长途运输应激对猪肾脏中HSPs mRNA转录水平及定位影响

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国外生猪育种体系简析及对我国生猪育种的几点思考

国外生猪育种体系简析及对我国生猪育种的几点思考周磊，王晔，毛瑞涵，李佳芮，刘剑锋*（中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）摘要：选择是生猪育种的核心，而准确地选择和选种依赖于完善和成熟的育种体系。

国际养猪发达国家（国际育种企业）对育种体系不断完善，长期进行生长、繁殖和肉品质等各类性状的表型测定，运用多场联合评估和基因组选择等方法不断提高遗传评估的准确性，不断挖掘新的育种性状，并进行测定、评估和选育，实现了种猪群体持续的遗传改良和综合性能的不断提升。

本文对欧美发达国家（国际育种企业）的生猪育种技术体系进行了综述，以期为我国的生猪育种工作提供参考，并促进我国生猪种业的创新发展。

关键词：生猪；育种体系；基因组选择；遗传评估中图分类号：S828.2 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20201130-07遗传评估用来评定个体作为种畜的种用价值，可以反映个体的遗传潜能，是猪育种的一项核心工作。

影响遗传评估准确性的因素首先是表型数据的数量和质量。

大量且高质量的表型数据可显著提高评估的准确性，因而种猪联合育种（多组团育种）的概念在1992年即被提出[1]。

联合育种实现了更加准确的遗传评估和更快的遗传进展，目前已成为国际上主流的育种模式。

随着高通量测序技术的迅速发展，基因组选择逐渐从理论变为现实。

基因组选择技术在不同性状上得到的育种值准确性均高于传统的最佳线性无偏预测模型（Best Linear Unbiased Prediction, ，BLUP）技术[2-3]。

近年来，欧美等养猪发达国家的种猪质量、生产水平和经济效益不断提高，完善的育种体系是其成功的重要原因。

本文对几个具有代表性的欧美发达国家（及国际育种企业）的生猪遗传评估体系和最新育种进展进行简介，并结合我国生猪遗传评估体系中的不足之处进行比较分析，为我国生猪遗传评估体系优化升级和生猪种业的可持续性创新发展提供参考和借鉴。

