β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件
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β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
地中海贫血诊断检查ppt课件
*
地贫筛查后哪些情况 需做地贫基因检测？
1.Hb正常或轻度下降，MCV下降和 （或）MCH下降，但电泳没有阳性 发现的（HbA2检测误差，轻型或静 止型α 地贫 ），要做地贫基因检 测。 2.夫妇双方一方确定为α （β ）地 贫 ，另一方做地贫基因。
地贫的基因分析局限性
1.由于分子诊断技术本身的局限性， 地贫基因诊断的误诊及漏诊率约2%。
诊断
临床特点＋实验室检查＋父母调查
阳性＋基因分析
地中海贫血检查 1.血细胞分析 2.红细胞脆性试验 3.血红蛋白分析 4.地贫基因检测
第1-3项为筛查项目
地中海贫血初筛检查
1.血细胞分析
MCV < 80fl 和（或）MCH <27pg CV）<80fl为地贫表型阳 性，β地贫和中间型、轻型α地贫和部分静 止型α地贫基因携带者均为阳性，但有部分 静止型α地贫基因携带者是正常的。
地贫地域分布
α地中海贫血多见于黑人(黑人中25%至少有 一个基因缺陷)，β地中海贫血多见于地中海 地区或东南亚。 我国以广东、广西、海南、四川、重庆等省 区发病率较高，在北方较为少见。
Thalassemia
中国南方不同高发地
区人群携带率 1 ~ 23%
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
δ 四个类型，以β 和α 地贫最常见。
地贫临床类型
临床上将地贫分为轻、中、重三个临床类型。 (1)轻型：轻度贫血或无症状，一般在调查家族史时发现。 (2)中间型：轻度至中度贫血，患者大多可存活至成年。 (3)重型：出生数日即出现贫血、肝脾肿大进行性加重，黄 疸，并有发育不良，其特殊表现有：头大、眼距增宽、马鞍 鼻、前额突出、两颊突出，其典型的表现是臀状头，长骨可 骨折。骨骼改变是骨髓造血功能亢进、骨髓腔变宽、皮质变 薄所致。少数患者在肋骨及脊椎之间发生胸腔肿块，亦可见 胆石症、下肢溃疡。常见并发症有急性心包炎、继发性脾功 能亢进、继发性血液病。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法ppt课件
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循 环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增 ： 反应液管（做好记号） 5000rpm，2秒 加入 2ul DNA溶液
总体积25微升
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
PCR扩增条件
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
3.杂交 ：
结果判断
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反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技 术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一 次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代 固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式， 具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、 基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。
地中海贫血基因诊断PPT课件
临
床 中间型地贫：(+(高F)／ +(高F) 、+／+)
类
型 遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbFα 2γ 2)
地中海贫血基因诊断
A.重型β 地中海贫血
患者不能合成β 链 α 链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改
变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。 组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增
珠蛋白基因的结构及表达
1.珠蛋白基因的结构
α 珠蛋白基因簇 16p13 β 珠蛋白基因簇 11p15
地中海贫血基因诊断
地中海贫血的分型
·α地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将
其分为4种类型。
·β地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类
型： ·重型地中海贫血 ·中间型地中海贫血 ·轻型地中海贫血
PCR 扩增
基因型分析
α地中海贫血的 基因诊断结果
地中海贫血基因诊断
PCR 扩增
缺失型突变检测PCR 反应条件为:95℃预变性5min， 98℃ 45s，66℃ 30s，72℃ 3 min，35个循环，最 后72℃延伸5 min。 非缺失型突变检测PCR反应条件为:94℃预变性5 min， 94℃ 60s，55℃ 30s，72℃60 s，35个循环，最后 72℃延伸5min。
