转基因动物在毒理学中的应用 20120614
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5.其他
1.显微注射技术:
. 用显微注射仪将外源基因直接注入受精卵原核 的方法
目前使用最广泛、效果最佳的转基因动物制备技术
1.显微注射技术:
显微注射法是在显微注射仪上,一侧用吸管
固定受精卵,另一侧将注射针插入受精卵原核。 拔出显微注射针解除固定管的负压,操作完成。
优点:速度快且操作简单,对DNA大小无限制, 产生嵌合体少。常能得到纯系动物; 缺点:不能定点整合,影响基因表达和遗传稳定 性;设备昂贵。
携带激活的H-ras原癌基因小鼠和P53基因敲除小 鼠模型
五、转基因动物在毒理学中的应用
2.致突变评价
用于致突变的实验的Muta TM转基因小鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
此外,用各种质粒作为载体携带靶基因的诱 变制备的转基因小鼠,不仅提高了检测的敏感性, 而且经化学物处理后的动物,基因载体可从不同 组织细胞分离出来,用于化学物的组织细胞特异 毒理学作用的研究
五、转基因动物在毒理学中的应用
虽然转基因小鼠广泛应用于各项研究中,但 其可检测组织重量小,体液容量较小等特点,使 得其在研究中存在较多的困难 因此,国内外毒理学工作者已经充分认识到 这种发展趋势,在国内积极培育和选用大鼠转基 因动物模型提高毒理学研究水平 大鼠的许多遗传特征生理特性表明,更适合 用建立人类疾病模型
用体外培养细胞基因转化技术将目的基因导入E S细胞,注入囊胚产生嵌合体,转化的ES细胞参与生 殖细胞的建立,就将目的基因传给下一代, 从而改 变动物的遗传性状。
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
分离胚胎
.
转入培养皿中培养 分离内层细胞团 胰蛋白酶处理解离
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
嵌合小鼠
杂交、筛选
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因小鼠在毒理学其他方面的应用,主要 还有 用于神经毒性的研究C-fos-LacZ转基因小鼠 用于金属和某些非金属的研究的金属硫蛋白(M T)基因的转基因和基因敲除小鼠,如用MT转基 因 小鼠对镉等的抗性增加,而MT的基因敲除小 鼠对镉、银、汞顺铂和四氯化碳的毒性敏感性增 强 用于毒物代谢CYP2D转基因小鼠和用于心脏毒 性研究的CYP2E转基因小鼠
主要用于化学药物的安全性评估,包括 致癌评价 致突变评价
生殖评价
毒物代谢方面的评价
五、转基因动物在毒理学中的应用
1.致癌评价 用于化学药物安全性评估的Big Blue小鼠和Muta mouse转基因小鼠 用于各种肿瘤的致癌检测实验的TG、AC小鼠H K-fos、ras-H2转基因小鼠
二、转基因动物的发展史
二、转基因动物的发展史
三、转基因动物的原理
将改建后的目的基因用显微注射等方法注
入实验动物的受精卵, 然后将此受精卵植入受
体动物, 使其发育成携带有外源基因的转基因 动物
四、制备转基因动物的方法
1.显微注射技术
2.逆转录病毒载体技术
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
4.精子载体技术
Thank You ~~
五、转基因动物在毒理学中的应用
在外源化学物对机体损害作用的研究中,转基 因技术主要是建立重要的化学物靶整体模型和解 决多基因调节问题其主要应用于 作用靶的鉴定和确认 建立疾病的动物模型 早期发现药物毒性反应
五、转基因动物在毒理学中的应用
(一)转基因小鼠模型在毒理学方面的应用
目前,国际上毒理学方面应用最多的是转基因 小鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
目前,用于毒理学研究的转基因大鼠还较少
如:
•作为诱变的靶基因Big Blue TM转基因大鼠 •分析人铜代谢通路中的功能的ATP7B转基因大鼠 •用于研究学习和记忆功能的NR2B转基因大鼠 •用于钙调素代谢紊乱研究的钙调素TG转基因大鼠