PGC－lα_调控畜禽肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质研究进展

辛建增，唐婷，刘盛．ＰＧＣ－ｌα调控畜禽肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质研究进展［Ｊ］．畜牧与兽医，２０２４，５６（５）：１３８－１４５．ＸＩＮＪＺ，ＴＡＮＧＴ，ＬＩＵＳ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ－ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１αｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄｐｏｕｌｔｒｙ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ＆ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０２４，５６（５）：１３８－１４５．ＰＧＣ－ｌα调控畜禽肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质研究进展辛建增１，唐婷１，刘盛２∗（１．烟台大学生命科学学院，山东烟台㊀２６４０００；２．烟台大学药学院，山东烟台㊀２６４０００）摘要：过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α（ＰＧＣ－ｌα）是一种具有广泛功能的转录调节因子，其在动物体内参与线粒体生物合成㊁肌纤维类型转化㊁脂肪分化㊁肌内脂肪沉积㊁糖脂代谢㊁能量代谢等多项生理过程，其中，肌纤维类型和肌内脂肪含量与肉品质密切相关㊂因此，在分子水平深入探究ＰＧＣ－１α调控肌肉和脂肪的生长代谢过程将为改善肉品质提供新的研究思路㊂本文系统概述了ＰＧＣ－ｌα的结构特点及ＰＧＣ－１α调控肌肉线粒体增生㊁脂肪分化㊁能量代谢等过程的机制，重点介绍了ＰＧＣ－ｌα调控肌纤维类型转化㊁肌内脂肪沉积㊁糖类代谢及其与肉品质形成之间的可能关系，以期为今后通过ＰＧＣ－１α调控畜禽肌肉脂肪生长代谢，进而改善肉品质提供参考㊂关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α；肌纤维类型；肌内脂肪沉积；能量代谢；肉品质中图分类号：Ｓ８２６㊀㊀㊀文献标志码：Ａ㊀㊀㊀文章编号：０５２９－５１３０（２０２４）０５－０１３８－０８Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ－ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１αｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔａｎｄｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄｐｏｕｌｔｒｙＸＩＮＪｉａｎｚｅｎｇ１，ＴＡＮＧＴｉｎｇ１，ＬＩＵＳｈｅｎｇ２∗（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ２６４０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｔａｉ２６４０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγ（ＰＰＡＲ－γ）ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１α（ＰＧＣ－ｌα）ｉｓａｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒ．Ｔｈｉｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍａｎｙｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓｓｕｃｈａｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ａｄｉｐｏｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ⁃ａｔｉｏｎ，ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒａｄｉｐｏｓｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎａｎｉｍａｌｓ．Ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅａｎｄｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔｃｏｎｔｅｎｔａｒｅｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＧＣ－１αｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｒｅｓｅａｒｃｈｉｄｅａｓｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＰＧＣ－ｌαａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＰＧＣ－１αｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍｕｓｃｌｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ａｄｉｐｏｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｒｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｒｅｇｕ⁃ｌａｔｉｏｎｏｆＰＧＣ－ｌαｏｎｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｔｓｐｏｓｓｉｂｌｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙａｒｅｅｍｐｈａｓｉｚｅｄ；ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｂｏ⁃ｌｉｓｍｏｆｍｕｓｃｌｅａｎｄｆａｔｂｙＰＧＣ－１αｉｎｌｉｖｅｓｔｏｃｋａｎｄｐｏｕｌｔｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰＧＣ－１α；ｍｕｓｃｌｅｆｉｂｅｒｔｙｐｅ；ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｆａｔｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ；ｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；ｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙ㊀㊀畜禽肉品质包括肉色㊁嫩度㊁系水力㊁风味㊁多汁性等多个方面㊂因此，肉品质性状是一个复杂的综合性状㊂肉品质受宰前和宰后多种因素的影响，例如遗传（品种㊁性别㊁年龄㊁基因）㊁营养水平㊁饲养管理㊁宰前运输㊁屠宰方式㊁宰后成熟方式等，其中㊀收稿日期：２０２３－０５－２５；修回日期：２０２４－０３－２０基金项目：烟台大学博士启动基金项目（ＳＭ２０Ｂ１１３）第一作者：辛建增，男，博士，讲师∗通信作者：刘盛，讲师，研究方向为食品化学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｓｈ⁃ｅｎｇ８７＠１２６ｃｏｍ㊂遗传因素起决定性作用㊂然而，在饲养过程中，畜禽肌肉和脂肪的生长发育及代谢对肉品质的形成也起着至关重要作用㊂畜禽肌肉的生长发育及代谢是一个及其复杂的过程，由多种基因和信号通路在不同水平上参与调控，各调控因子与信号通路分工协作组成精细复杂的调控网络，有序调控肌肉的生长发育㊁肌纤维类型的转化㊁肌纤维的能量代谢等生物学过程㊂而脂肪组织是畜禽维持生命活动必不可少的组织，通常储存在皮下㊁内脏㊁肌肉等部位㊂与肉品质最相关的脂肪为肌内脂肪和肌间脂肪㊂其中肌内脂肪的含量与肉品质最为密切，是肉品领域的研究热点，肌内脂肪的含量会影响肉的系水力㊁风味㊁多汁性等品质㊂过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子１α（ＰＧＣ－１α）是肌肉和脂肪生长代谢过程中必需的转录共调节因子，它参与调控肌细胞线粒体生物合成㊁肌纤维类型的转化㊁肌细胞能量代谢等生物学过程㊂ＰＧＣ－１α在脂肪的分化㊁沉积㊁合成㊁代谢等方面也发挥重要的调节作用㊂此外，ＰＧＣ－１α还参与机体的适应性产热㊁肝脏的糖异生㊁血管生成㊁调控细胞中活性氧簇水平㊁调控机体的生物钟基因等生理过程㊂ＰＧＣ－１α功能广泛，参与众多生理调节过程㊂本文将对ＰＧＣ－１α分子结构特征，ＰＧＣ－１α调控肌纤维能量代谢㊁肌纤维糖代谢㊁肌纤维类型转化㊁脂肪分化㊁肌内脂肪沉积㊁脂肪代谢及其与宰后肉品质的可能关系进行了系统阐述，并对相关可能的研究热点进行了展望㊂以期为更深入地探究ＰＧＣ－１α信号通路及其靶基因调控畜禽肌肉脂肪生长代谢和提高肉品质提供参考㊂１㊀ＰＧＣ－１α概述ＰＧＣ－１α是由Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ团队１９９８年最先在小鼠棕色脂肪组织中发现的一种转录共调节因子［１］㊂ＰＧＣ－１α属于ＰＧＣ－１家族，该家族共有３个成员，另外两个分别为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（ＰＰＡＲ－γ）辅激活因子－１β（ＰＧＣ－１β）和ＰＧＣ－１相关辅活化因子（ＰＲＣ），其家族成员蛋白长度存在着一定的差异，但存在着相应的保守序列㊂ＰＧＣ－１家族的Ｎ端结构域均含有转录激活域，Ｃ端结构域均包含富含丝氨酸／精氨酸的ＲＳ域和ＲＮＡ结合区域（ＲＭＭ）［２］㊂ＰＧＣ－１α与ＰＧＣ－ｌβ同源性较高，而与ＰＲＣ的同源性则相对较低㊂人的ＰＧＣ－１α基因位于染色体４ｐ１５１区域，全长为６８１ｋｂ，由１３个外显子和１２个内含子组成，其ｍＲＮＡ含有６９０８ｂｐ，编码一个包含７９８个氨基酸，分子量９１ｋＤａ的蛋白质［３］，其他常见畜禽的ＰＧＣ－１α基因与蛋白质基本信息见表１（引自ＮＣＢＩ）㊂ＰＧＣ－１α的蛋白结构域，其Ｎ端有一个富含酸性氨基酸的转录激活区（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ，ＡＤ），该区内有一个ＬＸＸＬＬ结构域（Ｘ：任意氨基酸；Ｌ：亮氨酸），此结构域是ＰＧＣ－１α与配体依赖型核受体结合的基础㊂负调控元件和转录因子结合位点位于ＰＧＣ－１α的中间区域，当转录因子与ＰＧＣ－１α结合时，负调控元件就会暴露出来［４］㊂Ｃ末端是一个ＲＮＡ结合基本序列ＲＲＭ和富含丝氨酸／精氨酸的ＲＳ区域，这个区域可以与ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的Ｃ末端相互作用，处理新转录的ＲＮＡ㊂ＰＧＣ－１α上还有与细胞呼吸因子（ＮＲＦ）㊁肌细胞特异性增强子２Ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２Ｃ，ＭＥＦ２Ｃ）及ＰＰＡＲγ结合的位点［３］㊂因此，ＰＧＣ－１α是作为转录因子的激活因子来调控其他基因的表达㊂表１㊀人与常见畜禽ＰＧＣ－１α基因和蛋白质基本信息物种所处染色体基因长度／ｋｂｍＲＮＡ长度／ｂｐ内含子数外显子数蛋白肽链长度（氨基酸残基数量）蛋白质分子量／ｋＤａ人４６８１６９０８１２１３８０３９２猪８６９６６７３８１２１３７９６９０狗３６４１５８４１１３１４８０３９１牛６７１５６３２４１２１３７９６９０羊６７１８６６８０１２１３７８７８９鸡４３４８６６１５１２１３８０８９２鸭４３６１９７１６１２１３８０８９２鸽子４３６４４９１３１２１３６７０７７㊀㊀ＰＧＣ－１α分子本身的促转录激活活性较低，只有被相应的受体募集后，其活性才显著增强㊂ＰＧＣ－１α与核受体结合后，会导致ＰＧＣ－１α构象发生改变，并与下游因子作用，发挥转录激活作用㊂ＰＧＣ－１α不仅对ＰＰＡＲγ具有组织特异性的辅激活作用，而且也是类维生素ＡＸ受体（ＲＸＲ）㊁肌细胞增强因子２ｃ（ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２Ｃ，ＭＥＦ２Ｃ）㊁甲状腺激素受体（ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＲ）㊁糖皮质激素受体（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＲ）㊁雌醇受体α（ｅｓ⁃ｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲα）和ＰＰＡＲｓ等核受体（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＲ）的辅激活因子［２，５－７］㊂ＰＧＣ－１α的表达具有组织特异性，通常在线粒体含量丰富和氧化代谢活跃的器官或组织中高表达，如骨骼肌㊁心脏㊁棕色脂肪组织㊁肝脏㊁肾脏和大脑组织等，而在肺㊁小肠㊁结肠和胸腺中只有很少量的表达，在胎盘㊁脾和外周白细胞中未见表达［８］㊂前已述及，ＰＧＣ－１α在肌肉脂肪的生长发育及代谢中发挥着重要调控作用，下面将针对其活性调控㊁肌肉脂肪生长代谢及其与肉品质和一些生理功能的相关作用进行论述㊂２㊀ＰＧＣ－１α活性调控相关信号因子ＰＧＣ－１α含有磷酸化㊁乙酰化㊁糖基化㊁甲基化㊁泛素化等翻译后修饰的位点，这些翻译后修饰对于其发挥作用时的精细化调控具有重要意义［９］㊂其中当前研究较多的为乙酰化和磷酸化修饰㊂沉默信息调节因２相关酶１（ｓｉｒｔｕｉｎ１，ＳＩＲＴ１）和ＡＭＰ依赖的蛋白激酶（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ）是调控ＰＧＣ－１α去乙酰化和磷酸化的关键酶，此两种酶对于机体肌肉脂肪生长发育和能量代谢的精准调控和稳态维持具有重要的意义㊂ＳＩＲＴ１可以将乙酰化后的ＰＧＣ－１α去乙酰化，从而提高ＰＧＣ－１α的活性［１０－１１］㊂此外ＳＩＲＴ１是体内代谢的感受器，当机体处于能禁食或者饥饿等状态下，ＳＩＲＴ１会加速ＰＧＣ－１α的去乙酰化，导致其活性上升，可增加线粒体的合成㊂而一些乙酰转移酶例如组蛋白乙酰化酶氨合成通用控制蛋白５（ｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌ⁃ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＧＣＮ５，ＧＣＮ５）和核受体共激活因子－３（ｓｔｅｒｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ３，ＳＲＣ－３）可以使ＰＧＣ－１α发生乙酰化，从而抑制其活性［１２－１５］㊂此外，ＳＩＲＴ１的去乙酰化作用还是ＰＧＣ－１α调控生物钟基因表达的重要事件㊂ＳＩＲＴ１与乙酰化酶协调作用，精细化调节ＰＧＣ－１α发挥作用㊂ＡＭＰＫ是体内能量感受器，当机体能量处于缺乏状态时，ＡＭＰＫ可使ＰＧＣ－１α磷酸化位点磷酸化，从而提高ＰＧＣ－１α活性，激活与能量代谢相的通路，引起线粒体增生㊁脂肪酸氧化等生物学过程增加［１４］㊂３㊀ＰＧＣ－１α与肌肉生长代谢及肉品质３１㊀ＰＧＣ－１α与肌肉线粒体合成及肉品质线粒体是为骨骼肌生长发育提供能量的细胞器，它对骨骼肌发挥正常生理功能具有重要的意义，ＰＧＣ－１α是调控线粒体生物合成和氧化磷酸化过程中的关键调节因子［１５－１６］㊂研究发现，ＰＧＣ－１α可参与调控肌纤维中线粒体的生成，并且还能够调节线粒体的融合及分裂，在某些组织，如白色脂肪㊁肌肉㊁神经㊁心脏中超表达ＰＧＣ－１α，都会促进线粒体的生成［１５－１７］㊂ＰＧＣ－１α促进线粒体生成主要通过与转录因子结合发挥作用，常见的为核呼吸因子－１（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ－１，ＮＲＦ－１）和核呼吸因－２（ｎｕｃｌｅａｒｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ－２，ＮＲＦ－２）㊂研究发现，ＰＧＣ－１α与核呼吸因子结合后会刺激线粒体转录因子Ａ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＡ，ｍｔＴＦＡ）的合成㊂这些因子直接影响线粒体生成，在线粒体内引起线粒体ＤＮＡ的双向转录，实现了线粒体的增殖［１８－１９］㊂畜禽宰杀放血后，肌肉中的线粒体发生肿胀，最终结构破坏而破裂，但肉品质形成过程中，线粒体的生理代谢状态与肉嫩度㊁肉色㊁持水力等品质有着密切关系㊂研究表明，宰后初期肌肉线粒体耗氧率与肉品嫩度密切相关，高嫩度牛肉拥有更高的线粒体耗氧率［２０］㊂宰后肌肉中线粒体影响肉色稳定性主要通过两种途径，一是线粒体与氧合肌红蛋白竞争氧气，使其转变为脱氧肌红蛋白状态，此情况过度发生可导致肉色变暗；另一方面，线粒体具有高铁肌红蛋白还原酶活性，可以将氧化的高铁肌红蛋白转化为还原态脱氧肌红蛋白，为鲜红色氧合肌红蛋白的生成提供还原态肌红蛋白［２１－２２］㊂肌肉持水力是肉品一个重要的品质，最近研究表明，牛肉宰后成熟过程中，线粒体脂肪成分的变化与肌肉持水力的变化密切相关［２３］㊂ＰＧＣ－１α已被证明其与畜禽生长和肉品质密切相关，且已被列为能够候选基因［２４］，然而未见ＰＧＣ－１α调控肌肉中线粒体与宰后肉品质的相关研究，ＰＧＣ－１α对肌肉中线粒体的调控及宰后肉品质的变化形成需要开展深入研究㊂３２㊀ＰＧＣ－１α与肌肉糖类代谢葡萄糖是肌肉组织主要的能源物质，糖类氧化供能为肌肉的各类生理活动提供能量㊂ＰＧＣ－１α在体内糖代谢的过程中发挥重要调节作用，主要表现在以下几个方面：首先ＰＧＣ－１α是糖异生过程的关键调节因子㊂在禁食情况下，ＰＧＣ－１α会在肝细胞中大量表达，与其他相关调节因子配合在转录水平上激活糖异生关键酶组，如葡萄糖－６－磷酸酶㊁磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等，最终导致肝糖输出增加［２５－２６］㊂其次，葡萄糖进入肌肉细胞需要葡萄糖转运载体４（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ４，ＧｌｕＴ４）的转运，ＰＧＣ－１α可与肌细胞增强子因子２（ｍｙｏｃｙｔｅｅｎｈａｎｃｅｒｆａｃｔｏｒ２，ＭＥＦ２）共同作用，刺激ＧｌｕＴ４的表达，从而增加肌细胞内葡萄糖的水平㊂此外，ＰＧＣ－１α在某些情况还可抑制肌细胞葡萄糖的氧化，其与雌激素相关受体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒα，ＥＲＲα）结合后，刺激丙酮酸脱氢酶４表达，从而抑制葡萄糖氧化和增加葡萄糖吸收来补充肌糖原贮备，为下一次的肌肉运动做准备㊂肌肉中的糖原是宰后生成乳酸的原料，动物胴体在宰后冷藏排酸过程中，糖原转化为乳酸导致肌肉ｐＨ值下降，这是宰后肌肉排酸的原理㊂而宰后ｐＨ的下降幅度和速度影响肉品质形成，宰后肌肉ｐＨ值过高或过低都会形成异质肉㊂而ＰＧＣ－１α对于肌肉糖代谢具有调控作用，宰前肌肉中ＰＧＣ－１α的表达水平和活性对于宰后肌肉糖原水平㊁ｐＨ值变化及肉品质形成是否具有影响，未见相关报道，需要开展相应研究㊂３３㊀ＰＧＣ－１α与骨骼肌肌纤维类型转换及肉品质不同肌纤维类型对于肌肉发挥生理功能具有重要的作用，比较常见的例子是，动物不同部位的肌肉的肌纤维组成存在着明显差异，且肉品质也存着差别㊂肌肉纤维类型受遗传㊁运动㊁营养㊁和环境等多种因素的影响㊂ＰＧＣ－１α是调控肌纤维类型转变的主要因子，ＰＧＣ－１α基因高表达，可以提高与氧化型肌纤维有关的基因表达，提高细胞色素Ｃ和肌红蛋白的含量提高有氧呼吸能力与线粒体的数量，增强抗疲劳的能力等，主要为使酵解型肌纤维向氧化型肌纤维转化［２７－２８］㊂超表达ＰＧＣ－１α的转基因小鼠，其骨骼肌中Ⅱ型肌纤维表现出Ⅰ型肌纤维的蛋白特性，其中ＴＮＮ１蛋白㊁肌红蛋白和肌钙蛋白Ⅰ明显增加，Ⅱ型肌纤维逐步转化为Ⅰ型肌纤维［２９］㊂人和动物的骨骼肌类型变化研究表明，ＰＧＣ－１α的表达量与快肌纤维的含量成负相关，与慢肌纤维的含量成正相关［３０－３１］㊂相关研究已证实，寒冷可以刺激诱使鸡的胸肌部分从ⅡＢ型转化为ⅡＡ型，而ＰＧＣ－１α的上调表达在其中发挥了关键的作用［３２］㊂ＰＧＣ－１α通过调节肌纤维类型影响畜禽肉品质已经被证实，但是其发挥作用的详细分子机制还不清晰，需要开展相应的深入研究㊂３４㊀ＰＧＣ－１α与肌肉中活性氧含量及肉品质ＰＧＣ－１α可促进肌肉等组织中线粒体的合成，还能刺激线粒体呼吸链电子转运活性，从理论上讲，ＰＧＣ－１α将导致细胞内活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）水平提高，但是实际上并非如此，在肌肉和棕色脂肪中，运动与寒冷环境的暴露均和ＲＯＳ负面影响没有关联，这主要是ＰＧＣ－１α可以增强很多抗氧化酶的表达［３３－３４］㊂即ＰＧＣ－１α有两种能力，刺激线粒体电子转运的同时抑制ＲＯＳ水平㊂这样，肌肉组织，棕色脂肪通过提升线粒体代谢应对外部环境变化的过程中，不会对自身造成氧化损伤㊂而ＲＯＳ与宰后肉品的形成密切相关，动物在宰杀后，ＲＯＳ主要来源于线粒体和脂肪的氧化，产生的ＲＯＳ往往会对某些肉品质，肉色㊁嫩度㊁系水力等产生负面影响［２３，３５］㊂ＲＯＳ与宰后肉品质形成一直是肉品科学领域研究的热点，ＰＧＣ－１α已被证实是影响肉品质的候选基因之一，但是其调控宰后肌肉中ＲＯＳ的作用机制及如何影响肉品质未见相关报道㊂４㊀ＰＧＣ－１α与脂肪生长代谢及肉品质４１㊀ＰＧＣ－１α与脂肪细胞分化动物脂肪组织中大约１／３是脂肪细胞，其余的２／３是成纤维细胞㊁微血管㊁神经组织和处于不同分化阶段的前脂肪细胞㊂由前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程是一个涉及多个信号通路的复杂调控过程，该过程大致可为４个阶段，分别为生长抑制阶段㊁克隆扩增㊁早期分化和终末分化［３６］㊂ＰＰＡＲｓ在动物脂肪发育分化的早期分化阶段开始发挥调控作用，它们与相应的因子协调作用，共同调节脂肪的增殖分化㊂ＰＰＡＲγ是ＰＰＡＲｓ家族成员，它是脂肪细胞分化的及其的重要因子，其通常可作为前体脂肪分化处于早期分化的标志基因，是脂肪细胞增殖分化过程中起决定性作用的基因㊂研究证实，ＰＰＡＲγ缺失的胚胎干细胞能够分化为多种细胞，但唯独不能分化为脂肪细胞㊂此外，ＰＰＡＲγ基因敲除的小鼠，在胚胎期１０ｄ左右就会死亡，且未在胚胎内检测到脂肪细胞，而正常小鼠在胚胎期１０ｄ即可检测到脂肪细胞的存在［３６］㊂这说明ＰＰＡＲγ在脂肪分化形成过程中起关键作用，ＰＰＡＲγ发挥脂肪分化调控作用时，需要先与ＲＸＲα形成异源二聚体，然后与所调节基因启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件（ＰＰＲＥ）结合才发挥转录调控作用，而ＰＧＣ－１α作为ＰＰＡＲγ配体，能促进ＰＰＡＲγ与相应调控因子的结合［３７］㊂很多哺乳动物体内存在着白色脂肪组织㊁米色脂肪组织和棕色脂肪组织三种，白色脂肪主要作用为贮存能量，米色脂肪具有贮存能量和非战栗产热的功能，棕色脂肪主要进行非战栗产热㊂在细胞结构和功能上，白色脂肪细胞拥有一个大脂滴用于存贮能量，而棕色脂肪细胞拥有多脂滴㊁多线粒体的结构㊂ＰＧＣ－１α能够促进白色脂肪向棕色脂肪转化，它能够刺激白色脂肪中线粒体的大量生成，还能增加解偶联蛋白１（ＵＣＰ１）等分子的生成，这些改变可使白色脂肪逐渐转化为棕色脂肪组织［３８］㊂４２㊀ＰＧＣ－１α与脂肪氧化供能脂肪是畜禽体内重要的储能物质，在冷暴露㊁禁食㊁运动等情况下，可为机体提供能量，其中脂肪酸β氧化产能是其最为主要的供能方式㊂脂肪是也骨骼肌获取能量的重要物质㊂研究表明，过表达ＰＧＣ－１α可增加骨骼肌线粒体的生物合成，也可使脂肪酸氧化相关酶含量上升或者活性增强，从而增加脂肪酸氧化供能［３９－４０］㊂在小鼠骨骼肌和猪前脂肪细胞过表达ＰＧＣ－１α，可促进脂肪酸氧化过程中相关基因肉碱棕榈酰转移酶１β（ＣＰＴ１β）㊁肝型脂肪酸结合蛋白（ＦＡＢＰ１）㊁过氧化物酶酰基辅酶Ａ氧化酶１（ＡＣＯＸ１）㊁中链酰基辅酶Ａ脱氢酶（ＭＣＡＤ）㊁脂肪酸转位酶（ＣＤ３６）等的表达，其中ＣＰＴ１β是脂肪酸氧化过程中的限速酶［３８－４１］㊂ＣＤ３６㊁ＦＡＢＰ１是脂肪酸转运的重要蛋白，可将脂肪酸逐步转运至肌肉等组织，便于氧化供能㊂而ＡＣＯＸ１㊁ＭＣＡＤ是参与脂肪酸氧化过程中的关键酶㊂过表达ＰＧＣ－１α还可促进氧化磷酸化相关基因ＡＴＰＳｙｎｔｈａｓｅ㊁ＣｙｔＣ㊁ＣＯＸⅢ等的表达［２７］㊂而在ＰＧＣ－１ａ敲除后的小鼠表现为心脏功能不全，肌肉耐力下降，轻度心动过缓，心肌脂肪酸氧化能力下降，能量产生减少［４２－４４］㊂以上研究说明ＰＧＣ－１α在肌肉的脂肪酸氧化供能方面起重要的调节作用㊂４３㊀ＰＧＣ－１α与肌内脂肪沉积及肉品质肌内脂肪的沉积是一个涉及多种信号通路和代谢因子的复杂过程，ＰＰＡＲｓ家族成员㊁肌内脂肪转运相关因子等发挥了重要的作用㊂ＰＧＣ－１α是ＰＰＡＲｓ家族某些因子的配体，其在肌肉脂肪代谢过程中发挥了重要作用㊂ＰＧＣ－１α不仅能够增加肌肉脂肪的分解代谢（前已述及），而且还可增加肌细胞中脂肪的合成代谢㊂通过肌细胞培养实验和转基因小鼠试验证实，ＰＧＣ－１α不仅能增加脂肪的分解代谢，还可以增加肌细胞内脂肪酸和磷脂等脂肪的合成代谢［４５－４６］，且ＰＧＣ－１α转基因小鼠的脂肪酸转运蛋白等脂质代谢相关蛋白也增加了［４６］㊂ＰＧＣ－１α对于肌内脂肪的双向调控作用，对于动物维持生命活动具有重要的意义，不仅能够保障机体对于能量的需求，还对机体后续的生命活动具有重要的意义㊂其发挥脂肪调控作用，还要取决于动物机体所处的状态㊂畜禽上的相关研究已经证实，ＰＧＣ－１α与脂肪沉积及肉品质存在一定关联㊂在猪上的研究表明，ＰＧＣ－１α参与猪脂肪沉积的基因，ＰＧＣ－１α基因多态性与失水率㊁剪切力等肉品指标显著相关［４７－４９］㊂因此，ＰＧＣ－１α已被列为猪脂肪沉积及肉品质的候选基因，且在藏猪上的研究表明ＰＧＣ－１α与肌内脂肪沉积密切相关［３６］㊂在鸡上的研究也证实，ＰＧＣ－１α多态性与鸡腹部脂肪的沉积显著相关［５０－５１］㊂然而，在牛上的研究表明，肌内脂肪含量及嫩度等品质与ＰＧＣ－１α存在一定的相关性，但是未达到显著水平［５２］㊂以上研究表明由于遗传背景的差异，不同畜禽ＰＧＣ－１α在调控肌肉脂质代谢方面可能存在着差异㊂但是当前研究大多停留在分析推测层面，并未对其作用的机理及信号通路作用方式进行深入研究，因此需要对ＰＧＣ－１α调控肌肉代谢，尤其是调控脂肪代谢开展深入的研究，为优质肉品的生产提供研究基础㊂４４㊀ＰＧＣ－１α与机体的适应性产热适应性产热是机体应对外界刺激以产热的形式消耗能量的生理过程，对于动物在特定环境下，维持正常体温和生命活动是必须的，主要发生在骨骼肌和棕色脂肪组织㊂其中小型动物，如小鼠，大鼠等主要依靠棕色脂肪组织进行适应性产热，而畜禽则以肌肉适应性产热为主㊂棕色脂肪的分化形成需要ＰＰＡＲγ发挥作用，但其发挥作用需要ＰＧＣ－１α的辅助，ＰＧＣ－１α结合并激活ＰＰＡＲγ后才能刺激棕色脂肪细胞分化过程中基因的转录［１５，５３－５４］㊂ＰＧＣ－１α还可通过另外两个方面来加快适应性产热，首先是促进适应性产热原料的摄取，促进棕色脂肪和肌肉对产热原料，如葡萄糖和脂肪的摄取；促进适应性产热过程中关键因子的合成及表达，主要是为了适应性产热过程的顺利进行，如促进线粒体的生物合成，促进呼吸链相关基因的表达，促进氧化磷酸化相关基因的表达等［５５－５６］㊂当前未见ＰＧＣ－１α调控畜禽适应性产热与肉品质的相关研究，但宰后迅速科学降低屠体的温度，防止肉品质因为过热而出现变质是当前肉品科学领域的一个重要的研究方向㊂５㊀ＰＧＣ－１α与生物钟相互反馈调控畜禽骨骼肌代谢㊀㊀生物钟是生物机体生命活动的内在节律性㊂体温㊁血压㊁睡眠㊁内分泌㊁肝脏代谢㊁行为等重要生命活动均受到生物钟相关基因的调控［５７－５９］，研究表明生物钟还可参与调控细胞周期［６０］㊂其中昼夜节律及光照是调节生物钟基因表达的最常见的外部环境因素，这些因素的变化会影响畜禽的生长发育和动物性产品的质量㊂生物钟相关调控规律已在畜禽生产领域得到了应用，其可用于改善动物的生长，提高动物性产品的质量㊂Ｔａｏ等［６１］的研究表明，生物钟基因在蛋鸭卵巢的表达水平与产蛋量密切相关㊂光刺激可通过影响生物钟基因的表达，提高肉仔鸡生长期体重和胸肌产量，改善饲料转化率［６２］㊂生物钟基因与奶山羊乳腺代谢密切相关，饲喂不同饲料可改变调生物钟基因表达，调控奶山羊的泌乳［６３］㊂畜禽骨骼肌中存在着生物钟基因，骨骼肌的生命活动受到生物钟基因的调控，ＰＧＣ－１α是连接生物钟和能量代谢的关键调控因子［６４］㊂研究表明，ＰＧＣ－１α在骨骼肌中的表达呈现明显的昼夜节律性，且ＰＧＣ－１α敲除小鼠在能量代谢方面出现异常的生理节律㊂ＰＧＣ－１α与生物钟基因形成反馈调节回路，首先ＰＧＣ－１α是生物时钟基因的上游调节因子，ＰＧＣ－１α能够诱导生物时钟关键基因的表达，如脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白１基因（Ｂｍａｌ１）㊁时钟基因（Ｃｌｏｃｋ）和反向成红细胞增多症基因（Ｒｅｖ－ｅｒｂａ）等㊂此外，ＰＧＣ－１α还可以和视黄酸受体相关的孤儿受体（ＲＯＲα／γ）协同作用，使染色质的局部结构活化，从而激活Ｂｍａｌ１的转录［６５］㊂此外，ＳＩＲＴ１对ＰＧＣ－１α的去乙酰化是导致Ｂｍａｌ１激活的关键事件［６６］㊂其次，Ｃｌｏｃｋ１ａ：Ｂｍａｌ１ｂ复合体又能参与调控ＰＧＣ－１α的表达㊂在畜禽骨骼肌中生物钟基因与ＰＧＣ－１α共同调节骨骼肌的糖脂和能量代谢等生命活动，对于畜禽骨骼肌的生长发育具有重要的意义㊂当前缺乏ＰＧＣ－１α与生物钟基因联合作用调控畜禽肉品质的相关入研究，这可能会成为肉品领域新的研究方向㊂６　小结与展望综上所述，ＰＧＣ－１α作为一种多效转录调控因子，除参与调控肌肉脂肪生长发育及能量代谢外，还参与骨骼肌脂肪的沉积㊁肌纤维类型转化等生理活动，不仅能够在转录水平上调控骨骼肌能量代谢，而且还与生物钟基因相互作用反馈调节肌肉脂肪的生长发育㊂近年来随着我国人民水平的提高和饮食结构的改善，对于肉品质提出了更高的要求，例如肉品嫩度㊁多汁性和大理石花纹等，这些品质与肌纤维类型和肌内脂肪含量密切相关㊂如何生产肌纤维类型比例合适㊁肌内脂肪适中的肉品，是当前动物营养领域和肉品科学领域的研究热点㊂这与骨骼肌和脂肪生长代谢显著相关，且ＰＧＣ－１α在其中发挥了重要作用㊂尽管针对ＰＧＣ－１α调节骨骼肌生长发育㊁肌纤维类型转换㊁脂肪沉积㊁能量代谢的分子机制，已进行了大量的系统研究，也取得了一些重大进展，但还存在许多问题，诸如ＰＧＣ－１α如何精细调节肌内脂肪沉积，ＰＧＣ－１α调控肌纤维转换和能量代谢的详细信号通路，以及ＰＧＣ－１α与脂肪因子瘦素㊁脂联素㊁抵抗素等的相互激活转录机制，特别是如何通过有效地干预ＰＧＣ－１α调控肌肉脂肪沉积及靶向控制ＰＧＣ－１α介导肌纤维类型转换等㊂今后需对这些问题进行深入探索，以期通过ＰＧＣ－１α调控畜禽肌肉的生长发育㊁脂肪代谢㊁能量代谢等生理过程来提高肉品质㊂参考文献：［１］㊀ＭＩＴＲＡＲ，ＮＯＧＥＥＤＰ，ＺＥＣＨＮＥＲＪＦ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｓ，ＰＧＣ－１αａｎｄβ，ｃｏｏｐｅｒａｔｅｔｏｍａｉｎｔａｉｎｃａｒｄｉａｃｍｉｔｏ⁃ｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｓｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＪＭｏｌＣｅｌｌＣａｒｄｉｏｌ，２０１２，５２（３）：７０１－７１０．［２］㊀ＪＡＮＮＩＧＰＲ，ＤＵＭＥＳＩＣＰＡ，ＳＰＩＥＧＥＬＭＡＮＢＭ，ｅｔａｌ．Ｒｅｇｕｌａ⁃ｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｙｏｆＰＧＣ－１α［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０２２，１８５（８）：１４４４．［３］㊀ＥＳＴＥＲＢＡＵＥＲＨ，ＯＢＥＲＫＯＦＬＥＲＨ，ＫＲＥＭＰＬＥＲＦ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒγｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１（ＰＰＡＲＧＣ１）ｇｅｎｅ：ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｇｅｎｏｍｉｃｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｃｈｒｏ⁃ｍｏｓｏｍａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｉｓｓｕｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９９，６２（１）：９８－１０２．［４］㊀ＰＵＩＧＳＥＲＶＥＲＰ，ＲＨＥＥＪ，ＬＩＮＪ，ｅｔａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｅｎｅｒｇｙｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅｔｈｒｏｕｇｈｐ３８ＭＡＰｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰＰＡＲγｃｏ⁃ａｃｔｉｖａｔｏｒ－１［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌ２００１，８：９７１－９８２．［５］㊀ＴＣＨＥＲＥＰＡＮＯＶＡＩ，ＰＵＩＧＳＥＲＶＥＲＰ，ＮＯＲＲＩＳＪＤ，ｅｔａｌ．Ｍｏｄｕ⁃ｌａｔｉｏｎｏｆｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－αｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｔｈｅｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒＰＧＣ－１［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０００，２７５（２１）：１６３０２－１６３０８．㊀［６］㊀ＢＨＡＬＬＡＳ，ＯＺＡＬＰＣ，ＦＡＮＧＳ，ｅｔａｌ．Ｌｉｇａｎｄ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｅｇｎａｎｅＸｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓｗｉｔｈｈｎｆ－４ｓｉｇｎａｌｉｎｇｂｙｔａｒｇｅｔｉｎｇａｃｏｍｍｏｎｃｏ⁃ａｃｔｉｖａｔｏｒＰＧＣ－１α：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｈｅｐａｔｉｃｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００４，２７９（４３）：４５１３９－４５１４７．㊀［７］㊀ＲＨＥＥＪ，ＩＮＯＵＥＹ，ＹＯＯＮＪＣ，ｅｔａｌ．ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｆａｓｔｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｂｙＰＰＡＲγｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ－１α（ＰＧＣ－１α）：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ４αｉｎｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００３，１００（７）：４０１２－４０１７．［８］㊀马燕．藏羚羊和藏系绵羊ＰＧＣ－１α基因编码区的克隆与分析［Ｄ］．西宁：青海大学，２０１２．［９］㊀张林．超表达猪源ＰＧＣ－１α促进小鼠和猪肌纤维类型转变的研究［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２０１４．［１０］ＲＯＤＧＥＲＳＪＴ，ＬＥＲＩＮＣ，ＨＡＡＳＷ，ｅｔａｌ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｌｕ⁃ｃｏｓｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈａｃｏｍｐｌｅｘｏｆＰＧＣ－１αａｎｄＳＩＲＴ１［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３４（７０２９）：１１３－１１８．［１１］ＷＡＮＧＷ，ＷＵＤ，ＤＩＮＧＪ，ｅｔａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄｒｏｕｇａｎｄｅｃｏｃｔｉｏｎａｔｔｅｎ⁃ｕａｔｅｓｈｅｐａｔｏｃｙｔｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓ⁃ｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄＳＩＲＴ１／ＰＧＣ－１αｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔＳｃｉ，２０２３，１０２（１０）：１－１９．［１２］ＬＥＲＩＮＣ，ＲＯＤＧＥＲＳＪＴ，ＫＡＬＵＭＥＤＥ，ｅｔａｌ．ＧＣＮ５ａｃｅｔｙｌｒａｎｓ⁃ｆｅｒａｓｅｃｏｍｐｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌｓｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｈｒｏｕｇｈｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＧＣ－１α［Ｊ］．ＣｅｌｌＭｅｔａｂ，２００６，３（６）：４２９－４３８．［１３］ＹＥＦ，ＷＵＬ，ＬＩＨ，ｅｔａｌ．ＳＩＲＴ１／ＰＧＣ－１αｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｒｓｅｎｉｃ－ｉｎｄｕｃｅｄｍａｌｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｄａｍａｇｅｔｈｒｏｕｇｈｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｂｌｏｃｋｅｄｂｙｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｚｉｎｃ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎＰｏｌｌｕｔ，２０２３，３２０：１２１０８４－１２１０８６．［１４］ＮＥＴＯＩＶＳ，ＰＩＮＴＯＡＰ，ＭＵＮＯＺＶＲ，ｅｔａｌ．Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃａｎｄｍｕｌｔｉ－ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｔｉｏｎｓｏｆｐｈｙｓｉｃａｌｅｘｅｒｃｉｓｅｏｎＰＧＣ－１αｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇｔｈｅａｇｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．ＡｇｅｉｎｇＲｅｓＲｅｖ，２０２３，８７：１０１９３５－１０１９５４．㊀［１５］ＰＵＩＧＳＥＲＶＥＲＰ，ＷＵＺ，ＰＡＲＫＣＷ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｌｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏ⁃ａｃｔｉｖａｔｏｒｏｆｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓｌｉｎｋｅｄｔｏａｄａｐｔｉｖｅｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９８，９２（６）：８２９－３９．［１６］ＬＩＬ，ＬＵＺ，ＷＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎａｌｌｅｖｉａｔｅｓｃｈｒｏｎｉｃｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｉｓｏｒｄｅｒａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｅｎｅｒｇｅｔｉｃｄｙｓ⁃ｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＧＰＲ３０－ＡＭＰＫ－ＰＧＣ－１αｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈ⁃ｗａｙｓｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒｓｏｆｂｒｏｉｌｅｒｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］．ＰｏｕｌｔＳｃｉ，２０２３，１０３（１）：１－１２．［１７］ＧＡＲＮＩＥＲＡ，ＦＯＲＴＩＮＤ，ＺＯＬＬＪ，ｅｔａｌ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｃｈａｎｇｅｓｉｎ。

高尔基体概述

高尔基体概述高尔基体（Golgi apparatus）是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。

又称高尔基器或高尔基复合体；在高等植物细胞中称分散高尔基体。

最早发现于1855年，1898年由意大利人卡米洛•高尔基（Camillo Golgi，1844-1926）在光学显微镜下研究银盐浸染的猫头鹰神经细胞内观察到了清晰的结构，因此定名为高尔基体。

因为这种细胞器的折射率与细胞质基质很相近，所以在活细胞中不易看到。

高尔基体从发现至今已有100多年的历史，其中一半以上的时间是进行关于高尔基体的形态甚至是它是否真实存在的争论。

细胞学家赋予它几十种不同的名称，也有很多人认为高尔基体是由于固定和染色而产生的人工假像。

直到20世纪50年代应用电子显微镜才清晰地看出它的亚显微结构。

它不仅存在于动植物细胞中，而且也存在于原生动物和真菌细胞内。

形态与组成高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。

常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出的一面对着内质网称为形成面（forming face）或顺面（cis face）。

凹进的一面对着质膜称为成熟面（mature face）或反面（trans face）。

顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡，在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。

顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡（图6-24），在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中（图6-25）。

图6-24高尔基体各部分的名称图6-25培养的上皮细胞中高尔基体的分布（高尔基体为红色，核为绿色）引自/因其看上极像滑面内质网，因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。

扁平囊的直径为1μm，由单层膜构成，膜厚6~7nm，中间形成囊腔，周缘多呈泡状，4~8个扁平囊在一起，某些藻类可达一二十个，构成高尔基体的主体，称为高尔基堆（Golgi stack）。

高尔基体膜含有大约60%的蛋白和40%的脂类，具有一些和ER共同的蛋白成分。

神经重症患者的血糖控制

士垦匡苎担由2Q Q§生2旦笙§鲞差!Z塑Q M i g!Q￡￡n!!!M!尘￡iⅡ￡，5￡P!￡堡垒盟2Q Q g：№!§，丛Q：12神经重症患者的血糖控制赵恩龙中图分类号：R587文献标识码：B文章编号：1671-8194(2008)17-0385-01应激性高糖血症是危重症患者普遍存在的问题，通过影响机体代谢状态、免疫功能，增加感染性并发症发生，并成为独_、芏因素影响危重症预后。

合并急性中枢神经系统损害的病人，应激性高血糖的高发病率亦是临床上突出、常见的问题，如脑卒中(1／3患者)、急性颅脑损伤的患者，并可能成为继发性的颅脑损害的因素之一，其血糖升高的程度与病变的部位、大小相关，与昏迷的程度、并发症的发生及预后亦相关。

实验与临床研究结果表明：由创伤导致的脑损伤后血糖升高是导致患者死亡和伤残的重要原因之一，并与脑细胞损害形成恶性循环。

循环中血糖水平也反应了脑内的血糖升高程度，而高血糖对脑细胞的有害影响可能来自几方面：1)增加糖的酵解，导致乳酸生成增加，尤其是缺血缺氧情况下，大量乳酸产生并堆积，造成脑内乳酸性酸中毒；2)自由基产生增加3)无氧代谢增强，可导致能量生成障碍，线粒体A TP生成减少，神经细胞膜内外的钠钾交换障碍，使细胞内高钠，细胞外高钾等；上述改变均可导致和加重脑细胞水肿与颅压升高，加重脑细胞代谢障碍。

高血糖的机制与血糖调节激素的改变、皮质激素的大量使用、外周胰岛素水平与胰岛素抵抗，以及既往合并有糖尿病等相关。

但是，对危重症患者，应激性高血糖的诊断标准尚不明确，糖化血红蛋白水平的升高(>6％)可以评价过去2到3个月血糖的控制情况，但不能作为诊断糖尿病的标准。

传统的观念认为血糖升高是应激后能量代谢需要的代偿性反应，然而，越来越多的临床研究证实，血糖升高的程度与颅脑损伤、脑卒中、蛛网膜下腔出血等病人的预后密切相关，对于既往有糖尿病的病人应激后血糖增高亦同样有危害。

mTOR通路对猪肠上皮细胞精氨酸代谢及转运的影响

mTOR 通路对猪肠上皮细胞精氨酸代谢及转运的影响肖昊，温晓鹿，蒋宗勇，王丽*（广东省农业科学院动物科学研究所，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，畜禽育种国家重点实验室，岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东广州510640）摘要：本试验旨在研究哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR ）通路对猪肠上皮细胞精氨酸（Arg ）代谢及转运通路的影响。

在含100或350μmol/L Arg 的培养基中添加（10nmol/L ）或不添加（0nmol/L ）雷帕霉素（Rapamycin,Rap ），培养猪肠上皮细胞（IPEC⁃J2细胞）2天后，对Arg 代谢通路、Arg⁃一氧化氮（NO ）、增殖转运通路蛋白表达进行检测。

结果表明：1）抑制mTOR 通路能够显著抑制精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ的蛋白表达量（P <0.05），显著抑制了精氨酸酶代谢途径；2）抑制mTOR 通路能显著抑制p⁃eNOS 的蛋白表达量（P <0.05），而增加Arg 浓度，与对照组相比显著提高p⁃eNOS 和eNOS 的蛋白表达量（P <0.05）；3）抑制mTOR 通路24小时后诱导性iNOS 的表达量上升；4）24小时下抑制mTOR 通路激活了磷酸化的cFos 表达量，抑制了PKCα、Erk 、Ric⁃tor 和CAT2的表达（P <0.05）。

综上所述，mTOR 被抑制后，猪肠上皮细胞中精氨酸的代谢和转运均被抑制，因而mTOR 信号通路在调控猪肠上皮细胞Arg 利用过程中发挥重要调控作用。

关键词：mTOR 信号通路；猪肠上皮细胞；精氨酸代谢；精氨酸转运中图分类号：S816.71文献标识码：A文章编码：1005⁃8567（2021）02⁃0001⁃05广东畜牧兽医科技2021年（第46卷）第2期科技前沿收稿日期：2021⁃03⁃30基金项目：国家生猪产业技术体系建设专项（CARS⁃35）；广东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目（2020KJ126）；科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）——优秀博士（R2017YJ⁃YB1004）及青年副研究员（R2018PY⁃QF001）作者简介：肖昊(1988⁃），女，博士，副研究员，研究方向：猪营养与饲料科学。

PARP-1抑制剂通过激活SIRT1-PGC-1α轴减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的炎症和氧化应激反应

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.12.014PARP-1抑制剂通过激活SIRT1-PGC-1α轴减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠的炎症和氧化应激反应侯亚儒舒新乐张霞李森雍文穆①（汉中市中心医院，汉中 723000）中图分类号R563.1　R364.5 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）12-2540-05［摘要］目的：通过构建慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠实验模型，探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（PARP-1）抑制剂是否通过调控沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）减轻COPD大鼠的炎症和氧化应激反应，探究SIRT1-PGC-1α轴作为PARP-1抑制剂作用新靶点的可能性。

方法：将48只SD大鼠随机选取12只作为健康组，剩余大鼠构建COPD实验模型，将造模成功的大鼠随机分为模型组、PARP-1抑制剂处理组、PARP-1抑制剂+ PGC-1α抑制剂组，HE染色观察肺组织病理形态变化，ELISA检测大鼠肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，荧光定量PCR法检测各组大鼠SIRT1、PGC-1α mRNA表达水平，Western blot检测SIRT1、PGC-1α蛋白表达。

结果：健康组大鼠肺组织结构完整，与健康组相比，模型组大鼠肺组织产生结构损伤，有大量炎症细胞浸润，肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著升高，血清中MDA含量显著升高，SOD含量显著降低，SIRT1、PGC-1α mRNA及蛋白表达量显著降低；与模型组相比，PARP-1抑制剂处理组大鼠肺组织结构恢复，炎症细胞减少，TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著降低，血清中MDA含量显著降低，SOD含量显著升高，SIRT1、PGC-1α mRNA及蛋白表达量显著升高；与PARP-1抑制剂处理组相比，PARP-1抑制剂+PGC-1α抑制剂组炎症细胞数量增加，TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著升高，血清中MDA含量显著升高，SOD含量显著降低，SIRT1、PGC-1α mRNA及蛋白表达显著降低。

