环糊精糖基转移酶产物专一性改造：难题与挑战

环糊精糖基转移酶产物专一性改造： 难题与挑战
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赵新帅， 王占坤， 祁庆生"
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［1<］ 应 。
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环糊精糖基转移酶的催化ຫໍສະໝຸດ 制环糊精糖基转移酶主要催化糖基转移反应， 分
类环糊精糖基转移酶的产物专一性有重要作用， 但 在这一区域进行的点突变实验却没有直接支持这一
为环化反应 （ K>M-NO,PNQB ?R,MPNQB） 、 偶联反应 （ KQ4(-NB@ 和歧化反应 （ 8N’(?Q(Q?PNQB,PNQB ?R,MPNQB ） （图 ?R,MPNQB）
［ ］ 并在 $#!0& 氨基酸环和 2’B0. 处存 2?@、 7A? 残基 11 ， ［1%］ 在差异 。这些区域中的氨基酸残基被认为对各 ［$］ ［#］
转移酶类所特有的 8 功能域的作用却至今尚未阐 明， 最近的研究结果暗示这一功能域可能有保证 I
［1$］ 功能域位于正确位置的作用 ， 但需要更多的相关
研究支持。该功能域作用的研究或许不应当仅局限 于对本功能域内部， 而应当着眼于整个酶的性质来 设计实验。 在该环糊精糖基转移酶的活性中心处， 有0个 底物结合位点依次排列在底物结合槽内， 编号 L % ［0］ 到 5 # 。该酶的催化位点位于底物结合位点 L 1 到 5 % 处。反应时底物的非还原端结合于底物结合 位点 5 # 处。底物结合位点 L 1 同时是激活物结合 位点， 通过诱导契合机制激活该酶的糖基转移反
［1.］ 。该酶由 + 个功能域组成， 编号由 2 到 +$.+&%")’ $ I。功能域 2 中有一个 ! !淀粉酶家 族 成 员 均 有 的
类酶的产物专一性不强， 不论应用哪种环糊精糖基 转移酶最终反应达到平衡时， 都会形成环糊精的混 合物 。另一方面， 环糊精糖基转移酶的这种分类 方法只是较为粗略的划分， 同类的环糊精糖基转移 酶当来源不同时， 性质上也会存在差异。 人们已经从多种微生物中分离得到多种环糊精 糖基转移酶。产生该酶的菌株主要为革兰氏阳性细 !"#$%%&’ 、 ("#)$*"+$%%&’ 、 ,-#./0")"#.! ［&］ 。仅 0*"+1#.$&/、 ,-#./0")"#.0*"+1#. 、 2+1$)0/3+#1#’ 等 有极少数革兰氏阴性细菌能产生活性较强的环糊精 糖基 转 移 酶， 如能产生! !环 糊 精 糖 基 转 移 酶 的
随着环糊精 （ LD-’&30Q6,1I， 简称 L\） 在当今科学 研究和工业生产中的广泛应用， 生产环糊精所必需 的环糊精糖基转移酶 （ LD-’&30Q6,1I J’C-+I&6,+I@H0,+@0， 简称 LX?+@0） 已经成为当今研究的热点。早在 =>== 年人们就发现一些 . ( 8+0%*+$& 菌株能够利用淀粉 ［=］ 生产环糊精 。在过去近百年的研究中， 人们对这 类酶的性质已经有了较为深入的认识， 尤其这类酶 的基因改造工作已经成为研究的热点。但研究中还 存在着一些尚未解决的问题， 如酶产物专一性进化
山东大学生命科学学院， 济南 !9#=##
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摘
要
生产环糊精所必需的环糊精糖基转移酶与其产物专一性进化研究已经成为当今的研究热点。这项研究中的进展不
仅会使环糊精糖基转移酶的应用取得突破结果， 还会对其它酶的改造提供帮助。目前， 人们对这类酶的性质已经有了较为深 入的认识， 但还存在着一些尚未解决的问题， 如酶产物专一性的决定因素尚未系统阐明等。通过对环糊精糖基转移酶各个方 面， 尤其是其产物专一性进化方面研究的回顾， 指出并分析了研究中尚未解决的问题， 并对将来这一研究领域的前景进行了 展望。 关键词 环糊精糖基转移酶， 空间结构， 催化机制， 产物专一性 Y999 文献标识码 ; 文章编号 =###O"#:= （!##$） #!O#=N=O#N
!" 卷 ! 期 !##$ 年 " 月
生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
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［.］ 等。当今各类 4%#*’$#%%" 5)#&/0)$"# ’( ) *+,- 菌株 环糊精糖基转移酶的具体来源见文献 ［%］ 。 ［&］
菌， 例 如
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环糊精糖基转移酶的结构
各种来源的环糊精糖基转移酶在氨基酸序列上
［1］
其中与底物结合和催化有密切相 7C* 桶状结构 1+ ， 关的氨基酸残基便位于该功能域碳端的 "片层上。 功能域 J 和 K 的作用是维持活性中心的稳定和结 ［1"］ 合底物 。功能域 I 含有多个麦芽糖结合位点， 在 各类降解淀粉的酶中有相同结构。点突变实验证 实， 该功能域中的一个麦芽糖结合位点对淀粉的结 合有重要作用， 其它结合位点作用为引导直链淀粉
赵新帅等：环糊精糖基转移酶产物专一性改造： 难题与挑战
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。歧化反应可以看作是这类酶的 “错误” 反应， !） " ! 淀粉酶家族的其它成员也会发生， 如图 ! 所示。图 中 #!、 #$、 #% 表示不同的化学基团， & 表示糖残基 数 （ &!’） 。环糊精糖基转移酶所特有的反应是环化 反应， 是将从底物中酶解下来的低聚糖链自身首尾 相连形成环糊精。环化反应的逆反应便称为偶联反 应， 同样可以由这类酶催化。在具体实践中， 应用较 长链的底物可以促进环化反应， 应用高浓度麦芽低
聚糖或葡萄糖作底物可以促进偶联反应。以天然淀 粉为底物时， 反应初期主要发生歧化反应， 会使底物 溶液粘性系数迅速下降； 但当底物链长达到合适长
［%］ 度时， 环化反应会再次占主导地位 。另一方面， 作
为! "淀粉酶家族成员的环糊精糖基转移酶同样具有 一定 的 淀 粉 水 解 酶 活 性， 能催化淀粉水解反应 （()*+,-)./. +0123/,&） 。
中图分类号
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