•用于神经毒性研究的C-fos-LacZ转基因大鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
(二)转基因大鼠模型在毒理学方面的应用 大鼠约2.5万到3万个基因中的90%与人类和小 鼠相似,其较大体形使其成为通过连续采样进行 药物评估的理想模型,则转基因大鼠的制备和应 用也越来越广泛
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因大鼠主要用于人高血压、心脏病、肾 功能衰竭和癌症等疾病的研究 如: 人高血压转基因大鼠TGR(mRen-24)27模型 用于研究人类脊椎关节病的HLA-B27转基因大鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因动物在毒理学研究中重要的问题是如 何把从动物所获得的信息用于人,把体外资料用 于体内,把复杂的整体系统化为简单的并能人为 控制的系统,以及如何提高检测的敏感性等 代谢途径上,通过基因转移能人为控制某一外源 化学物的代谢 整体水平上,可人为控制某一基因的表达水平, 从而阐明该基因在外源化学物致毒过程中的作用
纯合转基因小鼠
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎 的形成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一 种载体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此 发育而成的转基因动物 优点:是外源基因的整合率很高,约50%,整合率 在生殖细胞中的比例约为30% 缺点:是不易建立ES细胞系
五、转基因动物在毒理学中的应用
虽然动物实验的有效性和安全性被质疑,但 是现在普遍认为动物体药物代谢动力学曲线适应 人类。只有通过动物实验,才能有效地分析和预 测药物在人体内的吸收分布代谢及排泄情况
目前,欧美各国已经把CYP450s及其同工酶测 定用于新药的筛选及代谢研究,并把它列为新药 申报必须进行的一项实验
4.精子载体技术:精子具有吸附外源DNA的能力 ,受精时,将外源DNA带入受精卵中从而形成转 . 基因动物。常将外源基因用脂质体包裹后通过睾 丸直接注射法使雄性动物携带外源基因。 5、体细胞核移植法
6、原始生殖细胞法
随着转基因技术的不断完善,转基因动物在 医学及生物学领域有广泛的应用,如:发现基因 的新功能、基因特异表达的研究、建立基因表达 调控Leabharlann Baidu动物模型等
1.显微注射技术:
.
注入部位:雄前核
雌前核 细胞质 囊胚腔内
嵌合小鼠
杂交、筛选
纯合转基因小鼠
2.逆转录病毒载体技术
原理:据逆转录病毒cDNA能整合到宿主细胞染色 体内这一特性,克隆、构建重组逆转录病毒载体, 通过转染,实现生殖细胞的基因转移
总体技术路线:将插入外源目的基因的逆转录病毒 载体DNA-通过辅助细胞包装成感染滴度的病毒颗 粒-用来感染已经除去透明带的着床前胚胎-随后 直接导入受体子宫
2.逆转录病毒载体技术
.
嵌合小鼠
杂交、筛选
纯合转基因小鼠
2.逆转录病毒载体技术
优点: 整合率高,插入位点克隆分析较易
缺点: 逆转录病毒具有潜在致癌性 载体构建复杂,容纳外源基因的大小有限(<10Kb) 嵌合体比例大 病毒载体序列可能干扰目的基因的表达
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
. ES细胞:哺乳动物囊胚期胚泡内细胞团中一种未分化 细胞。
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因大鼠在毒理学方面的研究和应用也将 成为一个新的热点越来越受到研究人员的重视
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸 和拓展, 成为当今分子药理学和分子毒理学研究的 重要手段 随着转基因技术的发展和克隆的基因增多, 将 会培育出更多的转基因动物用于探索发病机制 另外, 导入双基因或多基因、大片段DNA或人 工酵母染色体以及药物代谢酶基因(如P450基因)的 转基因动物的出现, 将会进一步促进我们更全面地 了解毒物与机体的相互作用
