610分3．蔗糖酶存在于什么材料中？你选择哪种材料来提取？为什么？ 10分4．蔗糖酶属于胞内酶，提取前需要破壁，破壁方法有哪些？ 15分5．蔗糖酶提取溶剂如何选择？为什么？ 10分7．蛋白质的粗分离方法有哪些？各有什么优缺点？如何选择？ 25分实验二、蔗糖酶的层析分离（一）一、实验目标根据初步纯化以后的样品性质选择一种柱层析方法进行纯化，目标是纯化效果好，回收率高。
二、导学问题1．蛋白质层析分离方法有哪些？ 10分2．各层析分离方法的原理？适用范围？ 15分3．准备用哪种层析方法进行纯化？ 5分4．针对本实验的层析方法，选择实验条件有哪些？如何选择？ 10分5．如何评价纯化方法的优劣？ 10分6．如何快速测定纯化过程中样品的酶活力？5分7．什么是穿透峰？穿透峰中包含哪些物质？ 10分8．穿透峰如果有酶活需要保存作为下个实验的样品吗？为什么？ 10分9．什么是柱子的平衡？平衡的目的是什么？ 5分10. 梯度洗脱方法有哪几种？各有什么优点？ 10分11. 洗脱液的 pH如何选择？ 5分12. 实验过程中要注意的事项？ 5分实验三、蔗糖酶的层析分离（二）一、实验目标根据上个实验纯化以后的样品性质选择另一种层析方法进行纯化，目标是纯化效果好，回收率高。
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定酶的纯化一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26),本实验以酵母为原料,通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤,提取蔗糖酶,并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。
离子交换层析法(ion-exchange chromatogramphy,简称IEC)中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM-纤维素),阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合,结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力,这又与溶液的pH值有关,因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。
盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力,因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度 (或两者同时改变)来实现。
与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。
梯度洗脱是在洗脱过程中,使洗脱液的pH值(或两者同时)发生连续的变化,从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。
二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料干酵母2、仪器(1)高速离心机 (2)恒温水浴锅 (3)层析柱(1.0cm×16cm)(4)梯度混合器(5)部分收集器3、试剂(1) 95% 乙醇溶液 (2) DEAE-Sepharose Fast Flow (3) 1mol/L醋酸溶液(5) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)(6) 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(内含1mol/L NaCl溶液)pH值7.3三、操作步骤1、破碎细胞取15g 干酵母,加5~10g石英砂,置于预先冷却的研钵中,加30ml去离子水,研磨30min,在冰箱中冰冻约20~30min(研磨液面上刚出现冰结为宜),重复2次,加5ml去离子水,置离心管中,12000r/min离心15min,留0.5ml上清液为第一组分。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。
本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。
一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。
2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。
一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。
3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。
1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。
3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。
1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。
2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。
3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。
蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。
1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。
2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。
3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。
总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。
其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确)
生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
实验1-蔗糖酶的提取
