BR对红豆杉细胞的紫杉醇含量及PAL的影响

收稿日期:2001209203.作者简介:臧　新(19682),男,博士研究生;武汉,华中科技大学生命科学与技术学院(430074).基金项目:国家教育部“八五”重点科技攻关项目(852********);“九五”重点科技攻关项目(962C02203201).BR 对红豆杉细胞的紫杉醇含量及PAL 的影响臧　新　栗茂腾(华中科技大学生命科学与技术学院)摘要:报道了油菜素内酯(BR )对悬浮培养的中国红豆杉(Tax us chinensis )细胞生长、紫杉醇合成及苯丙氨酸裂解酶(PAL )活性的影响.添加1.7ng ・L -1,17ng ・L -1和170ng ・L -1的BR 分别使细胞的紫杉醇质量分数增加了58.7%,103.9%和86.9%.并且低浓度下油菜素内酯有轻微促进细胞生长的作用.在17ng ・L -1BR 诱导作用下,红豆杉细胞PAL 在40h 内达到蜂值,并显著高于对照.关　键　词:红豆杉;紫杉醇;油菜素内酯;苯丙氨酸裂解酶;细胞培养中图分类号:Q813.1 文献标识码:A 文章编号:167124512(2003)0720103203 通过添加不同浓度的生物或非生物诱导子(如茉莉酸甲酯、水杨酸、花生四烯酸、真菌培养物、Ag +),可以提高红豆杉细胞内紫杉醇单位含量[1].但是大部分诱导子在提高紫杉醇含量的同时,对红豆杉细胞生长具有抑制作用,影响了它们的实际应用.油菜素内酯是一种具有很高生物活性的固醇类物质,是迄今在植物界发现的唯一甾体激素,其基本结构是胆甾烯的衍生物.它具有协调植物体内多种内源激素的相对水平,促进细胞分裂伸长、分化,改变组织细胞化学成份的含量,促进次生代谢,及提高植物抗逆的作用.其作用机理独特,生理效应特强,生物活性极高[2].本实验以BR 作为诱导子对红豆杉细胞的生长、紫杉醇含量等方面的影响等进行探讨.1　材料和方法1.1　实验材料试验用的C42细胞株取自中国红豆杉(Tax us chi nensis ),由本实验室提供.培养条件同Mei 文献[3].油菜素内酯是由云大120有限公司生产的水剂.过滤灭菌后,稀释为不同浓度,接种前添加到培养基中.1.2　细胞鲜重增长率的测定细胞接种量为10g/100mL.细胞收获后,减压抽滤,称重.细胞鲜重增长率=[(收获量-接种量)/接种量]×100%.1.3　紫杉醇含量的测定准确称取冷冻干燥后的细胞100mg ,充分研磨.加入3mL 甲醇浸提,重复3次,合并浸提液并减压抽干,加入氯仿和水萃取,取氯仿相,减压除去氯仿,浸膏用1mL 甲醇定容,HPLC 测定紫杉醇含量,用μg ・g -1干重(DW )表示.1.4　PAL 活力的测定按照文献[4]的方法.用日本岛津UV 2240分光光度计290nm 处测量吸光度.以每g 细胞鲜重(FW )提取的酶液每h 的OD 值变化0.01为一个酶活力单位,以h -1・g -1表示.本文所有实验均3次重复,结果为3次重复的平均值.2　结果与分析2.1　油菜素内酯对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响不同剂量的BR 对红豆杉细胞的生长及紫杉醇的含量鲜重影响不同(图1).在较高质量浓度(高于17000ng ・L -1)BR 添加情况下,鲜重增长率较对照组低,显示出对红豆杉细胞生长有抑制作用.BR 处理浓度ρBR 低于1700ng ・L -1细胞鲜重增长率与对照相组比基本正常,并且当BR 浓度为17ng ・L -1和170ng ・L -1时细胞的鲜重增长第31卷第7期 华　中　科　技　大　学　学　报(自然科学版) Vol.31　No.72003年　7月 J.Huazhong Univ.of Sci.&Tech.(Nature Science Edition ) J ul.　2003率r FW 分别为348.1%和357.9%,细胞生长较对照组(337.3%)稍快.图1　不同浓度的BR 对细胞生长和紫杉醇含量的影响　CK 表示对照组(Control );□表示细胞鲜重增长率r FW ;■表示紫杉醇含量W DW在一个很宽的浓度(1.7～170ng ・L -1)范围内,BR 对紫杉醇合成具有显著的促进作用(图1).当BR 添加浓度为17ng ・L -1时,细胞中紫杉醇的质量分数达到580.4μg ・g -1(DW ),比对照组(284.7μg ・g -1(DW ))增加了1倍.值得注意的是,在上述增强紫杉醇合成的添加浓度范围内,BR 对悬浮细胞没有抑制作用,并且在浓度为17ng ・L -1和170ng ・L -1时,BR 对细胞的生物增长率和紫杉醇含量都有促进作用,这种现象在其他诱导子的作用中是不多见的.综合考虑,本研究把17ng・L -1作为BR 的最适添加浓度,图2为在此图2　最适BR 添加浓度下红豆杉细胞生长和紫杉醇合成动态曲线　—○—对照组细胞鲜重增长率(Cell fresh weight ra 2tio of control );—●—处理组细胞鲜重增长率(Cell fresh weight ratio of treatment );…○…对照组紫杉醇含量(Taxol of control );…●…处理组紫杉醇含量(Taxol of treatment )浓度下,红豆杉细胞生长和紫杉醇含成的动态曲线.从中可以看出对照组的细胞紫杉醇含量从接种时的278.4μg ・g -1(DW )逐渐降低到第8d 的200.7μg ・g -1(DW ),然后又逐渐恢复至培养结束时的283.6μg ・g -1(DW );而处理组的细胞紫杉醇含量则由培养初期的281.2μg ・g -1(DW )逐渐增加到最终的576.3μg ・g -1(DW ).从图2中还可以看出,在培养的第4d ,添加BR 的细胞的紫杉醇含量已经高出对照组,并且这种差距越来越大.2.2　BR 对细胞内苯丙氨酸裂解酶(PAL )活性的影响17ng ・L -1的BR 处理引起红豆杉细胞内的PAL 活性迅速增加.从图3中可以看出,处理后40h ,PAL 表现出最高活性A (289.9h -1・g -1(FW )),是对照组(90.0h -1・g -1(FW ))的3倍多,随后下降,并趋于平缓.