五、转基因动物在毒理学中的应用
甲基转移酶基因敲除小鼠,甲基化是由甲基转移 酶催化的。甲基转移酶主要负责发育过程中建立 和维持甲基化谱式。 甲基化异常与许多发育紊乱及癌症相关 甲基转移酶的研究将加深我们对这一过程调 控机制的理解等
五、转基因动物在毒理学中的应用
4.毒物代谢评价
过氧化酶体增殖体(PPAR)α 基因敲除小鼠,缺 乏PPAR,表达不完全形成青年雄性小鼠表现高胆 固醇血症,但甘油三酯水平正常
五、转基因动物在毒理学中的应用
3.生殖毒性评价
通过条件性和诱导性基因敲除,能对基因突变的 时空特异性进行人为控制,从而避免出现死胎或 动物的出生缺陷
其中有Zp3(编码)透明带硫酸糖蛋白基因敲除 小鼠,如雌激素受体基因、孕酮受体基因、前列 腺素受体、促性腺激素释放激素、黄体生成素受 体、雄激素受体等主要的生殖激素或受体基因敲 除后,对小鼠生殖系统的发育功能以及生殖行为 的影响
小鼠可用于无摄食量增加的迟发性肥胖以及 过氧化酶体对日总能量消耗影响的研究,亦可用 于特异受体的研究
五、转基因动物在毒理学中的应用
CYP2C19转基因小鼠和CYP450s转基因小鼠 其可用于肝脏代谢检测,药物或有毒异物对 人体的安全性评价主要依靠通过动物实验外推至 人的方法进行 实验可以给大鼠犬猴等动物服用一定时间的 受试物,取其肝脏,制备微粒体,用相应的特异 性探针检测CYP450s的活性,以判断新药对CYP45 0s的影响
转基因动物在毒理学中的应用
cly
1
转基因转基因动物 转基因动物的发展史 转基因动物的原理 制备转基因动物的方法
2
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5
转基因动物在毒理学中的应用
一、转基因与转基因动物
转 基 因:整入动物基因组的外源基因 转 基 因 动 物:是指基因组中稳定整合外源基 因并且能遗传和表达的一类动物 嵌 合 体 动 物:只有部分组织细胞的基因组中整 合有外源基因的动物
参考文献
[1]薛达元.转基因生物风险评估与安全管理[M].2010,中国环境科学出 版社. [2]周莉,李岩,高虹.转基因动物在毒理学中的应用[J].毒理学杂志200 7,21(4期):4-6. [3] 邓友田,王全军,石志坚.遗传毒理学新技术研究进展[J].中南药学 2010,8卷(lO):780-782. [4] 秦续明,惠大龙,黄邓高.转基因动物的研究现状与应用前景[J].广 东农业科学,2008,1 :73-74.
1.显微注射技术:
. 用显微注射仪将外源基因直接注入受精卵原核 的方法
目前使用最广泛、效果最佳的转基因动物制备技术
1.显微注射技术:
显微注射法是在显微注射仪上,一侧用吸管
固定受精卵,另一侧将注射针插入受精卵原核。 拔出显微注射针解除固定管的负压,操作完成。
优点:速度快且操作简单,对DNA大小无限制, 产生嵌合体少。常能得到纯系动物; 缺点:不能定点整合,影响基因表达和遗传稳定 性;设备昂贵。
携带激活的H-ras原癌基因小鼠和P53基因敲除小 鼠模型
五、转基因动物在毒理学中的应用
2.致突变评价
用于致突变的实验的Muta TM转基因小鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
此外,用各种质粒作为载体携带靶基因的诱 变制备的转基因小鼠,不仅提高了检测的敏感性, 而且经化学物处理后的动物,基因载体可从不同 组织细胞分离出来,用于化学物的组织细胞特异 毒理学作用的研究
五、转基因动物在毒理学中的应用
虽然转基因小鼠广泛应用于各项研究中,但 其可检测组织重量小,体液容量较小等特点,使 得其在研究中存在较多的困难 因此,国内外毒理学工作者已经充分认识到 这种发展趋势,在国内积极培育和选用大鼠转基 因动物模型提高毒理学研究水平 大鼠的许多遗传特征生理特性表明,更适合 用建立人类疾病模型
用体外培养细胞基因转化技术将目的基因导入E S细胞,注入囊胚产生嵌合体,转化的ES细胞参与生 殖细胞的建立,就将目的基因传给下一代, 从而改 变动物的遗传性状。
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
分离胚胎
.
