不同针刺干预方案对卒中大鼠大脑皮层脑源性神经营养因子表达的影响

收稿日期：2010-06-28基金项目：福建省教育厅资助课题（JA07123）作者简介：林栋（1977—），男，讲师，2008级针灸专业博士研究生，主要从事针灸治疗神经系统疾病的机制研究。

近年来针灸治疗手段愈来愈多样化，针刺、理疗、运动、药物熏蒸、针药结合等诸多方法综合运用于卒中后神经功能的恢复。

然而大多数的临床科研工作者多关注于各种疗法、以及各疗法间的组合优劣比较，试图探寻到一种或几种最为满意的疗法，而对不同疗法间的配合运用及治疗组合的研究却鲜见报道。

因此，尽管针刺与运动疗法分别隶属于2种完全不同的理论体系，但治疗对象、治疗作用和最终目的上的重合，使得治疗技术与方式必然产生磨合与渗透［1］。

有研究者就曾提出针刺疗法与康复医学应进一步就其有机结合的具体方式开展深入的机制研究，根据疾病各个阶段的特点，探讨如何适时应用针灸疗法以及如何实现不同疗法间的最佳组合［2］。

本项目的前期研究表明针刺与运动疗法不同干预次序对局灶性脑缺血大鼠缺血侧大脑皮层诱发电位存在不同程度的影响［3］，那么其电生理状态改变的背后是否存在相关生化指标的变化？本研究拟观察针刺与运动疗法不同干预次序对卒中大鼠脑源性神经营养因子（BDNF ）的影响，分析针刺与运动疗法先后作用次序的不同对卒中大鼠神经功能恢复影响的具体作用方式，从而为将来形成卒中康复单元的最佳治疗方案提供实验依据。

1材料与方法1.1动物及分组清洁级SD 大鼠30只，由福建中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体重180～240g ，自由饮水进食，食用普遍颗粒型大鼠饲料（含蛋白23％，脂肪4.7％，钠盐0．24％），动物房温度控制在18～26℃，光暗周期12h 。

随机分为5组：空白组、模型组、假手术组，先针后运动组、先运动后针组，每组6只大鼠。

1.2主要试剂及设备BDNF 试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司）；1mmoL ／L NaOH 溶液、1mmoL ／L HCl 溶液、10%水合氯醛溶液、0.9%氯化钠溶液、4%多聚甲醛溶液、0.01mmoL ／L PBS 缓冲液、0.02mol ／L 柠檬酸修复液、3％H 2O 2均为自配溶液。

主要设备：ZT-14s 生物组织脱水机、YB-6LF 生物组织石蜡包埋机（孝感市亚光医用技术有限公司）；CUT4060石蜡切片机［海德创业（北京）生物科技有限公司］；HFsafe 生物安全柜［力新仪器（上海）有限公司］；保湿盒、4°C 冰箱、隔水式电热恒温培养箱、Motic 5000C ＋Moticmed 数码显微图像采集与分析系统、Motic Images Advanced 6.0医学图像分析系统。

1.3模型制备大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO ）模不同针刺干预方案对卒中大鼠大脑皮层脑源性神经营养因子表达的影响林栋1，2，阙秀琴2，张学君2，吴强2（1.广州中医药大学针灸推拿学院，广东广州510006；2.福建中医药大学针灸学院，福建福州350108）摘要：目的研究针刺与运动疗法不同干预次序对卒中大鼠缺血区大脑皮层脑源性神经营养因子（BDNF ）表达的影响。

方法采用大鼠大脑中动脉阻塞法制备卒中大鼠模型，将30只大鼠随机分为空白组、模型组、假手术组，先针后运动组、先运动后针组，应用免疫组化方法观察5组BDNF 阳性细胞数，并进行图像分析。

结果光镜下计数免疫组化染成棕黄色或黄褐色的BDNF 阳性细胞，先针后运动组、先运动后针组与空白组比较阳性细胞数显著增加（P ＜0.01），先针后运动组比模型组也有显著表达（P ＜0.05）。

