植物学_RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展

RISC与外源性基因表达的 mRNA的同源区进行特异性结 合,RISC具有核酸酶的功能,在 结合部位切割mRNA, 被切割后 的断裂mRNA随即降解。
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RNAi信号的放大
这是一种类似于RNA聚 合酶的链式反应，该反应 以siRNA中的一条链为引 物，以靶mRNA为模板， 在RdRP作用下扩增靶 mRNA，产生新的二级 siRNAs(单链的具有明显极 性的反义RNA)。在Dicer酶 的作用下，这些二级 siRNAs又能反作用于靶 mRNA，使其降解，产生 更多的siRNAs。
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1.2 RNAi的分子机制
外源性基因随机整合到宿主细 胞基因组内,产生一些dsRNA。 胞质中的核酸内切酶Dicer将这 些dsRNA切割成多个具有特定 长度和结构的短双链RNA(大约 21~25 bp),即siRNA。
siRNA在RNA解旋酶的作用下 解链成正义链和反义链,然后反 义siRNA再与体内一些酶结合形 成RNA诱导的沉默复合物 (RISC)。
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转录后基因沉默（PTGS）
转录水平基因沉默（TGS） 翻译水平上基因沉默 （miRNA）
RNAi引起 基因沉默 的途径
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转录后基因沉默（PTGS）
转录后基因沉默是最普遍的一种沉默机制。PTGS 通过降解mRNA来抑制基因的表达。包括几种现象:一种 现象是植物中的共抑制(co-suppress)现象,即引起外源 基因和靶基因或内源基因同时发生沉默,首次在矮牵牛 中发现此现象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也属于 共抑制现象。另一种是真菌发生静息现象(quelling)。
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RNAi在基因家族方面的研究
Miki等(2005)等将水稻OsRac基因家族的7个成 员通过RNAi技术分别被特异抑制,把基因家族成 员的3‘-非转译区(3’-UTR)作为反向重复序列构建 RNAi载体,其中3个成员被高效抑制。 同时将OsRac基因家族中高保守性强的序列构建 RNAi载体,结果不同效率地抑制了所有成员基因 的表达。这个结果显示RNAi技术在研究基因家 族的有效性。
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RNAi技术在植物功能 基因组学中的研究进展
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Interdaction
RNA干涉(RNA interference,简称RNAi) 是指一些小的双链RNA(double strand RNA, dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基 因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定 基因缺失的表型。 RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。 可以快速分析靶基因的功能，近年来发展迅 速,已成为功能基因组研究和反向遗传学研究 的有力工具。RNAi技术被《Science》杂志 评为2002年度的十大科技突破。
1.3 RNAi作用的特点
高效性
研究发现RNAi过程中不同浓度的dsRNA产生的效果一样。Miki等研究水 稻OsRac基因家族的功能时,通过构建单一基因片段的植物表达载体,成功地抑 制了OsRac基因家族的多个基因。说明RNAi可实现在一个个体或一个细胞内 同时沉默多个基因。
高度特异性
由dsRNA诱导的RNAi只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其它基因 的表达,具有很高的特异性。 siRNA具有特征性的结构:5’末端为磷酸基,3’末端 为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸。这种结构对RNAi是十分必要的。
目的片段大小
目的片段大小的选择也十分重要。Helliwell和Waterhouse在构 建载体时选择50 bp~1 kb的目的片段都成功地导致了目的基因沉 默。但是发现较短的片段效率较低,较长的发夹结构在寄主细菌中 容易重组。 Helliwell建议采用300 bp~600 bp大小的片段更容易 获得比较有效的基因沉默。
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内含子有无
在转录时通过拼接产生功能性间隔(spacer)内含子在介导基因 沉默比无功能性的内含子更有效。形成带有内含子的ihpRNA载体， 其沉默效率比hpRNA高达90%以上。
启动子强弱
启动子强弱对于外源基因的表达水平有重要的影响。CaMV 35S 启动子已广泛应用于双子叶植物中,但在水稻、小麦等禾本科植物 中可用泛素Ubiquitin启动子等,以提高载体的干扰程度 。
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3.2 RNAi载体构建的过程
3.2.1目的片段的克隆
以植株的DNA为模板,用带 特定酶切位点的引物进行PCR 扩增,然后将PCR产物克隆到T 载体上
3.2.2 表达载体的构建 正义基因片段和纯化的 质粒片段连接
带有正义基因片段的质 粒载体与反义片段连接
Fig. 1. Gene constructs used to analyze dsRNA effects.