转入培养皿中培养 分离内层细胞团 胰蛋白酶处理解离
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
嵌合小鼠
杂交、筛选
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因小鼠在毒理学其他方面的应用,主要 还有 用于神经毒性的研究C-fos-LacZ转基因小鼠 用于金属和某些非金属的研究的金属硫蛋白(M T)基因的转基因和基因敲除小鼠,如用MT转基 因 小鼠对镉等的抗性增加,而MT的基因敲除小 鼠对镉、银、汞顺铂和四氯化碳的毒性敏感性增 强 用于毒物代谢CYP2D转基因小鼠和用于心脏毒 性研究的CYP2E转基因小鼠
主要用于化学药物的安全性评估,包括 致癌评价 致突变评价
生殖评价
毒物代谢方面的评价
五、转基因动物在毒理学中的应用
1.致癌评价 用于化学药物安全性评估的Big Blue小鼠和Muta mouse转基因小鼠 用于各种肿瘤的致癌检测实验的TG、AC小鼠H K-fos、ras-H2转基因小鼠
二、转基因动物的发展史
二、转基因动物的发展史
三、转基因动物的原理
将改建后的目的基因用显微注射等方法注
入实验动物的受精卵, 然后将此受精卵植入受
体动物, 使其发育成携带有外源基因的转基因 动物
四、制备转基因动物的方法
1.显微注射技术
2.逆转录病毒载体技术
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
4.精子载体技术
Thank You ~~
五、转基因动物在毒理学中的应用
在外源化学物对机体损害作用的研究中,转基 因技术主要是建立重要的化学物靶整体模型和解 决多基因调节问题其主要应用于 作用靶的鉴定和确认 建立疾病的动物模型 早期发现药物毒性反应
五、转基因动物在毒理学中的应用
(一)转基因小鼠模型在毒理学方面的应用
目前,国际上毒理学方面应用最多的是转基因 小鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
目前,用于毒理学研究的转基因大鼠还较少
如:
•作为诱变的靶基因Big Blue TM转基因大鼠 •分析人铜代谢通路中的功能的ATP7B转基因大鼠 •用于研究学习和记忆功能的NR2B转基因大鼠 •用于钙调素代谢紊乱研究的钙调素TG转基因大鼠
•用于神经毒性研究的C-fos-LacZ转基因大鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
(二)转基因大鼠模型在毒理学方面的应用 大鼠约2.5万到3万个基因中的90%与人类和小 鼠相似,其较大体形使其成为通过连续采样进行 药物评估的理想模型,则转基因大鼠的制备和应 用也越来越广泛
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因大鼠主要用于人高血压、心脏病、肾 功能衰竭和癌症等疾病的研究 如: 人高血压转基因大鼠TGR(mRen-24)27模型 用于研究人类脊椎关节病的HLA-B27转基因大鼠
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因动物在毒理学研究中重要的问题是如 何把从动物所获得的信息用于人,把体外资料用 于体内,把复杂的整体系统化为简单的并能人为 控制的系统,以及如何提高检测的敏感性等 代谢途径上,通过基因转移能人为控制某一外源 化学物的代谢 整体水平上,可人为控制某一基因的表达水平, 从而阐明该基因在外源化学物致毒过程中的作用
纯合转基因小鼠
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎 的形成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一 种载体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此 发育而成的转基因动物 优点:是外源基因的整合率很高,约50%,整合率 在生殖细胞中的比例约为30% 缺点:是不易建立ES细胞系
五、转基因动物在毒理学中的应用
虽然动物实验的有效性和安全性被质疑,但 是现在普遍认为动物体药物代谢动力学曲线适应 人类。只有通过动物实验,才能有效地分析和预 测药物在人体内的吸收分布代谢及排泄情况
目前,欧美各国已经把CYP450s及其同工酶测 定用于新药的筛选及代谢研究,并把它列为新药 申报必须进行的一项实验
4.精子载体技术:精子具有吸附外源DNA的能力 ,受精时,将外源DNA带入受精卵中从而形成转 . 基因动物。常将外源基因用脂质体包裹后通过睾 丸直接注射法使雄性动物携带外源基因。 5、体细胞核移植法
6、原始生殖细胞法
随着转基因技术的不断完善,转基因动物在 医学及生物学领域有广泛的应用,如:发现基因 的新功能、基因特异表达的研究、建立基因表达 调控Leabharlann Baidu动物模型等
1.显微注射技术:
.
