L-抗坏血酸电喷雾串联质谱行为研究

2008年第28卷有机化学V ol. 28, 2008第11期, 1971～1977 Chinese Journal of Organic Chemistry No. 11, 1971～1977

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Received January 17, 2008; revised April 28, 2008; accepted June 30, 2008.

国家自然科学基金(No. 20505003)资助项目.

1972有机化学V ol. 28, 2008

从而指导正确地储存和使用维生素C. 另一方面, L-抗坏血酸是目前市场上很多食品的主要营养物质和功能成分之一. 这些复杂基体中抗坏血酸的快速灵敏测定具有重要意义. 常用的测定方法有滴定法[2]、荧光法[3]、分光光度法[4]、色谱法[5]、化学发光分析法[6,7]和电化学法[8]等. 这些方法一般具有试剂不稳定或操作步骤复杂、费时等不足. 目前, 基于新兴质谱技术的质谱学方法[9～14]能够承受各种不同的基体, 可望用于复杂基体样品中维生素C的直接测定[15]. 但是, 由于复杂基体的存在, 必须使用多级串联质谱来排除测定过程中可能存在的假阳性[16]. 因此, 研究L-抗坏血酸在串联质谱中的行为, 也是进行质谱法快速测定抗坏血酸的前提和基础, 对于食品、药品等复杂基体样品中抗坏血酸的快速测定具有重要的实际应用价值.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LTQ-XL型线性离子阱质谱仪(美国Finnigan公司); 电喷雾离子源(ESI, 美国Finnigan公司); Xcalibur数据处理系统(美国Finnigan公司).

L-抗坏血酸(分析纯, 上海国药集团); 甲醇(色谱纯, Fisher Scientific); 氘代甲醇(分析纯, 纯度99.8%, 北京化工厂); 重水(分析纯, 纯度99.8%, 北京化工厂). 1.2 实验方法

正离子模式: 设置LTQ-MS为正离子检测模式, 质谱检测扫描范围为m/z 50～200; 喷雾电压为5.0 kV; 毛细管温度为150 ℃; 喷雾气(N2)流速为20 arb; 样品溶液流速为3 µL/min. 在串联质谱时, 母离子的选择窗口为1.0 Da, 碰撞时间为30 ms, 碰撞能量为20%, 质谱检测扫描范围为(m/z) 50～200. 其它参数采由LTQ-MS系统自动优化. 所有质谱记录时间为1 min.

负离子模式: 设置LTQ-MS为负离子检测模式, 质谱检测扫描范围为m/z 50～200; 喷雾电压为5.0 kV; 毛细管温度为50 ℃; 喷雾气(N2)流速为20 arb; 样品溶液流速为3 µL/min. 在串联质谱时, 母离子的选择窗口为1.0 Da, 碰撞时间为30 ms, 碰撞能量为20%, 质谱检测扫描范围为m/z 50～200. 其它参数采由LTQ-MS系统自动优化. 所有质谱记录时间为1 min.

实验过程: 以体积比为1∶1的甲醇/水溶液作溶剂, 将L-抗坏血酸配成10 ng/mL的溶液后进行质谱分析; 再以体积比为1∶1的氘代甲醇/重水溶液作溶剂, 将L-抗坏血酸溶解, 振荡, 超声30 min, 配成10 ng/mL的溶液后进行质谱分析[17]. 2 结果与讨论