结论针刺与运动疗法的不同干预次序对卒中大鼠大脑皮层BDNF的表达存在差异，但尚缺乏足够的证据说明针刺与运动疗法先后干预次序的优劣。

关键词：针刺疗法；运动疗法；脑源性神经营养因子；脑缺血中图分类号：R245.32文献标志码：A文章编号：1004-5627（2010）05-0019-04Journal of Fujian University of TCM October 2010，20（5）福建中医药大学学报2010年10月第20卷第5期19型制备：按Longa等［4］建立的大鼠中动脉线栓法造模。

以10%水合氯醛（35mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，分离并电凝各分支动脉，结扎并游离颈外动脉主干远端，显微动脉夹暂时夹闭颈内动脉和左侧颈总动脉。

于左侧颈总动脉上的动脉夹远心端剪一小口，将黑色的直径0.23mm的日本进口尼龙鱼线栓线从切口处插入，提拉翼腭动脉处的悬吊线，使栓线顺利进入颅内，遇阻力即停止进线，插入深度距颈总动脉分叉处（19.0±0.2）mm。

模型成功的判断标准采用Bederson方法［5］进行肢体功能的神经缺损评定。

0分：无任何神经功能缺失；1分：左前肢屈曲（即提尾悬空实验阳性）；2分：侧推抵抗力下降（即侧向推力实验阳性），伴前肢屈曲，无转圈行为；3分：同2级行为，伴自发性旋转。

本研究模型组动物神经功能评分大于或等于2分，可以认为实验造模成功。

假手术组操作过程同上，但栓线插入深度小于10mm，即不进入MCA。

术中对大鼠的呼吸、心率、脑温等生理参数进行监测，脑温通过测肛温间接反映，并维持于正常范围，即肛温35.9℃～36.9℃（相当于脑温36.5℃～37.5℃）。

术后送回动物房。

1.4治疗方法所有大鼠造模完成后次日开始实验。

空白组大鼠不接受任何处理；模型组大鼠仅完成造模过程，不接受治疗；假手术组大鼠完成造模手术过程但不造成中动脉栓塞；先针后运动组大鼠造模成功后，接受先针后运动治疗；先运动后针组大鼠造模成功后，接受先运动后针刺治疗。

1.4.1针刺治疗针刺受试大鼠，取穴方法按照《实验针灸学》3版教材中规定的实验动物取穴标准。

穴位：“合谷”（前肢第1、第2掌骨之间）；“后三里”（膝关节后外侧，在腓骨小头下约5mm处）。

在局部消毒后，针具用华佗牌30号0.5寸毫针（苏州医疗用品厂），斜刺0.2～0.3cm，电针仪选用上海G6805Ⅱ型，受试组分别给予20Hz电针，输出强度以大鼠局部肌肉微颤为度，连续波，电针20min，每天1次，连续7d。

1.4.2运动疗法运动疗法采用滚筒式训练器，1个长30cm、直径60cm的圆形网状仪器，底座有固定架，一端有一手摇柄，可手摇按10r／min进行转动训练。

将大鼠放入该训练器内可训练大鼠的抓握、旋转、行走等运动，每天1次，每次20min。

网屏训练、网屏为50cm×40cm网带，网眼为l cm ×l cm，网板的左右和上方都用25cm高的木板框边，网屏距地面高度为80cm，下方铺以12cm 厚的海绵。

先将网屏水平放置，将老鼠放在其上，然后缓缓地将其一端抬高，在2s内将网屏变成垂直位，保持5s，训练大鼠的肢体抓握能力，每天1次，每次20min。

1.5样品采集及处理全部治疗完成后次日，分别取出5组大鼠，10％水合氯醛腹腔麻醉，切开胸腔，心脏快速灌流生理盐水50mL，然后用4％多聚甲醛50mL灌流固定。

断头取脑（勿损伤大脑皮层），放入4％多聚甲醛中固定24h后，参照《大鼠脑立体定位图谱》［6］，取前额2mm至视交叉部位的脑片进行脱水、浸腊、包埋、切片、烤片、烘片、脱蜡等常规步骤。