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Fig. 2. Flowers of wild-type, ag-1 and AG (RNAi) plants. Fig. 3. Phenotypes of wild-type, CLV3 (RNAi), and clv3–2 plants.
植物miRNAs明显特征是剪切靶mRNA,如miR172, 主要功能是作为翻译抑制子。
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RNAi技术概述 RNAi引起基因沉默的途径
植物RNAi表达载体的构建
RNAi技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望
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4.2植物抗病性的研究
1998年,首次报道RNAi技术在防治马铃薯Y病毒抗病的 应用,利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS 载体进行烟草转化,使植株完全免疫。 根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根 癌病危害着许多多年生水果、坚果和观赏性植物。研究 发现iaaM和ipt2个基因在这个疾病中起重要作用。采用 RNAi技术,在拟南芥和番茄中沉默iaaM和ipt2个基因成 功地抵抗了根癌病。
可遗传性
RNAi效应可以稳定的遗传给子代,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式。
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RNAi技术概述 RNAi引起基因沉默的途径 植物RNAi表达载体的构建 RNAi技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望
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Fig. 4. Effects of AG dsRNA on levels of AG mRNA and AG protein Fig. 5. Effects of PANdsRNA on crc-1 transgenic plants. (AandD) crc-1.
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RNAi技术概述
1.1 RNAi的发现
1.2 RNAi的分子机制
1.3 RNAi作用的特点
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1.1 RNAi的发现
1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达以期 得到与对照组注射正义RNA (sense RNA)相反的结果，但结果却令 他们费解：二者同样阻断了par-1基因的表达途径。 1998年,Fire和Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新 小杆线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的 基因沉默(gene silencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。
转录水平基因沉默（TGS）
它是由siRNA指导染色体发生变化(包括DNA和组蛋 白甲基化)是指启动子序列发生甲基化或局部染色体发 生变化,影响转录因子的结合,使基因不能正常转录,下调 基因表达。
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翻译水平上基因沉默
这个过程主要是由内源性miRNA介导的一种基因 沉默。miRNA的前体(pre-miRNA)是70 nt的茎环RNA 或双链RNA,它们在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作 用下分裂成21~25 bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是 具有约22 nt的5’为单磷酸基、3’为羟基的单链RNA。 miRNA与相关蛋白质结合成另一种RISC复合体,RISC 复合体通过和靶mRNA结合,从而导致mRNA的降解或 抑制基因的转录。
双元表达载体
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RNAi技术概述 RNAi引起基因沉默的途径
植物RNAi表达载体的构建
RNAi技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望
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ATP依赖性
研究发现,如果除去或降低内源性ATP含量,dsRNA对靶基因的抑制作用明 显降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加强。说明RNAi是一个对ATP 依赖的过程,且外源性ATP对此无促进作用。
可传播性
在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递;而在动 物中,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与,在膜上形成跨膜通道而传播到整个 机体。
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3 植物RNAi表达载体的构建
3.1转基因RNAi载体构建的关键因素
在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双 元载体是导致RNA沉默的基本结构。在该载体中,目标 基因的cDNA片段被克隆在间隔序列(spacer)的两端,这 些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我 互补的hpRNA(分子内dsRNA)结构。
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4 RNAi技术在植物上的应用
4.1 植物基因 功能的研究
4.2 植物抗病 性的研究
4.3 植物雄性 不育的研究
4.4 植物品种 改良中的应用
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4.1 植物基因功能的研究
Chuang等在花发育研究中采用RNAi技术进一步验证了 AG,CLV3,AP1,PAN等已知功能基因,并开创了RNAi技术在 植物功能基因组学中的应用。
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RNAi技术研究多倍体植物功能缺失
研究表明,在真菌、动物和植物中的RNAi是生物抵御病 毒侵染的一种古老的生理机制。 Richard等在四倍体植株中成功地运用了RNAi技术。用 拟南芥着丝点甲基化相关的dsRNA对拟南芥的四倍体进 行RNA干扰,发现拟南芥的四倍体中对应的着丝点脱甲 基化,拟南芥四倍体中对应的与甲基化有关的mRNA含量 水平剧减。 最近,Travella等在构建的PDS-RNAi和EIN1 -RNAi的六 倍体小麦转基因作物中,成功的抑制了目的基因。研究 证明,RNAi技术是研究多倍体植物功能缺失突变很好的 工具。
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RNAi技术概述 RNAi引起基因沉默的途径
植物RNAi表达载体的构建
RNAi技术在植物上的应用 RNAi存在问题与展望
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siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶 RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶(RNdependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA 再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放 大,最终将靶mRNA完全降解。 www.themegallery.com LOGO