【doc】PPARs信号通路与哺乳动物生殖

PPARs信号通路与哺乳动物生殖细胞生物学杂志ChineseJournalofCellBiology2005.27:1418http://www. PPARs信号通路与nSV#L动物生殖赵越超杨增明(东北农业大学生命科学学院,哈尔滨150030)摘要过氧化物酶体增殖因子活化受/e~(peroxisomeproliferator-activatedreceptors,PPARs1在动物体内有着广泛的生物学作用,可调节脂类代谢,能量收支平衡以及细胞分裂分化等重要生理过程.已经发现,PPARs信号通路与糖尿病和癌症等许多重大疾病的发生有关.随着基因剔除技术的应用以及PPARs人工配体的开发利用,.人们对PPARs的认识不断深入.现对PPARs通路在卵巢周期,黄体形成,胚胎着床,胎盘发育和雄性生殖等哺乳动物生殖系统中的表达,功能及作用机制进行综述.关键词过氧化物酶体增殖因子活化受体:卵巢;着床;胎盘;雄性生殖1PPA信号通路概述PPARs是细胞核激素受体超激素受体家族成员,定位于细胞核上,可由配体激活.在动物体内一般存在3种PPARs,即PPARct,PPAR[~(也称PPARS)和PPARy.PPARs与配体结合后可被激活,然后与目标基因结合,可在转录水平调节目标基因蛋白质产物的活性,进而参与调节脂类代谢,机体免疫,细胞分化及细胞凋亡等生理功能.3种PPARs同各自配体结合后可参与调节不同的生理过程:(1)PPAR0c参与脂肪酸代谢和炎症反应.(2) PPAR[~参与调节胚胎着床,细胞增殖和凋亡.(3) PPARy调节脂肪细胞分化,单核细胞分化及退出细胞周期等….从目前研究进展来看,PPARs在哺乳动物生殖过程中起重要作用.1990年首次克隆并筛选得到了PPARctcDNA, 1992年又获得了PPAR[~和PPARy的cDNA.3种PPARs间同源性很高,它们与甲状腺激素,类维生素A,维生素D,蜕皮激素等分子一样,都起源于细胞核受体超家族.PPARs同配体结合后,作用于过氧化物增殖因子反应元件(peroxisomeprolif- eratorresponseelements,PPREs),从而调节靶基因表达.在结构上,PPREs为同向重复的基因序列,根据3种PPARs对其DNA结合能力的不同,可将天然的PPREs分成3类:强应性的,一般应性的和弱应性的.PPARs可特异性地识别6核苷酸序列AGGTCA,还能与9位顺式视黄酸受体(9一cis—retinoicacidreceptor,RXR)形成二聚体,进而作用于靶基因.RXR是一个常见的DNA结合参与者,它可与包括PPARs在内的许多类固醇/甲状腺受体超家族的核受体协同作用.如果有配体和RXR作用,也可激活PPARs:RXR二聚体信号通路.现已确认,一些不饱和脂肪酸及其衍生物可作为3种PPARs的天然配体.例如,类花生酸类物质是一类主要源白花生四烯酸的脂肪酸,可在环氧合酶(cycloxygnase,cox)作用下生成各种前列腺素(prostaglandins,PGs).PGD2的衍生物15一脱氧一A12,14一前列腺素J2(15一deoxy—A12,14一prostaglandinJ2,15d—PGJ2)即是PPARy的配体.另外还有些人工合成药物也可与PPARs作用,例如花生四烯酸类似物ETY A可同3种PPARs结合;纤维类的低血脂药物(hypolipidemic drugs)n~激活PPARct,进而调节许多和脂肪酸代谢相关的基因;而PPARy可由thiazolidinedione类的低血糖药物激活,然后调节脂肪细胞分化【3】.PPARs的表达主要与线粒体及过氧化物酶体的氧化活性有关,而且3种PPARs在各种组织中经常协同表达.PPARct在肾脏,心脏,肌肉和肝脏等组织中高水平表达,PPAR[~在许多组织都有表达,而PPARy则主要存在于脂肪组织,单核细胞,巨噬细胞以及胎盘组织【4】.在卵巢,子宫和胎盘等雌性生殖系统中,可检测到PPARsmRNA和蛋白质,并且在睾丸等雄性生殖器官组织也可检测到PPARs表达,这提示PPARs在哺乳动物生殖过程中起重要的调节作用.收稿日期:2004.01.29接受日期:2004.08.25通讯作者.Tel:0451.55191416;Fax:0451.55103336;E.mail ****************赵越超等:PPARs信号通路与哺乳动物生殖l52PPARs和卵巢功能卵巢是一个周期性变化的器官,其周期可分为卵泡期,排卵期和黄体期.卵巢的主要功能是排卵和分泌类固醇激素.黄体是卵巢内一个暂时性的内分泌器官,所产生的孕酮是妊娠建立和维持所必需的.黄体的形成和功能涉及到脂类代谢,血管发生,甾类激素合成及前列腺素的产生等许多过程.假孕或发情周期的大鼠卵巢中,在发育卵泡的颗粒细胞内有高水平的PPARymRNA表达.PPARctmRNA在发情周期的大鼠黄体中高水平表达,并且在由上一发情周期来的黄体中表达量升高.PPARct mRNA主要定位于卵泡膜和卵巢基质,其水平在发情期较低.PPAR~mRNA在整个卵巢中都有分布,其水平在假孕或整个发情周期中均保持稳定15】. PPART能参与排卵及黄体生成.PPARct可能在卵泡膜和卵巢基质的脂类代谢过程中起作用.PPAR~可能参与调节维持卵巢的基本功能. PPARymRNA在注射PMSG后的卵巢中高水平表达,提示其在卵泡发育过程中起作用.在hCG处理(模拟LH脉冲)后,PPARymRNA水平降低,暗示PPART~颗粒细胞的黄体化过程可能起抑制作用【6】.在牛的黄体组织中发现PPARy的蛋白质水平在发情周期的黄体早期和中期有所下降.此外, PPART的类似物也能够影响体外培养的大鼠,猪和人颗粒黄体细胞孕酮的产生.在大鼠的发情周期中,LH峰后PPAR7mRNA水平降低.在黄体形成初期,PPAR7表达也很低,而孕酬在这一时期表达增强.随着黄体期的逐步进行,黄体开始退化,孕酮的表达也逐步降低,但PPAR7mRNA的表达却又升高,这些发现表明孕酮和PPARy的水平呈反比关系【5】.但用PPARy激动剂处理体外培养的处于周期中期的牛黄体细胞时,发现孕酬分泌增强,表明PPAR7可通过促进孕酮分泌来影响牛黄体细胞的功能,这很可能是种属差异或黄体分化时不同的细胞反应造成的.在人乳房的脂肪和由颗粒细胞向黄体细胞转变的组织中,芳香酶活性可因PPARy激活而受到抑制,提示PPARy可能也参与黄体组织中类固醇生成酶活性与表达的调节.在体外培养的猪和人的颗粒细胞中,PPAR7对孕酮合成有抑制作用,这可能是由于它能够降低3p.类固醇脱氢酶的活性16】. PPARY可能还与20.羟基类固醇脱氢酶(20一hydroxys—teroiddehydrogenase,20.HSD)的表达相关,该酶可将孕酮转化为非活性的20一二羟基孕酮(20一dihydroprogesterone).在大鼠和,J,鼠中,20一HSD在黄体退化时孕酮分泌降低过程中起重要作用[5t.另外,PPARs也能调节COX一2的表达,而且类花生物质又可激活PPARs,表明PPARs活性和前列腺素合成之间存在着反馈调节系统.前列腺素在黄体形成及退化过程中起重要作用,特别是前列腺素F20c(prostaglandinF2ct,PGF2ct)可通过调节孕酮分泌来诱导黄体退化,这表明PPARs还可能通过调节COX一2一PGs系统来影响黄体功能.PPARy在发育卵泡的颗粒细胞中的高度表达可能与卵泡雌激素的分泌相关.PPARs与雌激素反应元件结合后,可阻止雌激素反应元件和雌激素受体的结合,从而抑制雌激素活性【6】.PPARs还能调节芳香酶的活性和表达,而芳香酶参与调节雌激素的生物合成.此外,MEHP(monoethylhexylphthalate), PPARct和PPART的特异性配体在体外均能够降低雌激素的分泌和芳香酶mRNA的表达水平.MEHP可抑制芳香酶活性并激活PPARs(TJ.因此,MEHP可能通过PPARs介导的信号通路来抑制卵巢雌激素的分泌,从而导致排卵失败.PPARs也能够影响黄体形成中的血管发生和组织重塑等过程.PPARs可以调节一些蛋白水解酶的表达和活性,而这些酶类在许多种动物的卵巢组织中均有分布,说明PPARs可能通过调节它们的活性,来影响黄体的形成和退化等过程.体内及体外研究显示,PPART的激活可抑制血管发生.纤溶酶原激活因子可调节尿激酶型纤溶酶原的活性, PPART又可促进纤溶酶原激活因子mRNA的表达, 并可能进而抑制血管发生.而且,PPART还能下调血管内皮生长因子受体的表达【8】.另外,PPART 的激活可降低巨噬细胞和血管平滑肌细胞中一氧化氮的合成,还可抑制内皮细胞分泌内皮素一l.因此,除调节血管发生外,PPARs还可通过抑制内皮素一l和一氧化氮的合成来影响卵巢血管扩张.总之,3种PPARs在哺乳动物卵巢中都有表达分布,其中PPART可通过调节孕酮分泌,影响雌激素活性,COX.2.PGs系统以及一些血管相关因子等途径来参与排卵及黄体生成等过程.3PPARs和着床COX可将花生四烯酸转化为前列腺素H2 (prostaglandinH2,PGH2),而PGH2是各种前列腺素l6综述合成酶的共同底物.COX以两种亚型存在:COX一1和COX一2.COX一1缺失的雌性小鼠有生育能力, 但分娩时存在一定缺陷;COX一2缺失的雌鼠则表现出很多生殖功能上的障碍,如卵细胞成熟,排卵,着床及蜕膜化的失败.核膜与内质网膜均可表达COX一1和COX.2.内质网合成的PGs可出入细胞, 并通过G蛋白相联的细胞表面受体来行使功能.相反,由细胞核COX合成的PGs能与PPARs结合,从而直接在细胞核内发挥效应.在子宫着床位点处特异性表达COX一2,但检测不到COX一1,并且COX一2基因剔除小鼠不能正常着床和蜕膜化,说明COX一2来源的PGs参与早期妊娠的建立.在检测小鼠早期妊娠子宫的各种前列腺素含量时发现,PGI2的水平最高,而且它在子宫着床位点的水平要明显高于非着床位点,推测COX一2来源的PGI2可能在胚泡着床和蜕膜化过程中起重要作用[io1.与其他前列腺素一样,PGI2可与细胞膜表面G蛋白偶联的PGI2受体(IP)结合.IP激活后可通过刺激腺苷酸环化酶来促使细胞内cAMP水平升高.血管内皮及其下面的平滑肌等血管组织能够通过前列环素合成酶(PGIS)来合成PGI2.通过PGI—IP信号通路,PGI2可作为血管扩张因子和抗血凝剂,作用于血管组织和血小板,而且用PGI2类似物可模拟这些效应.PGI2也可与PPAR~结合来调节特定的细胞功能f】11.COX一2,PGIS,PPAR~和RxR在着床胚泡周围的基质细胞中协同表达,提示这些蛋白质之间可能存在一个信号级联系统在着床过程中起作用.COX一2和PGI2在基质细胞核_J的表达位点相近,表明两者在合成位点处可直接通过与PPAR[I结合来起作用.已知的IL1),PPAR~和PPAR(t 等PGI2受体中,在黏附反应起始阶段以及蜕膜化过程中的子宫中只有PPAR~表达,表明PPAR~与着床关系密切【101.用cPGI(carbarprostacyclin)或L一165,041等PPAR~的特异性配体处理,可恢复cOx一2缺失小鼠中的着床缺陷.尽管这些配体在结构上没有同源性,但它们在调节PPAR~转录方面的活性却相似,而且视黄酸(9一cis—retinoicacid,9-cis—RA)还可显着上调这种活性.PPAR~和RXR配体协同,可上调PPAR~的转录活性.已证实,用L一165,041和9一cis—RA共同处理,可提高COX2一,-小鼠的着床率[1o】.在蜕膜细胞核中,PPAR~/RXR异二聚化的增强或稳定可进一步提高其对PPAR~I配体的反应性,进而促进SRC一1等转录激活因子的募集.由于SRC一1缺失小鼠的着床率降低,SRC一1可能参与子宫蜕膜反应.通过检测一系列血管生成前标记物表达发现,cPGI或PPAR~激动剂能够弥补COX一2缺失小鼠的着床缺陷,同时着床位点的血管生成也得到恢复,但IP或PPAR~都有可能参与PGI2在血管系统中的这种效应.我们的结果也表明,在大鼠子宫着床位点处的腔上皮下基质中可检测到高水平的PPAR[~mRNA和蛋白质,而且在这些部位也可检测到RXR(t蛋白质表达.PPARB表达是由活性胚泡刺激的,因为在假孕第6天大鼠子宫中未检测到其表达信号D21.这些结果和在小鼠早期妊娠过程中发现的类似,表明PPARBxR二聚体在大鼠着床过程中也起重要作用.在着床位点处,许多哺乳动物的子宫腔上皮细胞发生细胞凋亡.由于PPAR~与细胞内源性配体PGI2结合后可以诱导细胞凋亡,推测PPAR~可能还与着床过程中的细胞凋亡相关.尽管已有许多文献报道PPAR~在胚胎发育和着床中起广泛作用,但它的特异性受体是否为PGI2或其他内源性的配体,还需要进一步确定.因为PPAR~可结合多种配体,体内或体外PPAR~的激活并非只涉及到PGI2.在PPARs配体结合域存在一个大腔,PPARs还可被亚油酸和花生四烯酸等多聚不饱和脂肪酸以及一些人工合成药物激活.因此,在胚泡着床过程中,很可能还涉及到其他和PPARs相关的作用因子和信号通路.总之,应用基因剔除以及人工配体,激动剂处理等技术方法发现在哺乳动物着床过程中, PPAR~与RXR形成二聚体,通过细胞核上的cOx. 2一PGI2通路来参与着床过程.4PPA和胎盘发育胎盘由胎儿和母体共同构成,是两者进行物质交换,营养,代谢,激素分泌,防止异源物质入侵以保证胎儿正常发育的一个重要器官.胎盘形成是一个复杂的组织重构过程,包括滋养层侵入,蜕膜反应,细胞外基质(ECM)降解及血管形成等过程.在人的胚胎中,合体滋养层具有多个细胞核,最终分化为覆盖在胎盘绒毛外表面的细胞团,因此直接和母体血液接触.细胞滋养层分化为合胞体滋养层这一过程,对于胎盘功能甚至胎儿发育是极为重要的.赵越超等:PPARs信号通路与哺乳动物生殖l7 PPAR丫在前脂肪细胞(preadipocytes),成肌细胞以及单核细胞等细胞的分化过程中都起作用,也参与乳癌和脂肪肉瘤细胞等细胞的最终分化过程[41. PPARy缺失的小鼠表现出胎盘发育和滋养层分化异常,在胎盘中还出现异常的血管发生现象.这些发育缺陷可导致胚胎在第l0天死亡[131.在人细胞滋养层和合体滋养层中均有PPARy表达.当滋养层细胞在H/W培养基(该培养基已知可抑制滋养层分化)中培养时,PPART的表达减弱.这些研究结果提示PPARy在母体胎盘的滋养层分化过程中起重要作用.在RXR~x或P.XRI3基因剔除的小鼠中,胎体不能形成具有正常功能的尿囊绒膜胎盘,母体.胎儿问的物质交换因而受阻,最终导致流产[131.PPARy缺失的胎儿也因滋养层分化和血管发生异常导致胎盘发育不全.这些发现提示,PPARy/RXR异二聚体对小鼠着床和正常胎盘形成是必需的.近来发现,RXR或PPARy的激活可刺激人绒毛滋养层的分化和内分泌功能.另外,在人妊娠前3个月的胎盘中,PPARy和RXRt~在位于整个锚定绒毛上的绒毛外滋养层细胞核中协同表达.人等哺乳动物的滋养层和蜕膜细胞能够合成反式视黄酸(all—trans—retinoic acid)和其9一顺式同工分子,两者均为RXR的天然配体【14】.人的子宫内膜和蜕膜也表达COX和PGs【l5】, 这些分子很可能成为PPARy的配体.胎盘组织中也表达各种PGS和脂类物质【1引.这些结果表明,PPARy/RXRtx二聚体可作为控制人细胞滋养层分化和侵入的转录水平调控因子.PPARy和RXRt~在蜕膜区的绒毛外滋养层中虽然协同表达,但PPARy和RXRt~不同,它只在绒毛外滋养层中特异性表达,而在蜕膜细胞中则无表达.这表明PPARy作为细胞核受体,可能在绒毛外滋养层的侵入过程中也起重要作用[141.PPARy还可调节基质金属蛋白酶等炎症因子基因的表达,并调节正常或肿瘤细胞的迁移性和侵入性.然而, PPART/RXRt~异二聚体是否能在细胞滋养层侵入过程中调控蛋白水解酶的表达还需要进一步研究. PPARy有许多种天然和人工合成的配体.在一种细胞中,同一受体和不同的配体结合可能产生完全不同的生理效应.PPARy的两种配体曲格列酮(troglitazone)和15d—PGJ2对人滋养层细胞的分化产生截然相反的效应,前者可促进分化,而后者则能抑制分化并促进凋亡.由于曲格列酮可诱导人滋养层细胞的分化,而且PPART基因缺失小鼠的滋养层分化异常,提示在体内可能存在一个内源性的和曲格列酮类似的配体,在滋养层分化过程中起作用I4】. 曲格列酮和15d—PGJ2在滋养层中所起的作用不同, 可能是由于配体和受体蛋白在空问布局上发生了变化,导致在与特定的协同调节子作用时,一种协同调节因子可刺激目标基因表达,而另一种则抑制目标基因的表达.在人分娩期间,羊膜,绒毛蜕膜(choriodecidua)和胎盘中的PPARymRNA水平并未改变;PPARtx mRNA在羊膜中的表达也没有显着改变;而PPAR[3 的表达却显着提高.在绒毛蜕膜中,PPARtx表达在分娩期下降,而PPAR~I水平却升高.在胎盘中, PPARtx和PPAR~的表达都升高[161.这表明PPARs 在维持妊娠或启动分娩过程中起作用.总之,在胎盘组织中,PPARy可能通过体内某种配体激活形成PPART/RXR二聚体,进而调节细胞滋养层分化及侵入等过程.5PPA和雄性生殖过氧化物酶体增殖因子(peroxisomeproliferators, PPs)是一大类工业和药用物质,现已成为普遍存在的污染物质,可激活小鼠和大鼠体内许多种过氧化物酶体.睾丸中Leydig细胞功能和睾酮合成的异常可导致雄激素依赖的雄性生殖系统组织发育缺陷, 并直接影响成年个体的睾丸功能,包括精子发生和生育能力.最近发现,一些PPs对雄激素表现出抗性效应N7].一般认为,类固醇生成是由促激素(trophic hormone)调节的,这些激素可促进胆固醇从贮藏或合成位点向线粒体内膜运输.PPs可阻止由促激素诱导的这一运输作用,并进而影响雄性生殖系统. PPs可以激活外周受体苯并二氮卓(peripheral—type benzodiazepinereceptor,PBR)的基因转录.PBR基因编码一个对线粒体胆固醇具有高亲和性的蛋白质,该蛋白质参与调节胆固醇跨膜运输.研究发现,PPs诱导的PBR基因转录是由PPARtx介导的. PPARtx缺失小鼠的循环系统中,睾酮的水平明显要比野生型低,这表明PPARt~对于正常的雄性类固醇激素的合成是必需的】.PPARy在雄性生殖过程中也起一定作用.用DBP(di—n—butylphthalate)处理睾丸组织后,纤溶酶原激活因子的抑制因子一I(PAI.1)mRNA的水平显着提高,可作为PPARy激活的标志,而PAI—l水平的提高可能和精子发生的破坏有关,从而提示18综述.PPAR丫可能参与调节精子发生[191.在非生殖系统组织中,PPARy在多种癌变细胞中表达,而且其配体可通过细胞凋亡来抑制这些癌细胞的生长.在正常的和癌变的睾丸组织中,均可检测到高水平的,有免疫活性的PPAR~和PPAR~蛋白,但PPARy只在癌变的睾丸组织中显着表达.并且,人工合成的PPARy配体(thiazolidinedione)和内源性的配体(15一deoxy.delta-prostaglandinJ2)均可抑制睾丸癌细胞的生长【20】.在睾丸癌细胞中PPARy表达的上调表明, PPARy配体可能对睾丸癌细胞有抗增殖作用.因此,在睾丸癌症治疗领域,PPAR7已成为新的研尽管上述研究表明PPARs参与雄性激素合成以及睾丸癌变等过程,但目前还很少有直接证据表明PPARs和雄性生殖作用紧密相关.6小结从目前积累的研究结果来看,PPARs广泛参与哺乳动物许多生殖过程.虽然已证实PPARI~在小鼠胚胎着床过程起关键作用,但是将PPAR~基因剔除后,小鼠的生殖过程却未见异常【z”.随着RNA干涉技术的逐步完善和发展,将有利于进一步研究PPARs信号通路在生殖过程中的作用机制.[1】[2】[3】[4】[5】【61[7】【81[9】[10】【l11[13】【14】[15】161718192O21参考文献(References)HihiAKeta1.CellMolLifeSc-.2002.59:790 DesvergneBeta1.EndocrRev.1999.20:649 KerstenSeta1.ExS.2000.89:141SchaiffWTeta1.JClinEndocrinolMetab,20oo.85:3874 KomarCMet口,Reprod.2002.66:l531KomarCMeta1.Endocrinology,2001.142:4831 Lovekamp—SwanTeta1.Em,ironHealthPerspect,2003,111: 139XinXr口,..,BiolCheml999.274:9ll6NegishiMeta1.BiochimBiophysActa,1995,1259:109 LimHeta1.GenesDev.1999.13:1561LinlHeta1.Endocrinology,2002,143:3207DingNZeta1.Reproduction,2003,125:817WendlingOeta1.ProcNatlAcadSciU,1999,96:547TarradeAeta1.JClinEndocrnolMetab.2ool,86:5017ShawKJ口ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids,l99l4.50:239BerryEBeta1.MolPharmaco1.2003,64:l586MooreRWeta1.EnvironealthPerspect.2oo1.109:229GazouliMet口L￡ndocrinology.2002.143:2571KobayashiTeta1.ToxicolLett,2003,138:215HaseTeta1.Urology,2002.60:542PetersJM￡fa1.MolCellBio1.2000.20:5l19 PPARsSignalingPathwayinMammalianReproductionY ue—ChaoZhao.Zeng—MingY ang (CollegeofLifeSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030 ,China)Peroxisomeproliferator-activatedreceptors(PPARs)playimportantrolesin manybiologicalprocesses.includingmediationoflipidmetabolism,energybalance,celldiffe rentiationanddivision.Ithasbeen confirmedthatPPARssignalingpathwayisalsorelatedtosomepathologicalp rocesses,suchasdiabetesandcancer.TheunderstandingonPPARshasimprovedastheapplicationofgenek nockouttechnologyandtheartificialligands.ThisarticlereviewsPPARsexpression,functionandmechanisminm ammalianreproductivesystemduring theprocessesofovariancycle,lutealformation,embryoimplantation,placen tationandmalereproduction. Keywordsperoxisomeproliferator—activatedreceptors;ovary;implantati on;placenta;malereproductionReceived:January29.2004Accepted:August25,2004*Correspondingauthor.Tel:86—451—55191416.Fax:86—45l-55103336 ,E—mail:****************.edu-ca。

事业单位登记管理须知下册

事业单位登记管理须知下册研究生院（部）●宗旨：培养研究生以上学历人才，促进科技文化发展。

●业务范围：<哲学类/理学类/管理学类┄┄>学科<硕士研究生/博士研究生>学历教育学位管理博士后培养相关<科学研究/学术交流/专业培训>本科综合院校●宗旨：培养高等学历人才，促进科技文化发展。

●业务范围：<哲学类/理学类/管理学类……>学科<大专/本科/研究生班/硕士研究生/博士研究生>学历教育博士后培养相关<科学研究/继续教育/专业培训/学术交流>（相关社会服务）本科理工院校●宗旨：培养高等学历理工人才，促进科技发展。

●业务范围：<理学/工学/机械……>学科<大专/本科/研究生班/硕士研究生/博士研究生>学历教育博士后培养相关<科学研究/继续教育/专业培训/学术交流>（相关社会服务）本科农业院校●宗旨：培养高等学历农业人才，促进农业发展。

●业务范围：<植物生产/动物生产/农业经济管理学……>学科<大专/本科/研究生班/硕士研究生/博士研究生>学历教育博士后培养相关<科学研究/继续教育/专业培训/学术交流>（相关社会服务）本科林业院校●宗旨：培养高等学历林业人才，促进林业发展。

●业务范围：<森林资源/环境生态/林业工程……>学科<大专/本科/研究生班/硕士研究生/博士研究生>学历教育博士后培养相关<科学研究/继续教育/专业培训/学术交流>（相关社会服务）本科医药院校●宗旨：培养高等学历医药人才，促进医药事业发展。

●业务范围：<基础医学/护理学/医药学……>学科<大专/本科/研究生班/硕士研究生/博士研究生>学历教育博士后培养相关<科学研究/继续教育/专业培训/学术交流>（相关社会服务）本科师范院校●宗旨：培养高等学历师资人才，促进教育事业发展。

脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染宿主细胞中作用研究进展

中国畜牧兽医 2024,51(4):1686-1695C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 脂质代谢和糖代谢在P R R S V 感染宿主细胞中作用研究进展罗琴1,2,刘宝玲1,乔常宏1,2,陈翔宇1,2,刘丁语1,王晓虎1,王刚1,刘昊2,蔡汝健1(1.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站,广州510640;2.佛山科学技术学院生命科学与工程学院,佛山528225)摘要:猪繁殖与呼吸综合征病毒(P o r c i n e r e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r y s y n d r o m ev i r u s ,P R R S V )感染可引起母猪繁殖障碍㊁仔猪呼吸道疾病及公猪精液质量下降,给世界养猪业造成了巨大的经济损失㊂P R R S V 不能自主复制,其生命周期的各个阶段均依赖于宿主的代谢系统㊂宿主细胞也可调节其代谢过程,以防止P R R S V 复制和维持其正常生理功能㊂脂质代谢和糖代谢在P R R S V 感染中均扮演了重要角色,P R R S V 作为一种囊膜病毒对脂质代谢系统的依赖性较其他代谢系统更强㊂脂质参与了P R R S V 生命周期的各个阶段,包括吸附㊁进入㊁复制㊁组装和释放,此外还与细胞炎症㊁免疫和凋亡有关㊂糖代谢也可干扰P R R S V 的生命活动,从而促进或抑制P R R S V 复制㊂文章综述了脂质代谢中脂肪酸㊁胆固醇㊁磷脂㊁脂滴和脂筏以及糖代谢中糖酵解和三羧酸循环在P R R S V 感染宿主细胞中的作用,以期为阐明P R R S V 的致病机制以及疫苗和抗P R R S V 药物的研发提供基本理论依据㊂关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V );宿主细胞;脂质代谢;糖代谢中图分类号:S 852.65+9.6文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.04.036 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-10-16基金项目:广东省省级科技计划项目(2023B 020*******);广州市农村科技特派员项目(20212100015);2021年英德市科技计划项目;云浮市云安区生猪产业园科技支撑和技术示范(动卫合经2022k 06-005);生猪智能化动物疫病防疫与诊疗系统(动卫合经2022k 11-006)联系方式:罗琴,E -m a i l :l u o q i n 121104@163.c o m ㊂通信作者刘昊,E -m a i l :l i u h a o _l h @h o t m a i l .c o m ;蔡汝健,E -m a i l :466866569@q q.c o m R e s e a r c hP r o g r e s s o n t h eR o l e o fL i p i dM e t a b o l i s ma n d G l u c o s eM e t a b o l i s mi nP R R S V -i n f e c t e dH o s t C e l l sL U O Q i n 1,2,L I U B a o l i n g 1,Q I A OC h a n g h o n g 1,2,C H E N X i a n g y u 1,2,L I U D i n g yu 1,WA N G X i a o h u 1,WA N G G a n g 1,L I U H a o 2,C A IR u ji a n 1(1.S c i e n t i f i c O b s e r v a t i o na n dE x p e r i m e n t a lS t a t i o no f V e t e r i n a r y D r u g s a n dD i a g n o s t i c T e c h n i q u e s o f G u a n g d o n g P r o v i n c e o f M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,K e yL a b o r a t o r y o f L i v e s t o c ka n dP o u l t r y D i s e a s eP r e v e n t i o no f G u a n g d o n g Pr o v i n c e ,I n s t i t u t e o f A n i m a lH e a l t h ,G u a n g d o n g A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a lS c i e n c e s ,G u a n gz h o u 510640,C h i n a ;2.S c h o o l o f L i f eS c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g ,F o s h a nU n i v e r s i t y ,F o s h a n 528225,C h i n a )A b s t r a c t :P o r c i n e r e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r y s yn d r o m ev i r u s (P R R S V )i n f e c t i o ni sk n o w nt o c a u s e r e p r o d u c t i v ed i s o r d e r s i ns o w s ,r e s p i r a t o r y d i s e a s e i n p i g l e t s ,a n dr e d u c es e m e n q u a l i t y in b o a r s ,r e s u l t i n g i ns i g n i f i c a n te c o n o m i cl o s s e st ot h e g l o b a l p i g i n d u s t r y.P R R S Vi su n a b l et o r e p l i c a t e o n i t s o w na n dr e l i e so nt h eh o s tm e t a b o l i c s y s t e mf o r a l l s t a g e so f i t s l i f ec yc l e .H o s t c e l l s ,i n t u r n ,r e g u l a t e t h e i rm e t a b o l i c p r o c e s s e s t oh i nde rP R R S Vr e pl i c a t i o na n d m a i n t a i nt h e i r4期罗琴等:脂质代谢和糖代谢在P R R S V感染宿主细胞中作用研究进展n o r m a l p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s.B o t h l i p i dm e t a b o l i s ma n d g l u c o s em e t a b o l i s m p l a y c r u c i a l r o l e s i n P R R S Vi n f e c t i o n.A sa n e n v e l o p e d v i r u s,P R R S V i s p a r t i c u l a r l y r e l i a n to nl i p i d m e t a b o l i s m s y s t e m s.L i p i d sa r ei n v o l v e di nv a r i o u ss t a g e so ft h eP R R S Vl i f ec y c l e,i n c l u d i n g a d s o r p t i o n, e n t r y,r e p l i c a t i o n,a s s e m b l y a n d r e l e a s e,i t i s a l s oa s s o c i a t e dw i t hc e l l u l a r i n f l a m m a t i o n,i m m u n i t y a n d a p o p t o s i s.G l u c o s e m e t a b o l i s m c a n a l s o i n t e r f e r e w i t h P R R S V l i f e a c t i v i t i e s,t h e r e b y p r o m o t i n g o r i n h i b i t i n g P R R S Vr e p l i c a t i o n.T h er o l e so f f a t t y a c i d s,c h o l e s t e r o l,p h o s p h o l i p i d s, l i p i dd r o p l e t sa n dl i p i dr a f t si nl i p i d m e t a b o l i s m a r er e v i e w e d,a l o n g w i t ht h ei n v o l v e m e n to f g l y c o l y s i s a n d t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e i n g l u c o s em e t a b o l i s mi nP R R S V-i n f e c t e dh o s t c e l l s,s o t o p r o v i d e a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r e l u c i d a t i n g t h e p a t h o g e n i cm e c h a n i s mo fP R R S Va n dc o n t r i b u t e t o t h e d e v e l o p m e n t o f v a c c i n e s a n d a n t i-P R R S Vd r u g s.K e y w o r d s:P o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r y s y n d r o m ev i r u s(P R R S V);h o s tc e l l s;l i p i d m e t a b o l i s m;g l u c o s em e t a b o l i s m猪繁殖与呼吸综合征(p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e,P R R S)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(P o r c i n er e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s,P R R S V)引起猪的一种高度传染性疾病㊂P R R S V主要导致妊娠母猪流产㊁产死胎㊁木乃伊胎,仔猪严重呼吸道疾病及公猪精液质量下降[1-2]㊂P R R S于1987年在美国首次报道,随后在北美和欧洲流行并逐渐蔓延至亚洲[3]㊂中国于1996年首次发现P R R S,此后全国各地均有该病报道[4]㊂2006年,高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(H i g h l y p a t h o g e n i c p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m ev i r u s,H P-P R R S V)在中国暴发,导致感染猪的病变更严重,死亡率更高[5]㊂P R R S对世界养猪业造成了巨大的经济损失,然而目前一直没有针对P R R S V的有效药物,商业疫苗提供的保护也有限,不断重组与变异的P R R S V使得P R R S防控形势更加严峻㊂因此,对P R R S V感染机制及防治方法的研究仍是世界范围内一项极为紧迫的任务㊂病毒作为细胞寄生物,不能自主复制,依赖宿主代谢提供能量和各类代谢产物完成复制等生命活动㊂脂质广泛分布于生物体中,不仅是细胞的重要组成成分,而且还参与了许多重要生理活动㊂作为细胞内寄生的病毒,脂质及其代谢在病毒生命周期中扮演着十分重要的角色㊂脂质几乎参与了甲型流感病毒(I n f l u e n z aAv i r u s,I A V)生命周期的所有阶段,包括I A V与宿主细胞的初始相互作用㊁膜融合㊁核的输入和输出以及协调病毒颗粒的组装和出芽[6]㊂病毒感染宿主细胞之后,脂质代谢也会发生相应的改变,如巨细胞病毒(C y t o m e g a l o v i r u s, C MV)感染细胞后脂质代谢中脂肪酸代谢的生物合成增加;反之,抑制脂肪酸的生物合成也可抑制C MV感染[7-8]㊂脂质代谢的改变在病毒感染中也发挥了重要作用,如在登革热病毒(D e n g u ev i r u s, D E N V)㊁寨卡病毒(Z i k av i r u s,Z I K V)㊁黄热病病毒(Y e l l o w f e v e rv i r u s,Y F V)和西尼罗病毒(W e s t N i l e v i r u s,WN V)感染期间,宿主胆固醇水平的调节促进了病毒的进入㊁复制复合物的形成㊁组装㊁释放及对Ⅰ型干扰素(i n t e r f e r o n-Ⅰ,I F N-Ⅰ)反应的控制[9]㊂同样,P R R S V作为一种囊膜病毒,其生命周期各阶段均与脂质代谢相关(图1),脂质代谢在P R R S V感染中也起着调控作用㊂病毒除了引起宿主细胞脂质代谢变化外,还可特异性干扰糖代谢途径㊂病毒可操纵宿主细胞内的糖代谢水平,从而为细胞生化反应提供能量,如Z I K V感染可增加三羧酸循环中的葡萄糖使用量,重编程宿主细胞中的葡萄糖代谢[10]㊂新型冠状病毒(S e v e r ea c u t er e s p i r a t o r y s y n d r o m ec o r o n a v i r u s 2,S A R S-C o V-2)在宿主细胞中的复制依赖于葡萄糖代谢的改变[11]㊂糖代谢在肠道病毒(E n t e r o v i r u s 71,E V71)复制中起着正向作用,抑制葡萄糖代谢E V71的复制也会受到抑制[12]㊂目前有关糖代谢在P R R S V感染中的研究还相对较少,大多针对P R R S V复制具有重要作用㊂作者就脂质代谢中脂肪酸㊁胆固醇㊁磷脂㊁脂滴和脂筏以及糖代谢中糖酵解和三羧酸循环在P R R S V感染宿主细胞中的作用进行综述,以阐明P R R S V的致病机制,对疫苗和药物研发具有重要意义㊂7861中国畜牧兽医51卷F A ,脂肪酸(黄色);C h o l ,胆固醇(绿色);P L ,磷脂(浅紫);L D ,脂滴(棕色)F A ,F a t t y a c i d (y e l l o w );C h o l ,C h o l e s t e r o l (g r e e n );P L ,P h o s p h o l i p i d (l a v e n d e r );L D ,L i p i dd r o p l e t s (b r o w n )图1 脂质代谢在P R R S V 感染中的作用F i g .1 T h e r o l e o f l i pi dm e t a b o l i s mi nP R R S Vi n f e c t i o n 1 脂质代谢在P R R S V 感染中的作用1.1 脂肪酸在P R R S V 感染中的作用脂肪酸在多种病毒感染中都起到了重要作用㊂研究表明,干扰脂肪酸生物合成途径的药物对多种囊膜病毒具有抗病毒作用,包括人类巨细胞病毒(H u m a n c y t o m e g a l o v i r u s ,H C MV )[13]㊁乙型肝炎病毒(H e pa t i t i s B v i r u s ,H B V )[14]㊁丙型肝炎病毒(H e p a t i t i sCv i r u s ,H C V )[15]㊁人类免疫缺陷病毒(H u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y vi r u s ,H I V )[16]和裂谷热病毒(R i f tV a l l e y f e v e r v i r u s ,R V F V )[17]等,证实了脂肪酸在囊膜病毒复制中的重要性㊂脂肪酸参与了P R R S V 的复制㊁组装和释放,并且与炎症和免疫反应有关㊂研究表明,G P 5和M 蛋白的棕榈酰化是病毒组装和出芽所必需的,脂肪酸能影响G P 5和M 蛋白的棕榈酰化,从而影响P R R S V 的组装与释放,表明脂肪酸对于P R R S V 的增殖至关重要[18]㊂5'-磷酸腺苷酸活化的蛋白激酶(5'-a d e n o s i n e m o n o p h o s ph a t e -a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ,AM P K )是一个调控能量代谢的关键分子,能够抑制脂肪酸合成限速酶乙酰辅酶A 羧化酶(a c e t y l -C o Ac a r b o x y l a s e1,A C C 1)的活性,从而抑制细胞内脂肪酸的合成代谢[19]㊂L o n g 等[20]研究证实,在P R R S V 感染过程中病毒通过AM P K 使A C C 1活性降低,从而抑制脂肪酸合成,且脂肪酸合成抑制剂C 75能够显著抑制P R R S V 增殖㊂熊玉剑[21]研究表明,P R R S V 及P R R S V N S P 4均能通过过氧化物氧化还原蛋白5(pe r o x i r e d o x i n 5,P R D X 5)调控AM P K -A C C 1信号通路,进而抑制脂肪酸合成,P R D X 5抑制P R R S V 增殖,并主要抑制P R R S V 的释放㊂此外,有研究发现中链脂肪酸(m e d i u m -c h a i n f a t t y ac id s ,M C F A s )能够抑制P R R S V 感染㊂Y a n g 等[22]检测了4种M C F A s 的细胞毒性及其对P R R S V 的抑制率,结果显示,在4种M C F A s 中,辛酸单甘酯(c a p r yl i c m o n o g l yc e r ide ,C MG )对细胞的毒性最小,而对P R R S V 的抑制率最高㊂经C MG 治疗后仔猪促炎细胞因子(白细胞介素6(i n t e r l e u k i n ,I L -6)㊁I L -8㊁I L -1β㊁I F N -γ㊁肿瘤坏死因子-α(t u m o r n e c r o s i s f a c t o r -α,T N F -α))水平显著下调,抗炎细胞因子(I L -10)水平显著上调㊂蓝俊虹[23]研究发现,α-单月88614期罗琴等:脂质代谢和糖代谢在P R R S V感染宿主细胞中作用研究进展桂酸甘油酯(α-g l y c e r o lm o n o l a u r a t e,α-GM L)具有显著抑制P R R S V的作用,作用机制主要是降低P R R S V的活力,减少P R R S V G P5与M蛋白及细胞受体C D163的表达,同时抑制N F-κB通路,并减少T N F-α的分泌㊂前列腺素E2(p r o s t a g l a n d i nE2,P G E2)来源于花生四烯酸,通过激活限速酶环氧化酶1/2型(c y c l o o x y g e n a s e t y p e1/2,C O X-1/2)在发热中起重要作用㊂H P-P R R S V可通过E R K1/2-p-C/E B P-β信号通路诱导C O X-1的表达,导致P G E2的增加[24]㊂H P-P R R S V N S P2还能够通过激活M E K1-E R K1/2-C/E B P-β信号通路诱导C O X-2上调,从而增加小胶质细胞中P G E2的产生[25]㊂1.2胆固醇在P R R S V感染中的作用胆固醇是真核细胞生物膜中的一种丰富的脂质,对需要生物膜来建立感染的病毒增殖中起着重要作用㊂S u n等[26]研究表明,用甲基-β-环糊精(m e t h y l-β-c y c l o d e x t r i n,MβC D)(一种用于去除细胞膜胆固醇的药物)预处理非洲绿猴肾上皮细胞(M a r c-145)可显著抑制P R R S V感染,并呈剂量依赖性,而补充外源性胆固醇后可部分恢复P R R S V 的感染性,表明P R R S V感染能力的下降是细胞膜胆固醇的去除而导致的;进一步研究发现,细胞膜胆固醇的减少显著抑制了病毒的进入,尤其是病毒的吸附和释放㊂H u a n g等[27]研究也证实了细胞膜胆固醇对P R R S V的进入至关重要,表明细胞膜中的胆固醇是P R R S V感染的关键成分㊂胆固醇-25-羟化酶(c h o l e s t e r o l-25-h y d r o x y l a s e, C H25H)是一种重要的干扰素刺激基因(i n t e r f e r o n-s t i m u l a t e d g e n e,I S G)编码的多面体膜蛋白,可以催化胆固醇氧化生成25-羟基胆固醇(25-h y d r o x y c h o l e s t e r o l,25H C)[28]㊂C H25H和25H C 在调节胆固醇代谢㊁炎症㊁免疫和抗病毒感染中发挥了重要作用[29]㊂研究发现,P R R S V N S P1β和N S P11在H E K293F T中通过溶酶体途径介导C H25H的降解,但在M a r c-145细胞中N S P1β和N S P11可以颉颃C H25H的抗P R R S V活性[28];C H25H通过阻止病毒进入而显著抑制P R R S V感染,表现出降低催化活性的C H25H具有针对P R R S V的抗病毒作用[30]㊂在另一项研究中, P R R S V E蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解猪C H25H(p o r c i n e C H25H,p C H25H),敲低p C H25H能降低E蛋白诱导的炎症细胞因子表达,而过表达p C H25H则具有相反的效果,表明p C H25H的表达与E蛋白诱导的炎症反应相关[31]㊂25H C在体外具有抗P R R S V感染的作用,能削弱P R R S V的吸附和进入,但不影响病毒基因组的合成和病毒体的释放[32]㊂S o n g等[30]证明了25H C可以在相对较低的剂量下显著抑制P R R S V感染猪肺泡巨噬细胞(p o r c i n e a l v e o l a rm a c r o p h a g e s,P AM s)和M a r c-145细胞,且25H C可以抑制P R R S V的复制并促进P AM s中I L-1β和I L-8的产生[33]㊂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶还原酶(3-h y d r o x y-3-m e t h y l g l u t a r y l-c o e n z y m eAr e d u c t a s e,HMG C R)是参与胆固醇合成的限速酶,HMG C R磷酸化水平下调是其激活形式㊂HMG C R的活性受AM P K和蛋白磷酸酶2(p r o t e i n p h o s p h a t a s e2,P P2A)2种激酶的调控,活化的P P2A激活HMG C R,而活化的AM P K抑制HMG C R的活性[19]㊂许多病毒可以通过HMG C R调节胆固醇合成,如H B V[34]㊁H C V[35]㊁H C MV[36]㊁D E N V[37]及卡波西肉瘤相关疱疹病毒(K a p o s i s s a r c o m a-a s s o c i a t e d h e r p e s v i r u s, K S H V)[38]等㊂最近研究表明,P R R S V感染通过降低P P2A磷酸化水平以激活HMG C R,导致细胞胆固醇增加,而N S P4在这一过程中发挥了重要作用㊂此外,P R R S V N S P4还可通过调节细胞胆固醇代谢抑制I F N-Ⅰ的产生[39]㊂研究表明,膜蛋白-前蛋白转化酶枯草溶菌素9(p r o p r o t e i n c o n v e r t a s e s u b t i l i s i nk e x i n9,P C S K9)在胆固醇运输过程中具有重要作用,P C S K9可与胆固醇代谢相关的受体L D L R互作,并能抑制P R R S V复制[40-41]㊂综上,胆固醇对于P R R S V的吸附㊁进入㊁复制和释放等阶段至关重要㊂此外,胆固醇还参与了炎症反应以及对I F N-Ⅰ的调控㊂1.3磷脂在P R R S V感染中的作用磷脂主要包括甘油磷脂(g l y c e r o l p h o s p h o l i p i d,G P)和鞘磷脂(s p h i n g o m y e l i n,S M)㊂G P可分为磷脂酰甘油(p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l,P G)㊁磷脂酰丝氨酸(p h o s p h a t i d y l s e r i n e,P S)㊁磷脂酰肌醇(p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l,P I)㊁磷脂酰胆碱(p h o s p h a t i d y l c h o l i n e,P C)㊁磷脂酰乙醇胺(p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e,P E)和心磷脂(c a r d i o l i p i n,C L)㊂研究表明,多种病毒感染都可引起磷脂的代谢变化,如I A V感染引起P S㊁P I和S M 的代谢变化,在I A V感染中发挥了重要作用[6]㊂猪伪狂犬病病毒(P s e u d o r a b i e sv i r u s,P R V)感染猪肺泡巨噬细胞系(i P AM)可引起P E㊁P S㊁P C㊁P G㊁P I 及神经酰胺(c e r a m i d e,C e r)的代谢变化[42]㊂D E N V9861中国畜牧兽医51卷可以通过重塑循环重新配置磷脂,以改变内膜并促进复制复合物的形成[43]㊂磷脂与P R R S V感染引起的凋亡㊁炎症及病毒复制相关㊂研究表明,P S暴露在细胞表面是P R R S V感染细胞中显示的凋亡证据,可以作为一种重要的吞噬信号[44-45]㊂W a n g等[46]研究发现,抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l-3-k i n a s e,P I3K)减少了病毒基因转录,使病毒蛋白合成显著减少,表明P I3K可影响病毒复制㊂最新研究发现,鞘磷脂磷酸二酯酶酸性样蛋白3B (s p h i n g o m y e l i n p h o s p h o d i e s t e r a s e a c i d-l i k e3B, S M P D L3B)抑制了P R R S V的吸附㊁进入㊁复制和释放,且其缺失显著抑制了P R R S V的增殖,表明S M P D L3B在P R R S V复制中起积极作用[47]㊂N-乙酰鞘氨醇脱乙酰基酶(N-a c y l s p h i n g o s i n e a m i d o h y d r o l a s e1,A S A H1)的自然底物C e r是S M途径信号系统的中心分子,A S A H1可以通过水解C e r激活N F-κB信号通路,A S A H1的上调表达在P R R S V感染引起的细胞凋亡和炎症反应中扮演着重要角色[48]㊂1.4脂滴在P R R S V感染中的作用脂滴是一种高度动态的细胞器,主要负责中性脂质的储存㊂脂滴来源于内质网,具有独特的结构,由中性脂质的疏水性核心组成㊂研究表明,病毒感染宿主细胞后可以诱导脂滴积累,宿主脂滴也可以调节病毒的生命周期,如轮状病毒(R o t a v i r u s,R V)利用脂滴进行复制,阻断脂滴积累可以显著减少R V增殖产生的子代病毒数量[49];D E N V感染增加了细胞内脂滴的数量,C75减少了D E N V感染和未感染细胞中脂滴的量,也抑制了D E N V的复制[50];H C V的核心蛋白与二酰基甘油酰基转移酶(d i a c y l g l y c e r o l a c y l t r a n s f e r a s e1,D G A T1)相互作用,使核周区脂滴增加并聚集,而抑制D G A T1活性可减少感染性病毒粒子的产生[51]㊂此外,脂滴还可作为一个平台,招募病毒蛋白,加速病毒组装,增加病毒复制[52]㊂P R R S V感染可以诱导脂滴积累,脂滴参与了P R R S V的复制和组装,且与细胞炎症相关㊂研究表明,P R R S V感染下调N-M y c下游调控基因1(N-M y cd o w n s t r e a m-r e g u l a t e d g e n e1,N D R G1)的表达,激活脂噬以促进子代病毒的复制和组装[53]㊂Y u等[54]研究表明,P R R S V感染会增加M a r c-145和P AM s细胞中的脂滴数量,而表没食子儿茶素没食子酸酯(e p i g a l l o c a t e c h i n g a l l a t e,E G C G)可以抑制P R R S V诱导的脂滴形成和脂质含量的增加㊂韩莹倩[55]选择了参与脂质合成和分解并调控脂滴趋向性的主要基因R a b18进行研究,利用R a b18基因敲低和显著负突变体证实R a b18参与P R R S V复制;进一步检测敲低R a b18基因对P R R S V生命周期的影响发现,R a b18基因参与P R R S V子代病毒的组装㊂最新研究表明,P R R S V感染可诱导脂滴积累,减少脂滴积累可显著降低P R R S V复制和抑制N F-κB 信号通路,同时下调I L-1β和I L-8的转录[56]㊂1.5脂筏在P R R S V感染中的作用脂筏是富含胆固醇和鞘脂的质膜微域(图2),参与了各种重要的细胞过程,包括胞吞作用㊁胞吐作用和细胞信号传导,基本上在病毒生命周期的每个阶段都依赖脂筏进行感染[57-59]㊂脂筏在许多病毒的生命周期中起着重要的作用,如宿主脂筏在I A V的组装和出芽中起着关键作用,且I A V可以利用脂筏依赖的内吞作用进行宿主内化[60]㊂一些病毒如S A R S-C o V-2[61]㊁黄病毒[62]及埃博拉病毒(E b o l a v i r u s,E B O V)[63]等都利用脂筏进入宿主细胞,表明病毒在进入阶段与细胞膜上的脂筏有密切关系㊂图2脂筏结构示意图F i g.2S c h e m a t i c o f l i p i d r a f t s t r u c t u r e09614期罗琴等:脂质代谢和糖代谢在P R R S V感染宿主细胞中作用研究进展一些证据表明,P R R S V进入细胞依赖脂筏㊂Y a n g等[64]证明了P R R S VG P3和G P4蛋白在病毒进入过程中与脂筏相关,细胞脂筏的破坏抑制了P R R S V的进入,且细胞膜上的脂筏在P R R S V的复制和释放中起着重要的作用㊂D u等[65]证明P R R S V G P4蛋白是一种糖基磷脂酰肌醇(g l y c o s y l-p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l,G P I)修饰的膜相关蛋白,G P4与C D163在细胞膜脂筏上的共定位暗示了该复合物对于P R R S V进入和感染的重要作用㊂孙颖[66]用针对性抑制脂筏介导的胞吞途径的药物处理细胞以研究脂筏在P R R S V侵入M a r c-145细胞过程中的作用,结果表明,当脂筏介导的胞吞途径被抑制时,病毒增殖能力下降;进一步用针对性抑制网格蛋白介导的胞吞途径的药物处理细胞后P R R S V的感染受到明显的抑制,表明P R R S V侵入M a r c-145细胞的胞吞途径是依赖脂筏和网格蛋白的㊂然而,H u a n g等[27]研究证明,胆固醇缺乏并不改变M a r c-145细胞中P R R S V受体C D163的表达水平,对网格蛋白介导的胞吞作用没有影响,但干扰了脂筏依赖的胞吞作用㊂2糖代谢在P R R S V感染中的作用2.1糖酵解增强对P R R S V的作用一些病毒感染可以影响宿主细胞内的糖代谢水平,如H C MV感染促进糖酵解水平显著增加,导致葡萄糖消耗增加,从而抑制病毒复制[7]㊂D E N V和I A V感染能够诱导糖酵解途径,从而促进病毒复制[67-68]㊂H C V重编程宿主细胞代谢,以利于有氧糖酵解水平的提高[69]㊂腺病毒(A d e n o v i r u s)的基因产物E4O R F1诱导宿主细胞葡萄糖代谢上调,通过激活MY C来促进上皮细胞中糖酵解的增强[70]㊂P R R S V可以通过糖酵解途径来促进病毒复制㊂L i u等[71]发现P R R S V G P5在细胞质中与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(g l y c e r a l d e h y d e-3-p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e,G A P D H)相互作用,抑制G A P D H 进入细胞核,并通过其糖酵解活性促进P R R S V复制㊂Z h a n g等[72]研究发现,P R R S V感染促进糖酵解产生乳酸,乳酸靶向MA V S抑制R L R信号,从而促进病毒复制㊂毛健等[73]研究表明,P R R S V感染M a r c-145细胞可明显提高糖酵解的关键激酶乳酸脱氢酶A(l a c t a t e d e h y d r o g e n a s eA,L D H A)表达,并呈现病毒感染剂量依赖性㊂抑制L D H A和糖酵解可以显著抑制P R R S V N蛋白表达并降低病毒滴度,表明L D HA可显著影响P R R S V复制,糖酵解在P R R S V感染中发挥重要作用㊂2.2三羧酸循环代谢产物对P R R S V的作用三羧酸循环是有氧生物获得生命活动所需能量的主要途径㊂三羧酸循环的整个过程需要多种酶的协同作用,并产生多种中间代谢产物,以此来维持细胞稳定的生存环境㊂衣康酸是免疫反应基因1 (i m m u n o r e s p o n s i v e g e n e1,I R G1)通过催化顺乌头酸产生的三羧酸循环的代谢产物,在代谢和免疫中起重要作用㊂P a n g等[74]研究发现,衣康酸4-辛酯(4-o c t y l i t a c o n a t e,4-O I)可通过干扰病毒的吸附㊁复制和释放,剂量依赖性地抑制P R R S V增殖;还可通过增强核因子红细胞2相关因子2(n u c l e a r f a c t o r e r y t h r o i d2-r e l a t e df a c t o r2,N r f2)信号传导抑制P R R S V诱导的炎症反应,表明4-O I是一种很有前景的抗P R R S V候选药物㊂3小结与展望脂质代谢中脂肪酸㊁胆固醇㊁磷脂㊁脂滴和脂筏在P R R S V感染中发挥了重要作用㊂其中,脂肪酸对于P R R S V的增殖至关重要,参与了P R R S V的复制㊁组装及释放等阶段,且与炎症和免疫有关;胆固醇参与了P R R S V感染的多个阶段,包括P R R S V 的吸附㊁进入㊁复制和释放,同时也参与了炎症反应及对I F N-Ⅰ的调控;磷脂在P R R S V复制中起促进作用并与P R R S V感染引起的细胞凋亡有关;脂滴参与了P R R S V的复制和组装,同时与细胞炎症相关;细胞膜上的脂筏是P R R S V进入宿主细胞所必需的,并参与了P R R S V的复制和释放㊂同样,糖代谢中的糖酵解途径在P R R S V感染中具有重要作用,P R R S V通过增强糖酵解以促进病毒复制㊂此外,三羧酸代谢产物4-O I能够抑制P R R S V的复制和P R R S V诱导的炎症反应㊂总而言之,脂质代谢和糖代谢在P R R S V感染中都扮演了十分重要的角色㊂目前,P R R S V的商业疫苗仍难以提供令人满意的效果,且无有效的药物进行治疗㊂因此,对P R R S V感染机制的研究仍然是一项极为紧迫的任务㊂脂质代谢是病毒与宿主细胞的抗衡过程中重要的一部分,脂质代谢参与了P R R S V感染的多个阶段,探索脂质代谢和P R R S V之间的相互作用,有利于增加对病毒复制机理的认知,可为未来抗P R R S V药物的研发提供一些新思路,如对于一些依赖胆固醇进行复制且缺乏治疗方法的病毒而言,胆固醇可作为治疗靶点[75]㊂P R R S V通过增强糖酵1961中国畜牧兽医51卷解以促进病毒复制,三羧酸循环代谢产物又可抑制病毒复制,了解糖代谢与P R R S V感染之间的关系,有助于阐明P R R S V的复制机制㊂随着代谢组学的发展和完善,脂质代谢和糖代谢影响P R R S V感染机制的研究将会变得更为简单和快速,这也为今后抗P R R S V药物研发提供了更大的可能性㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] L IP,S H E N Y,WA N G T,e ta l.E p i d e m i o l o g i c a ls u r v e y o fP R R Sa n d g e n e t i cv a r i a t i o na n a l y s i so f t h eO R F5g e n ei n S h a n d o n g p r o v i n c e,2020-2021[J].F r o n t i e r s i nV e t e r i n a r y S c i e n c e,2022,9:987667.[2] HA N J,Z H O U L,G E X,e ta l.P a t h o g e n e s i sa n dc o n t r o l o f t h e C h i n e s e h i g h l y p a t h o g e n i c P o r c i n er e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s[J].V e t e r i n a r y M i c r o b i o l o g y,2017,209:30-47. 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国内外PRRS的发展简史