1.6BDNF的免疫组化染色①柠檬酸修复：脱蜡后的切片放入0.01mol／L磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4）漂洗3次，每次3min；②用0.02mol／L 柠檬酸修复液高压修复3min，自然冷却；③将玻片排列在湿盒中，滴加3％H2O2，室温下静置10 min；④用0.01mol／LPBS漂洗3次，每次3min；⑤按1∶200稀释BDNF（H-117）一抗：sc-20981，将溶液滴加到切片上，移入4℃冰箱孵育12h；⑥用0.01mol／LPBS漂洗3次，每次5min；⑦切片滴加PV-6001（辣根酶标记羊抗兔多聚体，二抗），37℃孵育2h，0.01mol／LPBS漂洗3次。

将玻片甩干后，滴加0.05%DAB，在显微镜下观察显色后蒸馏水漂洗，苏木素复染，晾干后用中性树胶封片。

对照实验以PBS代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，其结果为阴性。

1.7数据分析所得5组切片在Motic5000C＋Moticmed数码显微图像采集与分析系统对5组样本的大脑皮层M1及M2区定位，BDNF免疫组化染色后，阳性表达信号为棕黄色。

5组各截取3个视野的图片分析阳性表达，运用Motic Images Ad-vanced6.0医学图像分析系统进行阳性表达计数，取3个视野的平均值。

1.8统计学处理采用SPSS13.0统计软件中分别对5组BDNF的免疫组化阳性细胞数作单因素方差分析，组间比较用q检验，数据用x±s表示。

2结果光镜下观察正常组和假手术组脑组织结构清楚，未见明显改变；模型组大鼠皮层神经元细胞见部分空泡样变，细胞体积变小，胞浆和胞核固缩，部分神经元及胶质细胞出现肿胀坏死。

免疫组化染色切片中BDNF阳性细胞表现为神经元的胞福建中医药大学学报第20卷20表1不同针刺干预方案对各组大鼠大脑皮层BDNF 阳性细胞及灰度值的影响组别空白组模型组假手术组先针后运动组先运动后针组动物／只66666阳性细胞数5.67±2.5816.33±3.721）10.00±2.8319.50±3.271）2）20.10±5.091）灰度值92.57±14.38116.14±15.37119.54±19.251）128.00±22.441）139.04±7.131）2）注：与空白组比较，1）P ＜0.01；与模型组比较，2）P ＜0.05。

图1空白组光镜下阳性细胞数（×400）图2先针后运动组光镜下阳性细胞数（×400）浆、轴突及少量胶质细胞染成棕黄色，其中正常组及假手术组表达为弱阳性，先针后运动组、先运动后针组的BDNF 阳性表达较强，见表1、图1、图2。

5组数据在ANOVA 单因素方差方差分析前进行方差齐性检验，组间总体方差相等，适合做单因素方差分析。

经过分析，5组间阳性细胞数的F 为36.54，P ＜0.001，提示5组间的差异有显著性意义；灰度值F 为8.81，P ＜0.005，提示5组间的差异有显著性意义。

3讨论脑源性神经营养因子是1982年由德国神经化学家Barde 等人首次从猪脑中分离纯化出的具有促进神经生长活性的一种蛋白质，BDNF 分子单体是由119个氨基酸残基组成的分泌型成熟多肽，蛋白等电点为9199，分子量为1315kD ，主要由β折叠和无规则N-级结构组成，含有3个二硫键，为一种碱性蛋白质。

在脑的皮质运动区，细胞浆呈酸性，故BDNF 的阳性表达是在细胞浆。