注入部位:雄前核
雌前核 细胞质 囊胚腔内
嵌合小鼠
杂交、筛选
纯合转基因小鼠
2.逆转录病毒载体技术
原理:据逆转录病毒cDNA能整合到宿主细胞染色 体内这一特性,克隆、构建重组逆转录病毒载体, 通过转染,实现生殖细胞的基因转移
总体技术路线:将插入外源目的基因的逆转录病毒 载体DNA-通过辅助细胞包装成感染滴度的病毒颗 粒-用来感染已经除去透明带的着床前胚胎-随后 直接导入受体子宫
2.逆转录病毒载体技术
.
嵌合小鼠
杂交、筛选
纯合转基因小鼠
2.逆转录病毒载体技术
优点: 整合率高,插入位点克隆分析较易
缺点: 逆转录病毒具有潜在致癌性 载体构建复杂,容纳外源基因的大小有限(<10Kb) 嵌合体比例大 病毒载体序列可能干扰目的基因的表达
3.胚胎干细胞(ES细胞)技术
. ES细胞:哺乳动物囊胚期胚泡内细胞团中一种未分化 细胞。
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因大鼠在毒理学方面的研究和应用也将 成为一个新的热点越来越受到研究人员的重视
五、转基因动物在毒理学中的应用
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸 和拓展, 成为当今分子药理学和分子毒理学研究的 重要手段 随着转基因技术的发展和克隆的基因增多, 将 会培育出更多的转基因动物用于探索发病机制 另外, 导入双基因或多基因、大片段DNA或人 工酵母染色体以及药物代谢酶基因(如P450基因)的 转基因动物的出现, 将会进一步促进我们更全面地 了解毒物与机体的相互作用
五、转基因动物在毒理学中的应用
甲基转移酶基因敲除小鼠,甲基化是由甲基转移 酶催化的。甲基转移酶主要负责发育过程中建立 和维持甲基化谱式。 甲基化异常与许多发育紊乱及癌症相关 甲基转移酶的研究将加深我们对这一过程调 控机制的理解等
五、转基因动物在毒理学中的应用
4.毒物代谢评价
过氧化酶体增殖体(PPAR)α 基因敲除小鼠,缺 乏PPAR,表达不完全形成青年雄性小鼠表现高胆 固醇血症,但甘油三酯水平正常
五、转基因动物在毒理学中的应用
3.生殖毒性评价
通过条件性和诱导性基因敲除,能对基因突变的 时空特异性进行人为控制,从而避免出现死胎或 动物的出生缺陷
其中有Zp3(编码)透明带硫酸糖蛋白基因敲除 小鼠,如雌激素受体基因、孕酮受体基因、前列 腺素受体、促性腺激素释放激素、黄体生成素受 体、雄激素受体等主要的生殖激素或受体基因敲 除后,对小鼠生殖系统的发育功能以及生殖行为 的影响
小鼠可用于无摄食量增加的迟发性肥胖以及 过氧化酶体对日总能量消耗影响的研究,亦可用 于特异受体的研究
五、转基因动物在毒理学中的应用
CYP2C19转基因小鼠和CYP450s转基因小鼠 其可用于肝脏代谢检测,药物或有毒异物对 人体的安全性评价主要依靠通过动物实验外推至 人的方法进行 实验可以给大鼠犬猴等动物服用一定时间的 受试物,取其肝脏,制备微粒体,用相应的特异 性探针检测CYP450s的活性,以判断新药对CYP45 0s的影响
转基因动物在毒理学中的应用
cly
1
转基因转基因动物 转基因动物的发展史 转基因动物的原理 制备转基因动物的方法
2
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转基因动物在毒理学中的应用
一、转基因与转基因动物
转 基 因:整入动物基因组的外源基因 转 基 因 动 物:是指基因组中稳定整合外源基 因并且能遗传和表达的一类动物 嵌 合 体 动 物:只有部分组织细胞的基因组中整 合有外源基因的动物
参考文献
[1]薛达元.转基因生物风险评估与安全管理[M].2010,中国环境科学出 版社. [2]周莉,李岩,高虹.转基因动物在毒理学中的应用[J].毒理学杂志200 7,21(4期):4-6. [3] 邓友田,王全军,石志坚.遗传毒理学新技术研究进展[J].中南药学 2010,8卷(lO):780-782. [4] 秦续明,惠大龙,黄邓高.转基因动物的研究现状与应用前景[J].广 东农业科学,2008,1 :73-74.