年，荷兰科学家分离到ＰＲＲＳＶ，并将其命名为ＬｅｌｙｓｔａｄＶｉｒｕｓ（ＬＶ）。１９９２年美国分离到了ＰＲＲＳＶ，命名为ＶＲ一２３３２，同年，该病正式命名为 “ 猪繁殖与呼吸综合征（ＰＲＲＳ）” ，得到国际兽医局（ＯＩＥ）的承认，将并
主要是繁殖障碍，表现为发情不典型、受孕率低、难产、流产、木乃伊胎、弱仔及死胎等症状。而仔猪主要则引起呼吸道疾病，咳喘、毛松毛长、生长缓慢及死亡率增加。ＰＲＲＳ感染猪常导致现机体免疫抑制，使机体易受环境和条件性病原的影响，伴随其他疾病一同发生，如与猪瘟、猪副嗜血杆菌、附红细胞体、猪流感及仔猪断奶后多系统衰竭综合征和猪呼吸道疾病综合征等的病原混合感染、多重感染。
引起的ＨＰ — ＰＲＲＳ。该病毒与２００５年之前所分离的ＰＲＲＳＶ
世纪８０年代首次被发现，数十年来不断地被深入研究，
因病毒独特的免疫逃逸和快速的分子突变机制，导致现
毒株有着显著差异，主要表现为在基因Ｎｓｐ２上存在３Ｏ个氨基酸缺失，毒力增强，细胞适应性增强。之后，ＨＰ— ＰＲＲＳＶ的湖南株、天津株、广东毒株等先后被分离鉴

基于RNA-seq的热应激条件下虹鳟肝脏和头肾转录组分析

基于RNA-seq的热应激条件下虹鳟肝脏和头肾转录组分析基于RNA-seq的热应激条件下虹鳟肝脏和头肾转录组分析摘要：热应激是指生物体受到高温环境的刺激，引起一系列生理和生化反应的过程。

为了深入理解虹鳟在热应激条件下的生物反应，本研究使用RNA-seq技术分析了热应激处理后虹鳟肝脏和头肾组织的转录组变化。

通过对差异表达基因进行功能注释和通路分析，我们揭示了热应激对虹鳟肝脏和头肾组织的影响，为进一步研究虹鳟适应高温环境的分子机制提供了重要线索。

引言：温度是生物体生活的基本环境要素之一，过高或过低的温度都会对生物体的生理和代谢过程产生重要影响。

虹鳟是一种广泛分布于北半球温带地区的淡水鱼类，对温度敏感。

此前的研究表明，热应激条件下虹鳟的生理和生化反应发生了变化，但相关的分子机制尚不清楚。

因此，本研究旨在利用RNA-seq技术来揭示虹鳟在热应激条件下肝脏和头肾组织的转录组变化，以期为进一步研究虹鳟适应高温环境的分子机制提供基础。

材料与方法：1. 实验材料：本实验使用健康成年虹鳟作为实验材料。

2. 试验组设计：将虹鳟分成两组，一组作为空白对照组，另一组作为热应激处理组。

3. 适应和处理：将试验组和对照组的虹鳟分别适应于相同的环境条件下，并将处理组暴露在高温环境（例如35°C）下一段时间。

4. 样本收集：在热应激处理后，分别从虹鳟肝脏和头肾组织中收集样本，总共收集6个样本。

5. RNA提取和测序：采用RNA提取试剂盒提取总RNA，并进行库构建和Illumina HiSeq测序。

结果：1. 转录组数据质量评估：对测序数据进行质量评估，包括测序深度、GC含量等指标。

2. 差异表达基因分析：使用生物信息学工具对转录组数据进行分析，筛选出在热应激条件下显著差异表达的基因。

3. 功能注释和通路分析：对差异表达基因进行功能注释，包括基因本体论（GO）和KEGG富集分析，以揭示热应激对虹鳟肝脏和头肾组织的影响。

保持或增加公猪血统数是保种工作的当务之急(精)

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Ⅱ
维持一定数量的公猪血统是实践中保存品种内遗传多样性的最有效措施
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品种内的遗传多样性程度可从不同水平直至DNA分子水平来度量，可用不同方法（群体、数量、细胞、分子遗传学技术）来研究。但直观的、易在保种实践中实施的、能间接地推断遗传多样性的指标是公畜的血统数。
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但当现有的公猪血统数不足以帮助实现这一目标时，除应保存好现有的公猪血统外，还须尽可能地增加公猪的血统数。本文将讨论： ①保持现有公猪血统或增加公猪血统的必要性； ②为增加公猪血统数而推荐一种可尝试的方法。
●以上仅供决策部门和保种单位参考。
——从上可见，竭尽全力保存公猪现有的血
统是必要的。尽管有些品种原有的遗传多样性已不同程度地有所削弱，但也要力争缩小遗传多样性上的损失。
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Ⅲ 查清公猪血统数要解决
重号问题
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●维持一定量的公猪血统，首先要摸清家
底，查清现有多少公猪血统。而要查清公猪血统，就必须采取措施解决重号问题。
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Ⅴ 增加公猪血统可尝试的一种方法 ——回交法
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若经费允许，则可自行创建新血统公猪：从保护区或分布区域同品种母猪中寻找与该品种现有公猪无亲缘关系的新母猪血统 →将新血统中有代表性的母猪引入保种场 →与现有公猪配种，生下F1 →用F1中的公猪与这些新引入母猪回交(backcross) →再继续回交 →从回交三代（B3）或回交四代（B4）中选留含有 93.75％或96.88％的引入母猪的“血液”的公猪