二．实验仪器使用 1．学生实验使用仪器前，应在教师讲解了使用方法后，或在已 学生实验使用仪器前，应在教师讲解了使用方法后 使用方法 学会如何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器； 学会如何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器；如违 反操作规程，将仪器损坏，应由当事人按规定处理。 反操作规程，将仪器损坏，应由当事人按规定处理。 以小组为单位共同使用 2．仪器如果以小组为单位共同使用，某一同学如出现不当操作 仪器如果以小组为单位共同使用， 损坏仪器，则以小组为单位共同赔偿损失。 损坏仪器，则以小组为单位共同赔偿损失。 3．如因教师没有讲解好仪器的使用方法等原因造成学生损坏仪 应由教师负全责，并按规定处理。 器，应由教师负全责，并按规定处理。 4．仪器使用结束后，请使用人及时在仪器登记本上记录仪器使 仪器使用结束后，请使用人及时在仪器登记本上记录仪器使 仪器登记本 用情况，如仪器使用有问题应马上向教师报告。 用情况，如仪器使用有问题应马上向教师报告。
本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎， 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎， 研磨的方法 把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂 沉淀等。 沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇） 选择性变性 ）、有机溶剂 蔗糖酶进行初步的提纯。 蔗糖酶进行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活， 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的 产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等， 产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等， 这样才能收到较好地分离提纯效果。 这样才能收到较好地分离提纯效果。
蔗糖酶分离纯化与活力测定
蔗糖酶分离提取的原理
细胞破壁：就酶在生物体内的分布， 细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶 和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶 提取胞内酶时， 胞内酶。 和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破 碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材 碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取， 料称为无细胞抽提液。 料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。 材料不同，破壁也方法不同。 酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、 酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、纯 测活、保存； 化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去 衡量酶提纯的程度和得率。 向、衡量酶提纯的程度和得率。
酵母蔗糖酶的分离纯化和 活力测定
实验目的
一、学习酶蛋白分离提纯的原理； 二、掌握细胞破壁、提取、有机溶剂分级、 透 析和离子交换柱层析技术；
三、测定各级分蛋白含量及蔗糖酶的活力。
二、实验原理
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方 法。 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力） 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及 纯度 收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、 收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、 电荷、吸附等）进行分离。 电荷、吸附等）进行分离。
蔗糖酶活力测定的原理
蔗糖酶催化的反应： 蔗糖酶催化的反应：蔗糖 D-果糖 + D-葡萄糖 果糖 葡萄糖
(U)＝ 条件下， 1mg葡萄糖所 1活力单位(U)＝酶在室温，pH＝4.6条件下，每分钟水解产生1mg葡萄糖所 活力单位(U) 酶在室温，pH＝4.6条件下 每分钟水解产生1mg 需酶量。 需酶量。
3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理
生物化学实验-蔗糖酶的提取
三、实验材料与试剂
1、实验材料 市售干酵母粉 10g/组(3～4人）
2、实验试剂
⑴ 石英砂，
⑵ 95% 乙醇(-20℃），
⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、研砵（每组一套）； 3、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 4、托盘天平（离心管平衡用）； 5、高速冷冻离心机； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、制冰机； 8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ； 9、7ml离心管（留样品Ⅲ用）及离心管架 ； 10、－20℃冰箱。
五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组3～4人。
1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细 粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移 到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分 钟，收集上清液（样品I）并量出体积V1,另留1ml上清液（标注样品I ）放 置－20℃冰箱保存，用于后续实验。
七、思考题 本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为Leabharlann 有哪些方法可以运用？说说你的设想。
下次实验