地中海贫血基因诊断
反向点杂交( reversedot-blot, RDB)
将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42℃杂 交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜, 加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进 行操作。
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断
杂交结果判定
地中海贫血基因诊断
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)
pcr扩增
DNA提取
利用特定的试剂从血细胞中提取出DNA。
pcr扩增
使用聚合酶链式反应（PCR）技术对DNA进行扩增，使其数量增加，便于后续 的检测。反向点Fra bibliotek交制备探针
将目标基因序列设计成特定的探针，并固定在尼龙膜上。
杂交反应
将扩增后的DNA与固定在膜上的探针进行杂交，通过碱基互 补配对原则，将目标基因序列特异性地结合在膜上。
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高检测的灵敏度和特异性，降 低检测误差。
要点二
基因组编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，对β-地中海贫血基因 进行精确编辑和修复，从根本上治疗地中海贫血。
临床应用的拓展
早期筛查
将β-地中海贫血基因检测纳入新生儿筛查 计划，实现早期发现和干预，降低疾病对 患儿的影响。
β-地中海贫血基因检测(pcr反向点杂交法)
• β-地中海贫血基因检测介绍 • pcr-反向点杂交法介绍 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)流程 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)的临床意义
• β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点 杂交法)的未来发展
01
β-地中海贫血基因检测介绍
03
耗时长：需要进行PCR扩增和杂交反应， 整个过程需要一定时间。
04
对实验条件要求高：需要严格控制实验条 件，避免交叉污染和假阳性结果。
03
β-地中海贫血基因检测(pcr-反 向点杂交法)流程
样本采集和处理
血液样本采集
从患者静脉抽取适量血液，用于 后续的基因检测。
样本处理
将采集的血液进行离心，分离出 血浆和血细胞，保留血细胞用于 后续的DNA提取。
血红蛋白电泳及PCR-反向斑点杂交法诊断β-地中海贫血
５ ｎ。 ｍｉ
北 京六 一 仪 器厂 Ｄ Ｙ一 Ｃ型 电泳 仪 、 海精 密 Ｙ ８ 上 科学 仪器 有 限公 司 ７ ２分 光光 度计 。 ２
１２２方 法 ．＿
本 文采用 醋酸 纤维 薄膜 电泳 法 。参照 临床 检验
操 作 规 程第 二 版回 用 生理 盐 水 洗 涤 红细 胞 ４次， ， 四 氯 化碳 萃 取后 制 备 Ｈ ｂ液 。 经适 当稀 释 后调 整 Ｈ ｂ含 量 ８ １ｇＬ 进行 点样 电泳 、 色 、 ～ ２ ／。 染 洗脱 和 比色 检测 出 Ｈ Ｆ和 Ｈ Ａ ，若 Ｍ Ｖ＜ ０ ， ｂ ２３２ ｂ ｂ２ Ｃ ８ ％ Ｈ Ａ＞ ． ％，或 Ｈｂ ＞ Ｆ ３１ ， 判为 Ｂ 地 中海贫 血表 型 阳性 【 ． 则 ％ 一 ３ Ｊ 。 １３ 一 中海 贫血 基 因检 测 ． Ｂ 地
６ ４ Ｃ Ｔ ｗ ｓ ｎｔｅｔ ｓ Ｃ ｎ ｌｓ ｎＴ ｅＰ Ｒ ｔ ｈ ｉｕ ｎ ｅｔ ｈ ｉｕ ｆ ｅ ｅｓ ｏ ｂｏ （ Ｄ ） ｒ ｔｅ ５ （ — ） ａ ｐｌ ｔ ｏ ｃ ｉ ：ｈ Ｃ ｃ ｎｑ ｅａ ｄｔ ｃ ｎｑ ｅｏ ｖｒｅｄ ｔ ｌｔＲ Ｂ ａｅ ｈ ｏ ｈ ｏ ｉ． ｕ ｏ ｅ ｈ ｅ ｒ
年 ５月 门诊及 住 院患者 的血 红 蛋 白电泳及 反 向斑 点 杂交 结果 进行 分析 报道 如下 。 １ 对 象与方 法
１１ 对 象 ．
病 例 来 自我 院 ２ １ ０ ０年 ｌ １月 至 ２ １ 年 ５月 住 ０１ 院与 门诊 患 者 ，均经 血 常规 检查 Ｈ ＜ ｌ ｇＬＭＣ ｂ １ Ｏ／ ， Ｖ＜
关 键词 ８ 地 中 海贫 血 ； 红 蛋 白 电泳 ； ｃ 反 向斑 点杂 交 一 血 Ｐ Ｒ一 中 图分 类号 Ｒ ９ ．３ Ｒ ５ ３ ４３ ； ５ ６ 文 献 标 识码 Ａ 文章 编 号 １ ０ — ６ ９ ２ １ ） － ２ １ ０ ０ ０ ２６ （０ ２ ３ ０ ９ － ３
北 京六 一 仪 器厂 Ｄ Ｙ一 Ｃ型 电泳 仪 、 海精 密 Ｙ ８ 上 科学 仪器 有 限公 司 ７ ２分 光光 度计 。 ２
１２２方 法 ．＿
本 文采用 醋酸 纤维 薄膜 电泳 法 。参照 临床 检验
操 作 规 程第 二 版回 用 生理 盐 水 洗 涤 红细 胞 ４次， ， 四 氯 化碳 萃 取后 制 备 Ｈ ｂ液 。 经适 当稀 释 后调 整 Ｈ ｂ含 量 ８ １ｇＬ 进行 点样 电泳 、 色 、 ～ ２ ／。 染 洗脱 和 比色 检测 出 Ｈ Ｆ和 Ｈ Ａ ，若 Ｍ Ｖ＜ ０ ， ｂ ２３２ ｂ ｂ２ Ｃ ８ ％ Ｈ Ａ＞ ． ％，或 Ｈｂ ＞ Ｆ ３１ ， 判为 Ｂ 地 中海贫 血表 型 阳性 【 ． 则 ％ 一 ３ Ｊ 。 １３ 一 中海 贫血 基 因检 测 ． Ｂ 地