4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中DNA甲基化与mRNA表达联合验证

中国畜牧兽医 2024,51(4):1651-1659C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中D N A 甲基化与m R N A 表达联合验证杨雅琼1,程鸿星1,梁明霞1,2,刘玉兰3,付书林3,张晶1,陈洪波1,任红艳4,郭玲1,晁哲2(1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院,动物遗传繁育与精准养殖实验室,武汉430023;2.海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室,海口570312;3.武汉轻工大学,动物营养与饲料科学湖北省重点实验室,武汉430023;4.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室,武汉430070)摘要:ʌ目的ɔ验证候选基因在副猪嗜血杆菌(G l a e s s e r e l l a p a r a s u i s ,G P S )感染仔猪脑组织中D N A 甲基化与m R N A 表达之间的联合调控关系,为揭示副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观致病机理提供理论依据㊂ʌ方法ɔ选取6头28日龄断奶仔猪,随机均分为对照组和G P S 组,G P S 组仔猪腹腔注射1m L2ˑ109C F U /m L 副猪嗜血杆菌S H 0165菌液,对照组仔猪腹腔注射等量生理盐水,7d 后采集仔猪脑组织提取D N A 和R N A ㊂采用实时荧光定量P C R 检测4个候选基因(L Y P D 1㊁P I T P NM 1㊁S Y P ㊁A C V R 1B )的m R N A 表达量,并利用重亚硫酸盐测序(b i s u l f i t es e q u e n c i n g P C R ,B S P )㊁甲基化特异性P C R (m e t h y l a t i o n -s p e c i f i cP C R ,M S P )检测副猪嗜血杆菌感染前后4个基因在仔猪脑组织中的D N A 甲基化变化㊂ʌ结果ɔ本研究成功将M S P 方法应用于基因的D N A 甲基化测序研究,使其不局限于定点检测甲基化位点㊂实时荧光定量P C R 结果显示,与对照组相比,G P S 组仔猪L Y P D 1㊁P I T P NM 1㊁S Y P ㊁A C V R 1B 基因m R N A 表达均显著或极显著下调(P <0.05;P <0.01)㊂D N A 甲基化测序结果显示,除A C V R 1B 基因外,各基因D N A 甲基化均上调㊂ʌ结论ɔ除A C V R 1B 基因外,L Y P D 1㊁P I T P NM 1㊁S Y P 3个基因D N A 甲基化与m R N A 表达水平呈反向关联调控,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织D N A 甲基化变化对4个候选基因的表达具有不同的调控模式㊂关键词:副猪嗜血杆菌;L Y P D 1基因;P I T P NM 1基因;S Y P 基因;A C V R 1B 基因;D N A 甲基化中图分类号:S 852.61+2;Q 78文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.033 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-22基金项目:国家自然科学基金(32273067);湖北省自然科学基金(2022C F B 418);海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室(H K L 202303);动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题(K L A E M B -2023-02);武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室(202301)联系方式:杨雅琼,E -m a i l :y a n g 116370@163.c o m ㊂通信作者郭玲,E -m a i l :g u o l i n g 1101@w h p u .e d u .c n ;晁哲,E -m a i l :c h a o z h e @h n a a s .o r g.c n I n t e g r a t e dV a l i d a t i o n f o rD N A M e t h y l a t i o na n dm R N AE x pr e s s i o no f 4G e n e s i nB r a i no f G l a e s s r e r l l a p a r a s u i s -i n f e c t e dP i gl e t s Y A N G Y a q i o n g 1,C H E N G H o n g x i n g 1,L I A N G M i n gx i a 1,2,L I U Y u l a n 3,F US h u l i n 3,Z H A N GJ i n g 1,C H E N H o n g b o 1,R E N H o n g y a n 4,G U OL i n g 1,C H A OZh e 2(1.L a b o r a t o r y o f G e n e t i cB r e e d i n g R e p r o d u c t i o na n dP r e c i s i o nL i v e s t o c kF a r m i n g ,S c h o o l o f A n i m a l S c i e n c e a n d N u t r i t i o n a lE n g i n e e r i n g ,W u h a nP o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y ,W uh a n 430023,C h i n a ;2.H a i n a nK e y L a b o r a t o r yf o rT r o p i c a lA n i m a lB r e e d i n g a n dD i s e a s eR e s e a r c h ,H a i k o u 570312,C h i n a ;3.H u b e iK e y L a b o r a t o r y o f An i m a lN u t r i t i o na n dF e e dS c i e n c e ,W u h a nP o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y ,W u h a n 430023,C h i n a ;4.K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lE m b r yo E n g i n e e r i n g a n d M o l e c u l a rB r e e d i n g o f H u b e iP r o v i n c e ,W u h a n 430070,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h ea i m o ft h i ss t u d y w a st o v e r i f y t h e j o i n tr e g u l a t o r y r e l a t i o n s h i pb e t w e e nD N A m e t h y l a t i o n a n dm R N Ae x p r e s s i o no fc a nd i d a te g e n e s i n t h e b r a i n t i s s u e of p i gl e t s中国畜牧兽医51卷i n f e c t e db y G l a e s s e r e l l a p a r a s u i s(G P S),i no r d e r t o p r o v i d ea t h e o r e t i c a l b a s i s f o r r e v e a l i n g t h e a p p a r e n t p a t h o g e n i cm e c h a n i s mo fm e n i n g i t i s c a u s e db y G P S i n p i g l e t s.ʌM e t h o dɔS i x28-d a y-o l d w e a n e d p i g l e t sw e r er a n d o m l y d i v i d e di n t oc o n t r o l a n d G P S g r o u p s.T h e p i g l e t s i n G P S g r o u p w e r e i n t r a p e r i t o n e a l l y i n j e c t e d w i t h1m L o f2ˑ109C F U/m L G P SS H0165s o l u t i o n,a n dt h e p i g l e t s i n c o n t r o l g r o u p w e r e i n t r a p e r i t o n e a l l y i n j e c t e dw i t h t h e s a m e a m o u n t o f n o r m a l s a l i n e,a n d t h eb r a i n o ft h e p i g l e t s w e r ec o l l e c t e d7d a y sl a t e rt oe x t r a c t D N A a n d R N A.T h e m R N A e x p r e s s i o no f4c a n d i d a t e g e n e s(L Y P D1,P I T P NM1,S Y Pa n dA C V R1B)w e r ed e t e c t e db y R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R,a n db i s u l f i t e s e q u e n c i n g P C R(B S P)a n dm e t h y l a t i o n-s p e c i f i cP C R(M S P) w e r eu s e d t od e t e c t t h eD N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s o f4g e n e s i nb r a i n t i s s u e s o f p i g l e t s b e f o r e a n d a f t e r G P S i n f e c t i o n.ʌR e s u l tɔT h i s s t u d y s u c c e s s f u l l y a p p l i e d t h e M S P m e t h o d t o D N A m e t h y l a t i o ns e q u e n c i n g o f g e n e s,m a k i n g i tn o t l i m i t e dt of i x e d-p o i n td e t e c t i o no f m e t h y l a t i o n s i t e s.T h e r e s u l t so fR e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C Rs h o w e dt h a tc o m p a r e d w i t hc o n t r o l g r o u p,t h e m R N A e x p r e s s i o n o f L Y P D1,P I T P NM1,S Y P a n d A C V R1B g e n e si n G P S g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y o re x t r e m e l y s i g n i f i c a n t l y d o w n-r e g u l a t e d(P<0.05o r P<0.01).T h er e s u l t so f D N A m e t h y l a t i o n s e q u e n c i n g s h o w e dt h a tt h e D N A m e t h y l a t i o nl e v e lo f4g e n e s w e r e u p-r e g u l a t e d e x c e p t f o r A C V R1B g e n e.ʌC o n c l u s i o nɔE x c e p t f o r A C V R1B g e n e,t h e D N A m e t h y l a t i o n o f L Y P D1,P I T P NM1a n d S Y P g e n e s w a si n v e r s e l y a s s o c i a t e d w i t h m R N A e x p r e s s i o n,a n d t h eD N A m e t h y l a t i o n c h a n g e s i nb r a i no f p i g l e t a f t e rG P S i n f e c t i o nh a dd i f f e r e n t r e g u l a t o r yp a t t e r n s f o r t h e e x p r e s s i o no f4c a n d i d a t e g e n e s.K e y w o r d s:G l a e s s e r e l l a p a r a s u i s;L Y P D1g e n e;P I T P NM1g e n e;S Y P g e n e;A C V R1B g e n e;D N A m e t h y l a t i o n副猪嗜血杆菌(G l a e s s e r e l l a p a r a s u i s,G P S),属革兰阴性㊁兼性厌氧菌,具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(N A D)依赖性,是巴氏杆菌科的成员[1]㊂副猪嗜血杆菌定植于猪上呼吸道,对断奶仔猪尤其易感[2],猪感染后常出现全身性炎症反应,有浆膜炎㊁关节炎㊁脑膜炎等临床表现,易引发猪革拉泽氏病[3]㊂副猪嗜血杆菌通过猪上呼吸道进入血液循环,透过血管内皮细胞破坏血脑屏障,从而引发细菌性脑膜炎[4],对生猪养殖危害极大㊂目前,由副猪嗜血杆菌引起的细菌性脑膜炎的发病机制尚不清楚,亟待展开深入研究㊂D N A甲基化(D N A m e t h y l a t i o n)是表观遗传的重要修饰方法之一[5],D N A甲基化已被证实与哺乳动物的生长发育[6]㊁免疫反应㊁炎症疾病[7]及癌症[8-9]等相关,宿主暴露于共生微生物群可诱导调节元件处的局部D N A发生甲基化变化,这些表观修饰变化会影响宿主基因的表达变化[10]㊂目前D N A 甲基化的研究方法主要有重亚硫酸盐测序(b i s u l f i t e s e q u e n c i n g P C R,B S P)㊁甲基化特异性P C R (m e t h y l a t i o n-s p e c i f i c P C R,M S P)和焦磷酸测序(p y r o s e q u e n c i n g,P S Q)等[11],其中B S P可定量分析D N A的甲基化水平并可确认单个位点的甲基化状态,但有通量低㊁耗时长的缺点,尤其是基于克隆的B S P,不易大批量进行[12];而M S P测序则灵敏度高,操作简单,但也存在只能定性㊁不可定量㊁特异性低等弊端㊂因此,在实际应用中可根据需求及测序方法特点进行选择㊂目前,关于副猪嗜血杆菌感染引起宿主产生炎症反应过程中表观遗传调控的相关研究较少㊂武汉轻工大学动物遗传繁育与精准养殖实验室前期对副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织进行全基因组D N A甲基化测序(w h o l e-g e n o m e b i s u l f i t e s e q u e n c i n g, WG B S)与转录组测序,并对结果进行联合分析,得到了大量联合调控的候选差异基因,其中淋巴细胞抗原-6/尿激酶型纤溶酶原激活物受体包含体1 (L Y P D1)㊁磷脂酰肌醇转运膜蛋白1(P I T P NM1)㊁突触素(S Y P)和激活素A1B型受体(A C V R1B)4个候选基因m R N A表达水平和D N A甲基化水平与对照组相比均具有显著差异[13]㊂本研究利用实时荧光定量P C R检测L Y P D1㊁P I T P NM1㊁S Y P 和A C V R1B4个候选差异基因的m R N A表达水平,并采用B S P或M S P分别检测4个基因的D N A 甲基化水平,推测这些基因的m R N A表达与其D N A甲基化的调控关系,以期为进一步探究副猪嗜25614期杨雅琼等:4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中D N A甲基化与m R N A表达联合验证血杆菌引发仔猪脑膜炎的表观遗传调控机制奠定一定理论基础㊂1材料与方法1.1菌种和试验动物副猪嗜血杆菌S H0165菌株血清5型由华中农业大学微生物重点实验室提供;28日龄自然分娩的健康杜ˑ长ˑ大三元杂交断奶仔猪6头(8~ 10k g),购自武汉万年青畜牧有限公司㊂1.2主要试剂与仪器Q u i c k-D N A T M M i n i p r e p K i t(D3024)㊁E ZD N A M e t h y l a t i o n-G o l d T M K i t(D5005)均购自Z y m o R e s e a r c h公司;T R N z o l U n i v e r s a l R e a g e n t K i t (D P424)购自天根生化科技(北京)有限公司;E p i T a q T M H S(f o rb i s u l f i t e-t r e a t e d D N A)(R110Q)㊁P r i m e s c r i p t R T R e a g e n t K i t w i t h g D N A E r a s e r (R R047A)㊁T B G r e e n P r e m i x E x T a q T M (R R820A)㊁p M D19-T V e c t o rC l o n i n g K i t(6013)均购自T a K a R a公司;F a s t P u r eG e lD N A E x t r a c t i o n M i n iK i t(D C301-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;T r a n s5αC h e m i c a l l y C o m p e t e n t C e l l (C D201-02)购自北京全式金生物技术股份有限公司㊂全波长(200~900n m)微量分光光度计(S MA5000)购自美林恒通(北京)仪器有限公司;实时荧光定量P C R仪购自A p p l i e dB i o s y s t e m s公司;梯度P C R仪购自T a K a R a公司;高速冷冻离心机购自T h e r m oF i s h e r S c i e n t i f i c公司㊂1.3试验设计6头杜ˑ长ˑ大三元杂交断奶仔猪随机分为G P S组和对照组,组间保证体重相近㊁性别比例一致,每组3个重复㊂G P S组每头仔猪腹腔注射1m L 2ˑ109C F U/m L副猪嗜血杆菌S H0165菌液[14],对照组仔猪腹腔注射等量生理盐水,感染监测7d后,屠宰并采集脑组织,将脑组织样本液氮冷冻后于―80ħ保存备用㊂1.4组织核酸提取脑组织样本研磨后,使用T R N z o l U n i v e r s a l R e a g e n tK i t提取仔猪脑组织R N A,测定浓度后于―80ħ保存,用于基因表达水平检测;使用Q u i c k-D N A T M M i n i p r e p K i t提取仔猪脑组织D N A,用全波长(200~900n m)微量分光光度计测定浓度后于―20ħ保存,用于B S P或M S P测序㊂1.5实时荧光定量P C R根据G e n B a n k数据库中L Y P D1㊁P I T P NM1㊁S Y P㊁A C V R1B和β-a c t i n基因c D N A序列,利用P r i m e r P r e m i e r5.0软件设计实时荧光定量P C R引物,引物信息见表1㊂使用P r i m e s c r i p t R T R e a g e n t K i tw i t h g D N A E r a s e r将脑组织R N A反转录为c D N A㊂以c D N A为模板,以β-a c t i n为内参基因,使用T BG r e e n P r e m i xE x T a q T M对候选基因进行实时荧光定量P C R检测㊂P C R反应体系10μL: T BG r e e nP r e m i x E x T a q5.0μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.2μL,c D N A1.0μL,R N a s e-f r e e W a t e r3.6μL㊂P C R反应程序:95ħ5m i n;95ħ30s,退火(退火温度见表1)30s㊂每个反应设3个重复㊂表1实时荧光定量P C R引物序列T a b l e1R e a l-t i m e q u a n t i t a t i v eP C R p r i m e r s e q u e n c e s基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e/ħ产物长度P r o d u c t sl e n g t h/b pG e n B a n k登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o.L Y P D1F:C A G C C C T T A G G C G A C A C T57195NM_001185064.2 R:A A C C C T G C C A C C G A G A AP I T P NM1F:C T G T C G C A G C A C A A C T T T C C60163X M_003122455.5 R:C C G C A T A T A C T G C C A C G T C TS Y P F:C T C T A C T C C A T G G G G G C T C T60169X M_003135078.5 R:C C G T G G C C A T C T T C A C A T C TA C V R1B F:C T C C T T C T T C C C C C T T G T T G T C61175NM_001195322.1R:C A C A T G G T G C T C C A T C C C G Tβ-a c t i n F:T G C G G G A C A T C A A G G A G A A G58216NM_001170517.2 R:A G T T G A A G G T G G T C T C G T G G3561中国畜牧兽医51卷1.6甲基化扩增引物设计在N C B I数据库中下载L Y P D1㊁P I T P NM1㊁S Y P和A C V R1B基因序列,利用M e t h P r i m e r网站(h t t p:ʊw w w.u r o g e n e.o r g/m e t h p r i m e r/)将D N A 序列进行 C-T 转化,其中未甲基化的 C 转化为 T ,甲基化的 C 则不发生转化㊂以转化序列为模板,利用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计甲基化扩增引物,针对不同基因的碱基组成及序列特点,分别采用B S P或M S P方法进行引物设计㊂L Y P D1和P I T P NM1基因以转化序列为模板,使用P r i m e rP r e m i e r5.0软件设计B S P引物,引物序列中避免出现胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(c y t o s i n e-p h o s p h o r i c a c i d-g u a n i n e,C p G)位点;由于S Y P和A C V R1B基因转化后D N A序列中C p G位点分布过于密集,用B S P方法无法找到合适的引物位点,故采用M S P方法进行引物设计,即以转化序列为模板,利用M e t h P r i m e r网站设计M S P引物,每个基因分别设计甲基化特异性引物(如M-S Y P-F/R)和非甲基化特异性引物(如U-S Y P-F/R),单个引物序列中至多包含2个C p G位点㊂引物信息见表2㊂表2D N A甲基化测序引物信息T a b l e2D N A m e t h y l a t i o n s e q u e n c i n gp r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħ产物长度P r o d u c t s l e n g t h/b p L Y P D1F:G G G T G G G T T G G G T T A G A G T T T G T A G62400 R:T C C A C C T C C C A C T C C A A A C A C CP I T P NM1F:G G T G T T G G T T G T A G A G T T G G G T60465 R:C C C C T T A C C C T A C A T C C A A CS Y P M-F:T T T A G A G T A G A T T A A G G G G G A A G A C58239 M-R:A A A T A A A T C A A A T A A T A A T C G C G A AU-F:T A G A G T A G A T T A A G G G G G A A G A T G A55237U-R:A A A T A A A T C A A A T A A T A A T C A C A A AA C V R1B M-F:G T T T G A G G T T A A G T A G T A G G G AC G A59218M-R:T A A A A A A A T A A A A A A A A C T C G C G T CU-F:G T T T G A G G T T A A G T A G T A G G G A T G A55218U-R:T A A A A A A A T A A A A A A A A C T C A C A T C1.7B S P/M S P分析1.7.1 重亚硫酸盐转化使用E Z D N A M e t h y l a t i o n-G o l d T M K i t对仔猪脑组织D N A进行重亚硫酸盐处理,转化后测定浓度,―20ħ保存㊂1.7.2目的片段扩增及回收以重亚硫酸盐转化后的脑组织D N A为模板,使用E p i T a q T M H S (f o r b i s u l f i t e-t r e a t e dD N A)试剂盒进行P C R扩增㊂P C R反应体系50μL:E p i T a q H S(5.0U/μL) 0.25μL,10ˑE p i T a q P C R B u f f e r(M g2+f r e e) 5.0μL,25m m o l/L M g C l25.0μL,d N T P M i x t u r e (各2.5m m o l/L)6.0μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各2.0μL,D N A2.0μL,R N a s e-f r e e W a t e r补足体系㊂P C R反应程序:94ħ预变性5m i n;98ħ变性10s,退火(退火温度见表2)30s,72ħ延伸35s,共35个循环;72ħ延伸7m i n;4ħ保存㊂P C R产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后,使用F a s t P u r e G e l D N A E x t r a c t i o n M i n iK i t对目的条带进行回收纯化,―20ħ保存备用㊂1.7.3目的片段T A克隆及测序将目的片段与p M D19-T载体进行连接,连接产物转化T r a n s5α感受态细胞㊂转化过程:取5μL连接产物加至50μLT r a n s5α感受态细胞,冰浴30m i n,42ħ热激45s,冰浴2m i n;加入无抗生素L B培养基950μL,于37ħ恒温摇床220r/m i n培养1h;吸取50μL 菌液涂布于氨苄抗性L B平板,恒温培养箱37ħ过夜培养㊂于过夜培养平板上挑取单菌落进行菌落P C R鉴定,每个样本选取10~15个阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序㊂1.7.4 D N A甲基化水平分析以D N A原始序列为参考序列,将B S P结果在B i Q A n a l y z e r软件(h t t p s:ʊb i q-a n a l y z e r.b i o i n f.m p i-i n f.m p g.d e/)中进行序列比对;将比对结果用B i Q A n a l y z e r软件进行甲基化分析,得到候选基因目的区域D N A甲基化情况㊂如与原序列相比,C转换为T则表示该位点未45614期杨雅琼等:4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中D N A 甲基化与m R N A 表达联合验证发生甲基化;反之,如与原序列相比,C 未转换为T 则表示该位点发生甲基化㊂结果用黑白点图表示㊂1.8 数据统计分析试验数据采用2―әәC t法计算目的基因的相对表达量,使用G r a p h P a dP r i s m8.0软件进行独立样本t 检验㊂结果以平均值ʃ标准差表示,P <0.05表示差异显著;P <0.01表示差异极显著㊂2 结果2.1 4个候选基因m R N A 表达水平实时荧光定量P C R 检测结果显示,与对照组相比,G P S 组仔猪脑组织中L Y P D 1㊁A C V R 1B 基因表达显著下调(P <0.05);P I T P NM 1㊁S Y P 基因表达极显著下调(P <0.01)(图1)㊂*,差异显著(P <0.05);**,差异极显著(P <0.01);n s ,差异不显著(P >0.05)㊂下同*,S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);**,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01);n s ,N os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05).T h e s a m e a sb e l o w图1 仔猪脑组织中L Y P D 1㊁P I T P NM 1㊁S Y P ㊁A C V R 1B 基因的相对表达量F i g .1 R e l a t i v e e x p r e s s i o no f L Y P D 1,P I T P NM 1,S Y P a n d A C V R 1B g e n e s i nb r a i no f p i gl e t s 2.2 4个候选基因的D N A 甲基化水平4个候选基因均以全基因组D N A 甲基化测序结果为参考,选取D N A 差异甲基化区为目的片段设计甲基化测序引物(图2A~5A 中方框标注),其中L Y P D 1㊁P I T P NM 1基因以B S P 引物进行测序,S Y P ㊁A C V R 1B 基因以M S P 引物进行测序㊂2.2.1 L Y P D 1基因D N A 甲基化水平测序结果显示,G P S 组仔猪脑组织中L Y P D 1基因目的片段的D N A 甲基化频率为31.85%㊁32.13%及33.06%,平均甲基化频率为(32.35ʃ0.37)%;对照组为17.34%㊁10.04%及17.5%,平均甲基化频率为(14.96ʃ2.46)%㊂与对照组相比,该基因在G P S 组中D N A 甲基化频率极显著上调(P <0.01)(图2B )㊂2.2.2 P I T P NM 1基因D N A 甲基化水平测序结果显示,G P S 组仔猪脑组织中P I T P NM 1基因目的片段的D N A 甲基化频率为32.37%㊁27.84%及48.29%,平均甲基化频率为(36.27ʃ6.20)%;对照组为10.86%㊁7.14%及6.03%,平均甲基化频率为(8.01ʃ1.46)%㊂与对照组相比,该基因在G P S 组中D N A 甲基化频率显著上调(P <0.05)(图3B )㊂5561中国畜牧兽医51卷①A ,全基因组甲基化测序分析;B ,B S P /M S P 验证,其中每行代表一个阳性克隆,每列代表一个C p G 位点㊂②Ә,甲基化的C p G 位点;ʻ,未甲基化的C p G 位点;│,非C pG 位点㊂下同①A ,W h o l e g e n o m em e t h y l a t i o n s e q u e n c i n g a n a l y s i s ;B ,B S Po rM S Pv a l i d a t i o n ,e a c hr o wr e p r e s e n t sa p o s i t i v e c l o n e ,a n de a c h c o l u m n r e p r e s e n t s aC p Gs i t e .