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
实验一 蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细 机械法 胞 破 碎 的 常 用 方 法 非机械法
液体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
实验1 蔗糖酶的提取
你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。
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下次实验
实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶
预习参考资料
李建武等 生物化学实验原理和方法
北京大学出版社
赵永芳 生物化学技术原理及应用（第三版） 科学出版社
3、有机溶剂（乙醇）沉淀：
将热处理后的上清液逐滴加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温
和搅动混匀，至少放置20分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管 平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰 箱保存，以备用于下周实验——实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。 六、实验结果分析讨论
实验一 蔗糖酶的提取
一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。
二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎
细 机械法 胞 破 碎 的 常 用 方 法 非机械法
液体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法
固体剪切法
压力和研磨
物理法、化学渗透法、酶溶
本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把 蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。
2、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进
行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯
度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose 柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
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参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。
一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。
比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。
（本实验以酵母为原料）一、教学目的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。
本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。
二、教学内容实验设计：包括讲课，答疑，文献综述6学时实验一酵母细胞破碎与蔗糖酶提取条件的选择8学时实验二蔗糖酶的盐析曲线的制作与沉淀分离8学时实验三蔗糖酶的有机溶剂沉淀曲线的制作与沉淀分离8学时实验四蔗糖酶的DEAE-纤维素柱层析纯化8学时实验五蔗糖酶的Sephadex G-150柱层析纯化8学时实验六蔗糖酶溶液的冷冻干燥2学时实验七蔗糖酶的纯度分析：聚丙烯酰胺凝胶电泳8学时实验八蔗糖酶的理化性质研究8学时三、实验设计与研究1 器材与方法1.1主要单元操作技术与设备1.1.2单元操作技术细胞组织破碎术、离心分离技术、双水相萃取技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、超滤技术、冷冻干燥技术、分光光度技术、电泳技术等生物分离与检测技术；1.1.2主要设备烘箱、恒温摇床、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、超声波细胞破碎仪、粉碎机、超滤器（500ml～5000ml）、冷冻离心机（8000-10000 r/min，50ml×6；250ml×6）、普通离心机（5000 r/min，200ml×4）、台式离心机（16000 r/min,5ml×6）冷冻干燥机、-80度冰箱、制冰机、酸度计、电热恒温水浴锅、匀浆机、蛋白质色谱分离系统（核酸蛋白检测仪、部分收集器、蠕动泵、梯度混合器、φ10-25mm,h300-700mm层析柱）电泳仪及垂直板电泳槽、脱色摇床、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱、气相色谱、凝胶成像系统、250ml和500ml旋转蒸发仪、微量凯氏定氮仪、常量凯氏定氮仪、500-1000W电炉、超声波清洗器、振动混合器、移夜枪（200-5000ul）、层析缸、电吹风等。
1. 2 实验材料与试剂1.2.1酵母菌的扩大培养：采用采用实验室经过筛选诱变获得的酵母菌,增殖培养基：葡萄糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L、七水硫酸镁0.1g/L 和磷酸二氢钾0.1g/L，调节pH 为5.0。
发酵培养基：葡萄糖12％～15％、蛋白胨0.5g/L、酵母膏0.5g/L，七水硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L 和硫酸铵0.5g/L，调节pH为5.0。
1.2.2实验试剂甲苯（使用前预冷到0℃以下）；95%乙醇；DEAE-纤维素；Sephadex G-150；0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.3 ；十二烷基硫酸钠(SDS);其余试剂均为国产分析纯。
1. 2 分析方法1.2.1蛋白质浓度的测定：采用Folin法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。