６ ４ Ｃ Ｔ ｗ ｓ ｎｔｅｔ ｓ Ｃ ｎ ｌｓ ｎＴ ｅＰ Ｒ ｔ ｈ ｉｕ ｎ ｅｔ ｈ ｉｕ ｆ ｅ ｅｓ ｏ ｂｏ （ Ｄ ） ｒ ｔｅ ５ （ — ） ａ ｐｌ ｔ ｏ ｃ ｉ ：ｈ Ｃ ｃ ｎｑ ｅａ ｄｔ ｃ ｎｑ ｅｏ ｖｒｅｄ ｔ ｌｔＲ Ｂ ａｅ ｈ ｏ ｈ ｏ ｉ． ｕ ｏ ｅ ｈ ｅ ｒ
年 ５月 门诊及 住 院患者 的血 红 蛋 白电泳及 反 向斑 点 杂交 结果 进行 分析 报道 如下 。 １ 对 象与方 法
１１ 对 象 ．
病 例 来 自我 院 ２ １ ０ ０年 ｌ １月 至 ２ １ 年 ５月 住 ０１ 院与 门诊 患 者 ，均经 血 常规 检查 Ｈ ＜ ｌ ｇＬＭＣ ｂ １ Ｏ／ ， Ｖ＜
关 键词 ８ 地 中 海贫 血 ； 红 蛋 白 电泳 ； ｃ 反 向斑 点杂 交 一 血 Ｐ Ｒ一 中 图分 类号 Ｒ ９ ．３ Ｒ ５ ３ ４３ ； ５ ６ 文 献 标 识码 Ａ 文章 编 号 １ ０ — ６ ９ ２ １ ） － ２ １ ０ ０ ０ ２６ （０ ２ ３ ０ ９ － ３
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法) ppt课件
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断 杂交膜条 β-28/βN标本
β-28/ β-28标本 βIVS-II-654/ βN标本
β CD41-42/ βN标本 βCD17/ βN标本
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
（PCR-反向点杂交法）
β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致， 是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42(-TCTT)、 CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox28(A→G)等位点。因本病多为点突变所致，故常 用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液 洗膜2次，各5分钟。C液室温洗膜2min,之后置 显色液避光显色20min
杂交反应条件按照试剂盒要求
结果判断 杂交膜条 β-28/βN标本
β-28/ β-28标本 βIVS-II-654/ βN标本
β CD41-42/ βN标本 βCD17/ βN标本
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为 单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合；
地中海贫血筛查及基因示意图培训课件
β+ / β+
（重型） β0和β+双重杂合子
（重型）
（中间型）
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β
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
分别来自父母双方），每条染色单体分别有1个β基因。 突变型β地贫:β0 (只能合成部分) 缺失型β地贫:β+ (完全不能合成)
11号染色体
β /β
β0 / β
β+ / β
（正常型）
β+ / β0
（轻型）
β0 / β0
（轻型）
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特点
地域性疾病
溶血性疾病
遗传性疾病
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热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。 突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
中间型（- - / α α、- α / - α）小细胞低色素贫血，无自觉症状，
标准型（- - / - α）小细胞低色素贫血，骨髓代偿性溶血性贫血表现。
重型（- - / - -）死胎、产后半小时内即死亡。“水肿胎”
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α-地中海贫血基因型
α1 α2
α-地中海贫血基因位于第16号染色体上（2条单体 分别来自父母双方），每条染色单体分别有2个α基因。
16号染色体
αα/αα -α/αα -α/-α
（重型） β0和β+双重杂合子
（重型）
（中间型）
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β
β-地中海贫血基因型
β-地中海贫血基因位于第11号染色体上（2条单体
分别来自父母双方），每条染色单体分别有1个β基因。 突变型β地贫:β0 (只能合成部分) 缺失型β地贫:β+ (完全不能合成)
11号染色体
β /β
β0 / β
β+ / β
（正常型）
β+ / β0
（轻型）
β0 / β0
（轻型）
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特点
地域性疾病
溶血性疾病
遗传性疾病
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热带、亚热带-丛林地区-沿海洋地带：蚊虫、疟疾。 突变的地贫基携因带者红细胞能抵御疟原虫的侵袭
中间型（- - / α α、- α / - α）小细胞低色素贫血，无自觉症状，
标准型（- - / - α）小细胞低色素贫血，骨髓代偿性溶血性贫血表现。
重型（- - / - -）死胎、产后半小时内即死亡。“水肿胎”