在整个培养阶段,处理组的苯丙氨酸裂解酶活性均高于对照,与细胞紫杉醇含量存在着一定程度的相关性(见2.1节).图3　BR 对红豆杉细胞的PAL 活性影响△—对照组PAL 活性(PAL of control );○—处理组PAL 活性(PAL of treatment )PAL 是参与植物系统获得抗性(SAR )和参与次生代谢的重要调节酶.苯丙氨酸经PAL 氨解生成桂皮酸,桂皮酸经β2氧化和氧化脱羧作用产生苯甲酸,苯甲酸是紫杉醇C 213侧链生物合成的前体[5].本实验中BR 诱导处理增强红豆杉细胞内PAL 活性,促进细胞内苯甲酸的形成,从而也从一个方面促进紫杉醇的合成.3　讨论大量的研究表明,BR 可以通过对各种植物的激素水平进行调节来控制植物细胞的生长[2].但以前的大部分实验都是用整株植物或植物切段[6].Roth 等[7]研究了BR 对悬浮培养的烟草细胞生长的影响,发现在一个较宽的浓度范围内对细胞生长产生抑制作用.本实验中BR 在高于17μg ・L -1时抑制细胞的生长,而在17ng ・L -1和170g ・L -1时,BR 对细胞的生长则有轻微的促进作用.这种情况与BR 在滇紫草悬浮细胞中的作用基本相似.BR 已被证明可以提高尼古丁、滇紫草色素等次生代谢物的产量[6].本实验也发现BR 在一定浓度范围内对红豆杉细胞合成紫杉醇具有显著的促进作用.BR 可以间接地引起细胞内Ca 2+水平降低[5,6],而后者作为第二信号系统的信使,在植物SAR 及次生代谢活动中行使重要功能.由此可以推测,正是由于BR 引起的Ca 2+水平降低,401 华　中　科　技　大　学　学　报(自然科学版) 第31卷激活了系列信号传导途径,一些特定的次生代谢途径被开启或加强,路径中与次生代谢有关的某些酶(如PAL )的表达被加强,最终导致细胞内紫杉醇含量增加.本实验所涉及的红豆杉细胞的PAL 活性的表现从一个方面很好地说明了这一点.作为诱导子,BR 增效显著,在最适诱导浓度范围内对培养细胞没有毒害作用,并且用量低微、价格低廉.相信BR 在大规模红豆杉细胞培养生产紫杉醇中将起到重要作用.参考文献[1]Zhang C H ,Mei X G ,Liu L ,et al.Enhanced paclitax 2el production induced by the combination of elicitors in cell suspension cultures of Taxus chinensis.Biotechnol.Lett.,2000,22:1561～1564[2]Cerana R ,Bonetti A ,Marre M T ,et al.E ffect of abrassinosteroids on growth and electrogenic proton ex 2trusion in Azuky bean epicotyls.Physiol Plant 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-1,17ng ・L -1and 170ng ・L -1.Cell growth ratio was slightly raised from 337.3%to 348.1%and 357.9%respectively with BR between 1.7ng ・L -1and 17ng ・L -1.The PAL activity was increased with BR at 17ng ・L -1.The mechanism responsible for these treament effects was discussed.K ey w ords :Tax us chi nenses ;Brassinolide ;paclitaxel ;phenylalanineammonia 2lyase (PAL );cell culture Z ang Xin Doctoral Candidate ;College of Life Sci.&Tech.,Huazhong Univ.of Sci.&Tech.,Wuhan430074,China.(上接第99页)Influence of different technological conditionson the treatment of black liquorRen Yongz heng Zhang Beipi ng Zhang Xiaoyu Y ang Q unAbstract :The principle of biodegradation organic materials by using acid 2producing white rot fungus (AWRF )was introduced.The change of p H ,COD and color shown in the process of treating black liquor of paper 2making with a kind of domesticated AWRF was studied.In the optimal conditions (p H =6～7,black liquor load below 13thousand mg/L ,vaccination amount 20%～30%,small amount of oxygen ,T =25～29℃),the color and COD removal rate is all above 60percent.K ey w ords :white rot fungus ;acid 2producing ;biological acid treatment ;black liquor of paper 2making R en Yongzheng Postgraduate ;College of Envi.Sci.&Eng.,Huazhong Univ.of Sci.&Tech.,Wuhan 430074,China.501第7期 臧　新等:BR 对红豆杉细胞的紫杉醇含量及PAL 的影响 。