1.2.2还原糖的测定：采用DNS法（试剂方法参考生物化学原理和方法）。
1.2.3酶活性测定（参考：徐桦,陆珊华,孙爱民.酵母蔗糖酶Km值的测定[J ].南京医科大学学报,1999,17(4):329-330）取适当稀释的酶液0.5mL,加入0.3 mLpH4.6、0.1mol/L的NaAc-HAc 缓冲液,0.2mL 0.1mol/L的蔗糖,37℃准确反应15min,后加0.125mL1mol/L的NaOH中止反应。
用DNS法在540nm波长下测定形成的还原糖量。
在测定条件下以每分钟内能水解蔗糖成还原糖,经DNS测定光吸收读数为1 mA 所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
1.2.4 蔗糖酶的纯度分析：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（试剂方法参考生物化学原理和方法）2酵母蔗糖酶的提取纯化工艺酵母蔗糖酶的提取纯化工艺流程图2.1粗酶制备（蔗糖酶的提取）目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，常用方法有甲苯研磨（自溶）法、冻融研磨法、SDS 抽提法等。
其中甲苯自溶法耗时长，效率低，目前很少使用。
2.1.1甲苯自溶法称取酵母泥50g,加入20mL双蒸水使其溶解,加入5g NaAc和10m甲苯,摇床振荡10min ,37℃恒温水浴48h。
再加入10mL 4 mol/L的HAc和15mL双蒸水,调pH至4.5,于4℃、3000 r/min 离心30 min ,离心后将中层清液移出即为粗制酶液,4℃保存。
2.1.2甲苯研磨法①取50酵母泥（准确称量），加10g石英砂，加蒸馏水20ml，研磨5min,，加20mL 甲苯，继续研磨10分钟左右，共3次，使其呈糊状。
②将研磨好的内容物转移到50mL离心管中，平衡后以10000rpm离心15分钟。
③用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，勿带上层甲苯相，然后以10，000rpm离心15分钟。
④将3步离心后的上清夜取出，倒入量筒中记录其体积，留下1.5mL作为第一组分粗抽提液以备酶活力测定和蛋白浓度测定。
2.1.3冻融研磨法称取酵母泥50g ,加入20mL双蒸水 ,置于预先冷却的研钵中,研磨25min ,冰箱中冷冻约15min(以研磨内液面上刚出现冻结为宜),取出再研磨25min ,重复以上步骤两次。
后置于冰箱中冷冻3h取出,温浴融化,用1 mol/L的HAc调pH至5.0,40℃水浴30min,冷却后4℃、10000r/min 离心15min,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。
2.1.4 SDS抽提法称取酵母泥50g,加入50mL0.3mmol/L的SDS溶解, 40℃水浴10 h后取出 ,4℃、10000 r/ min离心15 min ,取上清液即为粗制酶液,4℃保存。
2.1.5超声波细胞破碎频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下(100～250W)可破碎细胞。
其工作原理是：超声波细胞破碎机由超声波发生器和换能器两个部分组成。
超声波发生器(电源)，是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，振动波通过浸入在样品中的钛合金变幅杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。
细胞破碎过程中，用于分析细胞破碎率的检测技术对于细胞破碎效果的评估、破碎工艺的选择、工艺放大和工艺条件优化等起着非常重要的作用。
最常用的检测细胞破碎效果的方法是通过显微镜直接观察，如用革兰氏染色法，也可以通过测定核酸与蛋白质的含量判断细胞破碎率。
正交试验法是研究与处理多因素试验的—种实验设计方法，它可以利用规格化的正交表通过整体设计、综合比较和统计分析，能在很多的试验条件中选出代表性强的少数条件，并能通过较少次数的试验找到较好的实验条件，即最优或较优的方案。
在生产实践和科学研究中对于因素多、周期长、有误差的—类试验问题，正交试验法的效果尤其显著。
关于正交实验法的书籍目前比版很多，这里不再叙述。
本实验应用正交试验法选择酵母细胞超声破碎的最佳实验条件。
本实验要求考察的有三个因素即细胞浓度、超声能量和破碎时间，每个因素有四个位级（或称水平）。
现综合成一张因素位级表如下：如果每个因素各个位级的所有组合都做试验，要做43=64次。
为了使试验次数减少而又能得到较好的结果，需要选用合适的正交表。
现有正交表L16（45），能安排5个4位级的因素，只需做16次试验。
本实验中有3个4位级的因素，所以可以选用此表来安排试验。
如果不考虑因素之间的交互作用，进行表头设计时，则把因素A、B、C分别放入正交表L16（45）的第5、2和1列上。
2.2沉淀分离2.2.1 盐析沉淀盐析曲线的制作：a.取7支干净试管编号1～7，分别加入粗酶液5 ml；b.分别向1～5号试管中加入饱和硫酸铵1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1、1/～7、7/，静置1h以上，对称放入离心机中，10000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。
c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1mol/L（pH7.0）缓冲溶液溶解沉淀物；d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用DNS测定还原糖。
e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和酶活力的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和酶活力盐析曲线。
盐析制备蔗糖酶①根据盐析曲线选择硫酸铵饱和度(30～40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(约60%饱和度)沉淀酶蛋白。
并计算每升溶液达到30～40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据酶蛋白粗提液的体积计算30～40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。
②在酶蛋白粗提液中加入经研细的(NH4)2SO4粉末 ,使其达到30～40%饱和度,充分溶解后,4℃，10000r/min ,离心20 min ,除去沉淀。