2.1 正离子检测模式

当设置毛细管温度为150 ℃时, 在正离子检测模式下获得L-抗坏血酸的一级质谱图, 如图1所示. 从图1可知, L-抗坏血酸的质谱图比较复杂, 除基峰(m/z 101, 绝对丰度为2.36×104)外, 在较宽的质量范围内(m/z 100～200)内均分布有丰度不一的明显的质谱峰. 因此, 图1充分表明该试剂中L-抗坏血酸不是单一组分, 这可能与L-抗坏血酸本身纯度不够而且容易氧化变质有关[18]. 由于L-抗坏血酸为酸性的极性物质, 能够在正离子检测模式下被质子化, 形成比较稳定的(M＋H)峰而被检测. 图1中质谱峰m/z 177的丰度比较小(5%), 也反映出溶液中L-抗坏血酸的含量比较低. 此外, 质谱图中丰度较低的另外一些质谱峰如m/z 176和175, 可能是L-抗坏血酸脱氢后形成的产物(即L-半脱氢抗坏血酸(M W 175)和L-脱氢抗坏血酸(M W 174)的质子化离子; 而其它众多的低质荷比质谱峰(如m/z 159, 157, 143等)则可能来自溶液中的杂质和L-抗坏血酸离子的碎片

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图1正离子模式下L-抗坏血酸的电喷雾质谱图Figure 1 The ESI mass spectrum of L-ascorbic acid recorded in positive ion detection mode

为了考察L-抗坏血酸在碰撞诱导解离(CID)中的裂解规律, 实验选择质子化的L-抗坏血酸(m/z 177)进行多级串联质谱研究. 在L-抗坏血酸的二级质谱中, 当碰撞能量(CE)为20%时, 母离子m/z 177主要产生质荷比为159, 149, 141, 135, 133, 131, 121和117的碎片离子, 如图2a所示. 其中, m/z 159为母离子丢失水后形成的碎片(相对丰度为100%), 表明在实验条件下, 质子化的L-抗坏血酸(Scheme 1, 1)极易丢失水. 由于受其它基团诱导效应的影响, L-抗坏血酸6号碳原子上的羟基容易接受质子, 成为在ESI过程中首先被质子化的活性部位. 在CID过程中, 质子化的L-抗坏血酸从6号碳原子上丢失水分子, 从而形成伯碳正离子过渡态(2). 由于该过渡态发生氢的重排, 可以形成新的更加稳定的碳正离子(3). 在该离子的三级质谱CID过程中易丢失CH2CO而获

No. 11 丁健桦等：L-抗坏血酸电喷雾串联质谱行为研究1973

图2正离子模式下L-抗坏血酸的二级和三级电喷雾质谱图

(a) m/z 177的二级质谱; (b) m/z 159的三级质谱

Figure 2 The ESI tandem MS spectra of L-ascorbic acid (a) MS/MS of the ions of m/z 177; (b) MS/MS/MS of the ions of m/z 159 得丰度较大的碎片离子m/z 117 (4). 在m/z 117离子的四级质谱中, m/z 117离子能够丢失H2O, 获得的碎片离子(5)经重排得较稳定的碎片离子m/z 99 (6).

由于L-抗坏血酸实际上属于内酯类化合物, 因此在二级质谱CID中可以直接从母离子丢失中性碎片如CO和CO2等, 分别获得碎片离子m/z 133 (7)和m/z 149 (8). 但是, 质谱峰m/z 133, 149的丰度分别为5%和27%, 表明在该实验条件下, 与从母离子中脱去水分子相比, 直接从母离子丢失CO或CO2的难度要大许多. 这是因为质子一般结合在羟基的氧原子上, 脱离6号碳上的水分子仅需要断裂一个C—O键, 其键能为360 kJ/mol; 而解离CO2或CO则需要断裂一个C—C键(键能为347.3 kJ/mol)和一个C—O键, 因而需要较大的能量. 由于碎片CO2的质量比CO大许多, 因此CO2解离时能够带走更多的能量; 但CID能量较低(一般小于5 eV), 导致能耗较大的CO2解离过程比较困难, 所以碎片m/z 149的丰度比碎片m/z 133的丰度高. 碎片m/z 149和m/z 133中均有丰富的羟基, 但是只有碎片离子m/z 149能够再次丢失水分子, 形成的碎片离子(9)经重排得到稳定的m/z 131离子(10), 而在同一质谱图中却没有观测到任

Scheme 1