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α-地中海贫血基因型
α1 α2
α-地中海贫血基因位于第16号染色体上（2条单体 分别来自父母双方），每条染色单体分别有2个α基因。
16号染色体
αα/αα -α/αα -α/-α
β-地中海贫血基因检测标准操作规程(20110628)
某医院检验科作业指导书WORK INSTRUCTOR标题：β-地中海贫血基因检测标准操作规程β-地中海贫血基因检测标准操作规程1原理采用PCR 体外扩增和DNA 反向点杂交相结合的DNA 芯片技术：。
2器材2.1 试剂2.1.1 全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA 快速提取试剂盒（25人份/盒）。
有效期：1年。
2.1.2 亚能β-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。
主要组成： 储存条件：试剂盒Ⅰ保存在﹣18℃以下；试剂盒Ⅱ保存在2～8℃。
有效期：6个月。
2.1.3 自备试剂：2.1.3.1 20×SSC （pH 7.0）NaCl 175.3g组成成分 数量 规格 试剂盒ⅠPCR 反应液 25管 23μL 试剂盒Ⅱ膜条 25张 POD 母液1管 75μL TMB 1瓶 10mL 矿物油 1管 1mL 30％ H 2O 21管75μL柠檬酸钠88.2g加蒸馏水750mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至1000mL，并高压灭菌保存。
2.1.3.210% SDS（pH 7.0）SDS 20g加蒸馏水180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。
2.1.3.31M柠檬酸钠（pH 5.0）柠檬酸钠294g加蒸馏水700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。
2.1.3.4A液（2×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）20×SSC 100mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.5B液（0.5×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）20×SSC 25mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.6C液（0.1M柠檬酸钠，pH 5.4）1M柠檬酸钠100mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.7显色液（新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液）C液19 mLTMB 1 mL30% H2O22μL2.2仪器某公司某型移液器某公司某型离心机某公司某型生物安全柜某公司某型PCR仪某公司某型水浴锅某公司某型分子杂交仪某公司某型水平摇床某公司某型扫描仪3操作规程3.1DNA提取3.1.1在1.5mL离心管中加入800μL裂红液及100μL抗凝全血，充分混匀，室温放置2～3min，8000rpm离心2分钟，弃去上清，小心保留管底沉淀。
β型地中海贫血诊断治疗PPT课件
⑷反向点杂交法（RDB）
+ PCR 法
4. 中国人群的基因突变点
编号 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
表1. 中国人β地贫基因突变点一榄表
突变点 β 17（ A→ T）
HbE26（ G→ A） -28（ A→ G） β 41-42（ -TCTT） IVS-Ⅱ -654（ C→ T） β 71-72（ +A） IVS-Ⅰ -1（ G→ T） IVS-Ⅰ -5（ G→ C） -29（ A→ G） β 43（ （ G→ T） β 14-15（ +G） β 71-72（ +T） -30（ T→ C） β 27-28（ +C） ATG→ AGG +40~+43（ AAAC） -32（ C→ A） β 31（ -C） IVS-Ⅱ -5（ G→ C） IVS-Ⅱ -5（ G→ A） β 95（ +A） β 30（ AGG→ GGG） β 8-9（ +G）
24
1
40.3
βo
5
2
11.3
βo
1
22.6 β +/β？
0
4
6.5
β+
1
0
1.6
βo
0
1
1.6
βo
1
0
1.6
β+
1
0
1.6
βo
1
0
1.6
βo
1
0
1.6
？
45
17
100
三.重型β地贫的临床治疗
1.高量输红细胞
⑴ 原理：纠正机体缺氧，减少肠道吸收铁； 抑 制骨髓内、外造血，抑制内源性红细胞过度增 生；抑制睥大。 ⑵ 制品种类：浓缩RBC，添加液RBC， 洗涤 RBC，少白细胞RBC，年轻RBC ⑶ 输血方法：“hypertrasfusion”（高量输 血）输血后Hb 120-140g/L，维持>100g/L （4）必要性
地中海贫血基因检测的临床应用PPT课件
a2a1T< a2- < - a1<a2Ta1< -a1T < - -
地贫的基因型与表现型
• 重型-地中海贫血 ＋/ ＋、0/ 0 、0/ ＋ 所有患者有组织缺氧症状，可出现“地中海 （纯合子或双重杂合子） 贫血面容”，生长发育迟缓。红细胞体积小
且低色素。过剩的游离α链形成α链包涵体， 引起溶血性贫血，靠输血维持生命。
地中海贫血基因检测 在临床诊断上的应用
地中海贫血
• 地中海贫血，又称海洋性贫血，是一种常见的单 基因遗传性溶血性血液疾病。
• 广泛分布在全世界沿海地区。 • 中国常见于东南沿海、西南
地区以及台湾地区。
地中海贫血的分布
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
地中海贫血
地中海贫血的共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使 血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或 不能合成，致使血红蛋白的组成成分改变。
CD 17 (A→T)
CDs 71-72 (+A) CD 43 (G→T) -29 (A→G) CDs 27-28 (+A) -gene deletion 未知突变
等位基因数
198 72 49 33 10
8
7 7 4 4 1 3
频率(%)
2.54 0.92 0.63 0.42 0.13
0.10
0.09 0.09 0.05 0.05 0.01 0.04
• 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等
-地中海贫血突变类型
• 编码区的移码突变、无义突变和起始密码突变：
如CD41-42，CD71-72 ，CD17突变后形成终止子，表 现为0。
地贫的基因型与表现型
• 重型-地中海贫血 ＋/ ＋、0/ 0 、0/ ＋ 所有患者有组织缺氧症状，可出现“地中海 （纯合子或双重杂合子） 贫血面容”，生长发育迟缓。红细胞体积小
且低色素。过剩的游离α链形成α链包涵体， 引起溶血性贫血，靠输血维持生命。
地中海贫血基因检测 在临床诊断上的应用
地中海贫血
• 地中海贫血，又称海洋性贫血，是一种常见的单 基因遗传性溶血性血液疾病。
• 广泛分布在全世界沿海地区。 • 中国常见于东南沿海、西南
地区以及台湾地区。
地中海贫血的分布
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
地中海贫血
地中海贫血的共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使 血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或 不能合成，致使血红蛋白的组成成分改变。
CD 17 (A→T)
CDs 71-72 (+A) CD 43 (G→T) -29 (A→G) CDs 27-28 (+A) -gene deletion 未知突变
等位基因数
198 72 49 33 10
8
7 7 4 4 1 3
频率(%)
2.54 0.92 0.63 0.42 0.13
0.10
0.09 0.09 0.05 0.05 0.01 0.04
• 在中国人群中常见的突变位点有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等
-地中海贫血突变类型
• 编码区的移码突变、无义突变和起始密码突变：
如CD41-42，CD71-72 ，CD17突变后形成终止子，表 现为0。
地中海贫血基因检测和结果分析PPT课件
地贫全套检查
一方正常，另一方 的指标降低
异常的一方做地贫全套检查
双方均为 α-地贫特征
双方均为 一方为α-地贫特征，另一
β-地贫特征ຫໍສະໝຸດ 方为ID或β-地贫特征遗传咨询
ID或β-地贫特征的一方 做α地贫分子诊断
-
+
单纯性ID或单
纯性β-地贫
夫妇双方基因诊断
精选2知02情1最同新意课件选择
α-地贫特征 ID β-地贫特征
Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011
Christina V，et al. Clini精ca选l C20h2e1m最is新tr课y.件2003
30
四、最新的地中海贫血检测方法
2、MLPA（多重连接探针扩增）
用于寻找未知缺失断裂点
Xiao-Feng Wei，et a精l.选A2n0n21H最e新m课a件tol. 2011
15.32
363
6.27
498
8.6
25
0.43
370
6.39
287
4.96
79
1.36
4
0.07
9
0.16
6
0.1
3
0.05
22
0.38
17
0.29
4
0.07
1 精选2021最新课件 1287
0.02
22.25
12
–10kb
5’
0kb
10kb
20kb
30kb
40kb
inter ξHVR
3’HVR
A
B
ψξ1 ψα2 ψα1
3.7 C
α2
α1 θ1
一方正常，另一方 的指标降低
异常的一方做地贫全套检查
双方均为 α-地贫特征
双方均为 一方为α-地贫特征，另一
β-地贫特征ຫໍສະໝຸດ 方为ID或β-地贫特征遗传咨询
ID或β-地贫特征的一方 做α地贫分子诊断
-
+
单纯性ID或单
纯性β-地贫
夫妇双方基因诊断
精选2知02情1最同新意课件选择
α-地贫特征 ID β-地贫特征
Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011
Christina V，et al. Clini精ca选l C20h2e1m最is新tr课y.件2003
30
四、最新的地中海贫血检测方法
2、MLPA（多重连接探针扩增）
用于寻找未知缺失断裂点
Xiao-Feng Wei，et a精l.选A2n0n21H最e新m课a件tol. 2011
15.32
363
6.27
498
8.6
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3’HVR
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B
ψξ1 ψα2 ψα1
3.7 C
α2
α1 θ1
反向点杂交法检测β地中海贫血在产检中的应用
反向点杂交法检测β地中海贫血在产检中的应用
杨柳光;巢薇;李卓园
【期刊名称】《齐齐哈尔医学院学报》
【年(卷),期】2006(027)016
【摘要】目的探讨反向点杂交(RDB)法检测在产检中筛查β地中海贫血的应用价值.方法采用RDB法,检测54例临床似诊为β地中海贫血患者.结果在54例样本中,检出β地贫基因携带者17人.结论 ROD法在检测β地贫中,具有高通量、特异性强、操作简便无需接触放射性等优点.
【总页数】2页(P1981-1982)
【作者】杨柳光;巢薇;李卓园
【作者单位】广西柳州市工人医院检验科,545005;广西柳州市工人医院检验科,545005;广西柳州市工人医院检验科,545005
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.反向点杂交法在β-地中海贫血基因诊断中的应用 [J], 荣卡彬;李运雄;陈冬;陈和平
2.应用PCR-反向点杂交法检测β-地中海贫血基因点突变 [J], 吕燕波;潘兴华;徐庆玲;刘林;邓永丽;王金祥;石琳琳
3.应用反向点杂交法诊断β地中海贫血基因型 [J], 饶兆英;周红平
4.应用反向点杂交法检测α-地中海贫血点突变 [J], 郭广洲;陈延娥;廖生赟;周敏
5.应用反向点杂交法产前诊断β-地中海贫血375例 [J], 李坚;李冬至;廖灿;冯琼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
【原理】
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼 龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快 速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检 测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握反向点杂交技术原理及方法，熟悉其应用
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技 术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一 次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代 固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式， 具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、 基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。
42洗涤15min
5.显色
A液：POD=2000:1,轻摇保温30min,后用A液洗 膜2次，各5分钟。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
结果判断
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
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β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法Βιβλιοθήκη 【原理】PCR技术原理
⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、 引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过 一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。 在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核 苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿 模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
β-地中海贫血基因检测
（PCR-反向点杂交法）
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
β地中海贫血是指β链的合成受部分或完全 抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故 常用PCR加反向点杂交(RDB)确定突变类型。我国 各民族的β地贫基因突变情况有一定差异，南方 汉族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、 IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占 85%～90% 。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了）
2.PCR扩增 ： 反应液管（做好记号） 5000rpm，2秒 加入 2ul DNA溶液
总体积25微升
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
50℃， 95℃， 94℃， 55℃， 72℃， 72℃，
PCR扩增条件
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min