②Ә,M e t h y l a t e dC p Gs i t e ;ʻ,U n m e t h y l a t e dC p Gs i t e ;│,N o n -C p Gs i t e .T h e s a m e a sb e l o w 图2 副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织L Y P D 1基因的D N A 甲基化模式分析F i g .2 A n a l y s i s o fD N A m e t h y l a t i o nm o d e o f L Y P D 1g e n e i nb r a i no fG P S -i n f e c t e d p i gl e ts 图3 副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织P I T P NM 1基因的D N A 甲基化模式分析F i g .3 A n a l y s i s o fD N A m e t h y l a t i o nm o d e o f P I T P NM 1g e n e i nb r a i no fG P S -i n f e c t e d p i gl e t s 2.2.3 S Y P 基因D N A 甲基化水平测序结果显示,G P S 组仔猪脑组织中S Y P 基因目的片段的D N A 甲基化频率为45.00%㊁32.20%及11.67%,平均甲基化频率为(29.62ʃ9.71)%;对照组为13.56%㊁20.00%及26.67%,平均甲基化率为(20.08ʃ3.78)%㊂与对照组相比,该基因在G P S 组中D N A 甲基化频率呈上调趋势(P >0.05,图4B )㊂2.2.4 A C V R 1B 基因D N A 甲基化水平测序结果显示,在所有被测样本中A C V R 1B 基因目的区域的D N A 甲基化频率均极低(<1%),其中G P S组仔猪脑组织中A C V R 1B 基因目的片段的D N A 甲基化频率分别为0.53%㊁0.53%及0.53%,平均甲基化频率为(0.53ʃ0.00)%;对照组为0.53%㊁0及1.58%,平均甲基化频率为(0.70ʃ0.46)%㊂与对照组相比,该基因在G P S 组中D N A 甲基化频率无显著变化(P >0.05,图5B )㊂65614期杨雅琼等:4个基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中D N A 甲基化与m R N A表达联合验证图4 副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织S Y P 基因的D N A 甲基化模式分析F i g .4 A n a l y s i s o fD N A m e t h y l a t i o nm o d e o f S Y P g e n e i nb r a i no fG P S -i n f e c t e d p i gl e ts 图5 副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织A C V R 1B 基因的D N A 甲基化模式分析F i g .5 A n a l y s i s o fD N A m e t h y l a t i o nm o d e o f A C V R 1B g e n e i nb r a i no fG P S -i n f e c t e d p i gl e t s 3 讨论副猪嗜血杆菌感染后会在宿主体内大量增殖,从而破坏宿主的免疫稳态,产生大量炎性因子,引起严重的炎症反应,进而引起仔猪出现脑膜炎等临床症状㊂本研究从表观遗传调控的角度出发,以实时荧光定量P C R 检测4个候选基因的m R N A 表达水平,采用B S P 或M S P 方法检测4个基因D N A 甲基化水平在副猪嗜血杆菌感染前后的变化,并将基因表达与D N A 甲基化进行关联分析,以期从D N A 甲基化修饰的角度来解释副猪嗜血杆菌感染过程中相关功能基因的表观调控规律,为进一步揭示副猪嗜血杆菌感染引起脑膜炎的致病机理奠定一定理论基础㊂同时,本研究首次将M S P 和B S P 方法结合,用于副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中D N A 甲基化水平检测,方法上具有一定灵活性㊂L Y P D 1是淋巴细胞抗原-6(L y 6)/尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u P A R )超家族的一员,是G P I锚定的膜蛋白[15];也有报道证实L Y P D 1是一种新型的抗血管生长因子[16]㊂M a s u d a 等[17]研究发现,人心脏成纤维细胞表达的L Y P D 1在体外培养时可7561中国畜牧兽医51卷抑制内皮血管网络形成,并通过短干扰R N A(s h o r t i n t e r f e r i n g R N A,s i R N A)干扰和外源添加重组L Y P D1证明了L Y P D1在心脏中的抗血管生成特性㊂此外,转录因子G A T A6可通过调控L Y P D1基因的表达来调节其抗血管生成特性[18]㊂本研究中,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织L Y P D1基因D N A甲基化水平极显著上调,结合实时荧光定量P C R结果可推测该基因的m R N A表达水平与其上游D N A甲基化呈现反向关联㊂由于L Y P D1基因在血管生成方面的重要作用,后期将重点围绕该基因在猪或小鼠脑微血管内皮细胞中进行功能验证㊂P I T P NM1属磷脂酰肌醇转移蛋白家族(P I T P s)成员之一,是一种多结构域蛋白[19],有报道称,在乳腺癌发生中P I T P NM1可增强乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中的上皮-间充质转化[20]㊂K a b a 等[21]研究证明,P I T P NM1基因编码的磷脂酰肌醇转移蛋白R d g BαⅠ(也称N i r2蛋白)可以维持在吞噬过程中启动肌动蛋白细胞骨架重塑的信号,推测该基因可能与脑部血脑屏障相关㊂本研究中,副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中P I T P NM1基因D N A 甲基化水平显著上调,结合实时荧光定量P C R结果可推测该基因的m R N A表达水平与其上游D N A 甲基化呈现反向关联㊂后期拟以猪或小鼠脑微血管内皮细胞为模型,探究P I T P NM1在副猪嗜血杆菌感染过程中对血脑屏障的保护作用,以及利用C R I S P R-C a s9技术对P I T P NM1基因差异甲基化区域进行定点替换,探究该基因D N A甲基化差异对血脑屏障功能的影响㊂S Y P即突触素,包含4个跨膜结构域和细胞质的N-端和C-端,是蛋白互作的主要位点,参与突触囊泡运输和神经递质的释放[22],可以反映突触传递和突触可塑性[23]㊂最新研究表明,S Y P基因多态性与注意力缺陷多动障碍(A D H D)具有相关性[24]㊂本研究中,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织S Y P基因D N A甲基化水平具有上调趋势,结合实时荧光定量P C R结果可推测该基因的m R N A表达水平与其上游D N A甲基化呈现反向关联㊂此外,S Y P基因目的片段内C p G位点分布较少,副猪嗜血杆菌感染前后仔猪脑组织中D N A甲基化频率无显著差异,但其m R N A表达水平极显著下调,说明该基因m R N A表达水平可能不仅受D N A甲基化水平变化的调节,亦有可能受其他因素如转录因子㊁组蛋白修饰或非编码R N A等联合调控㊂A C V R1B编码激活素A1B型受体,为生长转化因子β(T G F-β)超家族成员,已被证明可以通过改变细胞因子分泌㊁诱导一氧化氮产生和调节免疫细胞活性来调节炎症反应[25],在早期胚胎发育与组织器官形成㊁免疫监督等过程中发挥重要作用㊂Y u k i等[26]研究发现,A C V R1B/T G F-β/A C V R1C 受体信号传导对卵丘细胞的正常发育和卵母细胞发育能力具有重要作用㊂本研究中,副猪嗜血杆菌感染后仔猪脑组织A C V R1B基因D N A甲基化水平无显著变化,结合实时荧光定量P C R结果可推测该基因的m R N A表达水平可能与其上游D N A甲基化水平没有直接关联㊂此外,在副猪嗜血杆菌感染前后仔猪脑组织A C V R1B基因均呈现极低水平的D N A甲基化,且具有明显的位点差异,说明对于同一基因而言,即使总体D N A甲基化频率不变,发生D N A甲基化的C p G位点也是随机的,推测甲基化位点位置上的差异可能对基因表达具有一定调控作用,后期可针对这一假设进行验证㊂4结论本研究成功将B S P和M S P方法应用于基因的D N A甲基化水平检测,结合基因m R N A表达结果可推测,除A C V R1B基因外,L Y P D1㊁P I T P NM1和S Y P基因在副猪嗜血杆菌感染仔猪脑组织中m R N A表达和D N A甲基化呈反向关联,说明副猪嗜血杆菌感染后D N A甲基化以不同的方式调控候选基因的表达㊂研究结果为进一步探究副猪嗜血杆菌引起仔猪脑膜炎的表观遗传调控机制提供理论依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] C A O Q,F E N G F,WA N G H,e ta l.H a e m o p h i l u sp a r a s u i s C p x R A t w o-c o m p o n e n t s y s t e m c o n f e r sb ac t e r i a l t o l e r a n c e t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s e s a n dm a c r o l i d e r e s i s t a n c e[J].M i c r o b i o l o g i c a l R e s e a r c h,2018,206:177-185.[2] R I B E I R OSGF,Z A N O L L IM L,C A B R E R A M CE,e t a l.S e r o t y p i n g a n d a n t i m i c r o b i a l s u s c e p t i b i l i t yp r o f i l i n g o f G l a e s s e r e l l a p a r a s u i s i s o l a t e d f r o md i se a s e d s w i n e i nB r a z i l[J].P a t h o g e n s,2022,11(12):1443.[3] Z H O U Y Y,WA N G C,Y U A NJ,e ta l.C o m p a r a t i v et r a n s c r i p t o m i c a n a l y s e s o f H a e m o p h i l u s p a r a s u i sr e v e a l 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鸡马立克病肺组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１２):１５０~１５５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１２.０２０收稿日期:２０２３－０２－１３基金项目:山东省重点研发计划项目(２０２２ＣＸＧＣ０１０６０６ꎬ２０１９ＧＮＣ１０６０８２)ꎻ山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０２０ＭＣ１７５)作者简介:李艳兰(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事噬菌体研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:２０８０４４２９７７＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:李玉保(１９７８ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为动物分子病理学ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｙｕｂａｏ＠ｌｃｕ.ｅｄｕ.ｃｎ鸡马立克病肺组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析李艳兰ꎬ祝希辉ꎬ王志伟ꎬ庞喆羽ꎬ李玉保(聊城大学农学与农业工程学院ꎬ山东聊城㊀２５２０５９)㊀㊀摘要:为探讨马立克病毒(ＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓꎬＭＤＶ)与肿瘤发生㊁发展的关系ꎬ本研究建立了鸡马立克病(ＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅꎬＭＤ)模型ꎬ并利用病理组织学㊁免疫组织化学㊁荧光定量ＰＣＲ㊁酶联免疫吸附(ＥＬＩＳＡ)等方法测定了肿瘤相关蛋白热休克蛋白６０(ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６０ꎬＨＳＰ６０)在鸡肺脏组织内的定位及转录水平和含量的动态变化ꎮ结果显示ꎬＨＳＰ６０在攻毒组鸡肺脏肿瘤细胞的细胞质内强表达ꎬ试验周期内攻毒组ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ转录水平极显著高于对照组(Ｐ<０.０１)ꎬ总体呈开口向下的抛物线型ꎬ即７~２８日龄间持续升高ꎬ２８日龄达到最高值ꎬ分别为空白对照组和疫苗对照组的１.３９倍和１.４４倍ꎬ之后降低ꎻＨＳＰ６０含量７~２８日龄攻毒组极显著高于空白对照组(Ｐ<０.０１)ꎬ３５日龄后两者间差异不显著ꎮ该结果为进一步研究ＨＳＰ６０在肿瘤发生过程中的生物学作用奠定了基础ꎮ关键词:马立克病ꎻ热休克蛋白ꎻ病理组织学ꎻ免疫组织化学中图分类号:Ｓ８５８.３１７.４:Ｑ７８㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１２－０１５０－０６ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＨｅａｔＳｈｏｃｋＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＬｕｎｇｏｆＣｈｉｃｋｅｎｓＩｎｆｅｃｔｅｄｂｙＭａｒｅｋｓＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓＬｉＹａｎｌａｎꎬＺｈｕＸｉｈｕｉꎬＷａｎｇＺｈｉｗｅｉꎬＰａｎｇＺｈｅｙｕꎬＬｉＹｕｂａｏ(ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｃｈｏｏｌꎬＬｉａｏｃｈｅｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬｉａｏｃｈｅｎｇ２５２０５９ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ(ＭＤＶ)ａｎｄｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅ￣ｓｉｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬａｃｈｉｃｋｅｎＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅ(ＭＤ)ｍｏｄｅｌｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬａｎｄｔｈｅｌｏｃａｌｉｚａ￣ｔｉｏｎꎬｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｔｕｍｏｒ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６０(ＨＳＰ６０)ｉｎｃｈｉｃｋｅｎｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａ￣ｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｅｎｚｙｍｅ￣ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)ｍｅｔｈｏｄｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＨＳＰ６０ｗａｓｓｔｒｏｎｇｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆｃｈｉｃｋｅｎｌｕｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｔａｋｅｄｏｗｎｇｒｏｕｐ.ＴｈｅＨＳＰ６０ｍＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｔａｋｅｄｏｗｎｇｒｏｕｐｗａｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｄｕｒｉｎｇｔｈｅｔｅｓｔｃｙｃｌｅ(Ｐ<０.０１)ꎬａｎｄｓｈｏｗｅｄａｎｏｖｅｒａｌｌｐａｒａｂｏｌｉｃｐａｔｔｅｒｎｗｉｔｈａｄｏｗｎｗａｒｄｏｐｅｎｉｎｇꎬｎａｍｅｌｙꎬｃｏｎｔｉｎ￣ｕｅｄｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｄｕｒｉｎｇ７ｔｏ２８ｄａｙｓｏｆａｇｅꎬａｎｄｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｔｔｈｅ２８ｄａｙｓｏｆａｇｅꎬｗｈｉｃｈｗａｓ１.３９ａｎｄ１.４４ｆｏｌｄｓｏｆｔｈａｔｏｆｔｈｅｂｌａｎｋａｎｄｖａｃｃｉｎｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬａｆｔｅｒｔｈａｔꎬｉｔｄｅｃｒｅａｓｅｄ.Ｔｈｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＳＰ６０ｗａｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｔｈｅｔａｋｅｄｏｗｎｇｒｏｕｐｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｆｒｏｍ７ｔｏ２８ｄａｙｓｏｆａｇｅ(Ｐ<０.０１)ꎬａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｆｔｅｒ３５ｄａｙｓｏｆａｇｅ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅｏｆＨＳＰ６０ｉｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅꎻＨｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎꎻＨｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎻＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ㊀㊀马立克病(ＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅꎬＭＤ)是由马立克病毒(ＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓꎬＭＤＶ)血清Ⅰ型毒株引起的病毒性㊁接触性及传染性恶性肿瘤增生性疾病[１]ꎮＭＤＶ多为水平传播ꎬ致病率和致死率极高ꎬ给全球禽养殖业带来巨大经济损失[２]ꎮ在病毒引发肿瘤的疾病中ꎬ马立克病是可通过疫苗有效控制的成功典范[３]ꎬ作为病毒导致肿瘤的理想模型ꎬ受到病毒界㊁医学界㊁兽医界等的广泛关注ꎮ热休克蛋白(ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＨＳＰｓ)是生物体内广泛存在的一类热应激蛋白[４]ꎬ根据大小和功能可分为ＨＳＰ１１０㊁ＨＳＰ９０㊁ＨＳＰ７０㊁ＨＳＰ６０以及小分子ＨＳＰ等家族[５]ꎬ每个ＨＳＰ家族由多个蛋白成员组成ꎬ随着研究的深入ꎬ将会有新的ＨＳＰｓ被发现并归入相应蛋白家族ꎬ或自成一族ꎮ在细胞受到冷㊁热[６]㊁病原体[７]㊁运输[８]㊁化学[９]等刺激时ꎬＨＳＰｓ含量会发生变化ꎬ以维持细胞内环境稳定[１０]ꎻ其还可与多种蛋白质结合ꎬ维持机体的正常生理过程ꎮＨＳＰｓ是一种肿瘤标志物ꎬ与肿瘤的发生和转移息息相关[１１－１３]ꎬ在肿瘤细胞中呈现持续的高诱导表达[１４]ꎬ抑制肿瘤细胞凋亡ꎮ在ＭＤＶ引发肿瘤的过程中ꎬＨＳＰ６０在肝脏㊁肾脏中表达量显著升高ꎬ且主要在细胞质中表达ꎬ暗示其对肿瘤细胞的增殖发挥重要作用ꎬ但其在肺组织肿瘤细胞内的定位和转录表达水平尚未见报道ꎮ本研究通过给ＳＰＦ鸡群感染ＭＤＶ建立ＭＤ肿瘤模型ꎬ利用病理学㊁免疫组织化学㊁ＥＬＩＳＡ等方法ꎬ动态研究肺脏内肿瘤的发生和生长过程ꎬ以及ＨＳＰ６０在肺脏组织内的定位及转录㊁表达水平ꎬ为进一步阐释ＨＳＰ６０在肿瘤发生㊁发展过程中的生物学作用奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１日龄ＳＰＦ雏鸡购自山东省农业科学院家禽研究所ꎻＭＤＶ毒株(ＭＤＶ－ＲＢ１Ｂ)由山东农业大学崔治中教授惠赠ꎻＨＶＴ马立克病冷冻苗购自南京乾元浩生物股份有限公司ꎻＨＳＰ６０单克隆抗体购自加拿大Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ生物技术公司ꎻ免疫组织化学(生物素－亲和素)检测试剂盒购自美国ＤＡＫＯ公司ꎻＨＳＰ６０抗体酶联免疫检测试剂盒购自武汉华美工程有限公司ꎮ１.２㊀试验设计及方法将１４０只１日龄ＳＰＦ雏鸡随机分为３组ꎬ分别为攻毒组(５０只)㊁空白对照组(４５只)和疫苗对照组(４５只)ꎬ各组隔离饲养ꎬ自由采食和饮水ꎮ攻毒组皮下注射ＭＤＶ(ＭＤＶ－ＲＢ１Ｂ)(１２００ＰＦＵ)ꎬ疫苗对照组进行常规ＭＤ疫苗注射免疫ꎬ空白对照组皮下注射等量生理盐水ꎮ每日观察鸡群状态并记录发病和死亡数量ꎬ分别于７㊁１４㊁２８㊁３５㊁４２㊁７０㊁８６日龄剖杀鸡只ꎬ每次３只ꎬ观察肺脏病理变化ꎬ并取新鲜肺脏组织ꎬ一份于４％多聚甲醛中固定ꎬ用于病理组织学及免疫组织化学检测ꎻ两份经液氮速冻后－８０ħ冰柜保存ꎬ用于荧光定量ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ检测ꎮ１.３㊀检测指标及方法１.３.１㊀病理组织学检测㊀取固定好的肺脏组织ꎬ修整为立方体ꎬ浸蜡ꎬ冷却后切成４μｍ厚的连续切片ꎬＨＥ染色ꎬ光学显微镜下观察病理变化并拍照记录ꎮ１.３.２㊀免疫组织化学检测㊀取上述固定好的肺组织制作石蜡切片ꎬ经二甲苯脱蜡㊁孵育㊁封闭后ꎬ加入ＨＳＰ６０单克隆抗体(１ʒ５０稀释)４ħ孵育过夜ꎬＰＢＳ替代抗体为阴性对照ꎻＴＢＳ洗涤后按照试剂盒操作进行显色ꎬ甘油明胶封片后在光学显微镜下观察病理变化并拍照记录ꎮ阴性对照正常染色的前提下ꎬ组织切片内出现棕红色颗粒则判定为阳性ꎮ１.３.３㊀荧光定量ＰＣＲ检测㊀设计合成鸡ＨＳＰ６０和ＧＡＰＤＨ特异引物ꎬ荧光定量ＰＣＲ法检测其在鸡肺脏内的ｍＲＮＡ转录水平ꎬ根据文献[１５]方法进行操作ꎬ每个样品３个重复ꎬ引物信息见表１ꎮ㊀㊀表１㊀引物信息引物名称序列(５ᶄ－３ᶄ)产物长度/ｂｐＨＳＰ６０－ＦＨＳＰ６０－ＲＴＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＣ２１０ＧＡＰＤＨ－ＦＧＡＰＤＨ－ＲＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＡＣＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＧＴＧＡＴ２３０１５１㊀第１２期㊀㊀㊀李艳兰ꎬ等:鸡马立克病肺组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析１.３.４㊀ＥＬＩＳＡ检测㊀按照鸡ＨＳＰ６０检测试剂盒说明书进行操作ꎬ记录标准品以及检测样品的ＯＤ值ꎮ根据标准品ＯＤ值绘制标准曲线ꎬ结合标准曲线和样品ＯＤ值计算样品中ＨＳＰ６０含量ꎬ并用ＳＰＳＳ１７.０软件进行ｔ检验分析ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀试验模型建立攻毒组在１~２１日龄间有４只雏鸡死亡ꎬ２１日龄后逐渐发病ꎬ病鸡厌食㊁扎堆㊁精神委顿ꎬ陆续死亡ꎮ１４日龄剖杀鸡只可见肺脏表面有大小不等的灰白色结节ꎬ７０日龄剖杀可见肺脏已被肿瘤组织覆盖ꎬ解剖后发现肿瘤组织表面凹凸不平ꎬ红黄色相间ꎮ空白对照组㊁疫苗对照组鸡群精神状态正常㊁无死亡ꎬ剖检结果亦正常ꎮ结合３组鸡群状态㊁死亡情况和剖检结果ꎬ初步判断已成功建立鸡ＭＤ肿瘤模型ꎮ２.２㊀肺脏病理组织学检测１４日龄后攻毒组鸡肺脏组织内可见大量的淋巴样细胞浸润(图１Ａ)ꎬ３０日龄剖杀可见肿瘤细胞在肺脏内呈局灶性或弥漫性生长(图１Ｂ)ꎮ空白对照组肺组织内未见肿瘤细胞生长(图１Ｃ)ꎮＡ:１４日龄攻毒组ꎻＢ:３０日龄攻毒组ꎻＣ:空白对照组ꎮ图１㊀肺脏病理组织学检测结果２.３㊀肺脏免疫组织化学检测与分析检测结果(图２)显示ꎬ攻毒组ＨＳＰ６０蛋白主要分布在肿瘤组织及肿瘤细胞的细胞质内ꎬ肿瘤组织周边的肺细胞内表达量较低ꎻ阴性对照未见阳性信号ꎮＡ:攻毒组ꎻＢ:空白对照组ꎮ图２㊀肺脏免疫组织化学检测结果２.４㊀肺脏组织ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ转录水平动态变化与分析ＨＳＰ６０标准曲线为ｙ＝－３.３９４ｘ＋４９.４７９ꎬ一致系数Ｒ２＝０.９９７ꎻＧＡＰＤＨ标准曲线为ｙ＝－３.３１５ｘ＋４７.８０９ꎬＲ２＝０.９９６ꎮ两条标准曲线的斜率都接近理想值ꎬ一致系数接近１.０００ꎬ可实时反映目的产物的扩增ꎬ可用于ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ转录水平的检测(图３)ꎮ不同日龄鸡肺脏ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ相对于ＧＡＰ￣ＤＨ的转录水平见图４ꎬ在整个试验周期内ꎬ攻毒组ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ转录水平极显著高于空白对照组和疫苗对照组(Ｐ<０.０１)ꎻ７~２８日龄间转录水平持续升高ꎬ２８日龄时达到最高ꎬ分别为空白对照组和疫苗对照组的１.３９倍和１.４４倍ꎻ２８日龄后水平开始降低ꎮ两对照组ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ转录水平变化趋势稳定ꎬ且两组间无显著差异ꎮ２５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图３㊀ＧＡＰＤＨ(Ａ)和ＨＳＰ６０(Ｂ)荧光曲线同一日龄柱上不同大写字母表示差异极显著(Ｐ<０.０１)ꎬ不同小写字母表示差异显著(Ｐ<０.０５)ꎬ下图同ꎮ图４㊀肺组织ＨＳＰ６０ｍＲＮＡ转录水平动态变化２.５㊀ＨＳＰ６０含量在肺组织中的动态变化与分析按ＨＳＰ６０检测试剂盒说明书操作制作标准曲线ꎬ构建标准曲线方程为ｙ＝－４.６３８ｘ＋８.９６３９ꎬ计算肺脏中ＨＳＰ６０含量ꎬ结果见图５ꎮ在整个试验周期内ꎬ攻毒组ＨＳＰ６０含量始终高于空白对照组ꎬ７~２８日龄攻毒组含量极显著高于空白对照组(Ｐ<０.０１)ꎬ３５日龄后两者间无显著差异ꎮ图５㊀肺脏中ＨＳＰ６０含量动态变化３㊀讨论与结论攻毒组鸡１４日龄开始出现精神委顿㊁呆顿㊁扎堆等临床症状ꎬ最后消瘦衰竭而死ꎬ剖检可见肺脏等组织器官出现淋巴肿瘤ꎬ肿瘤呈现大小不一㊁界限分明㊁灰白色㊁质坚而致密等特征ꎮ随着日龄增加ꎬ肿瘤细胞呈浸润性生长ꎬ病鸡肺部被肿瘤细胞覆盖ꎬ肺部正常组织结构被明显破坏ꎮ疫苗对３５１㊀第１２期㊀㊀㊀李艳兰ꎬ等:鸡马立克病肺组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析照组和空白对照组均未见临床症状ꎬ剖检未见病理异常ꎬ证明已经成功建立鸡马立克病肿瘤模型ꎮ正常情况下ＨＳＰ６０存在于线粒体中ꎬ与ＨＳＰ１０和线粒体内ＨＳＰ７０相互作用ꎬ在维护线粒体功能方面发挥重要作用[１６]ꎬ但在应激或病理条件下ꎬＨＳＰ６０会在胞浆内聚集ꎬ对疾病种类和肿瘤的发生发展具有一定的指示作用[１７]ꎮ众多文献[１８－２２]报道ＨＳＰｓ在不同类型的肿瘤组织中异常表达ꎬ且ＨＳＰ６０与肿瘤细胞的恶性发展密切相关ꎮ在多种肿瘤细胞中ꎬＨＳＰ６０可与ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－３结合ꎬ通过阻止ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ－３活化抑制细胞凋亡[２３]ꎮＧａｍｍａｚｚａ等[２４]报道ＨＳＰ６０作为一种促癌基因ꎬ抑制ｐ５３和ｃａｓｐａｓｅ－３表达ꎬ并通过与其他细胞的蛋白互作激活核因子ｋＢ途径ꎬ促进细胞增殖ꎮ但ＨＳＰ６０在膀胱癌中可通过提高肿瘤细胞的免疫原性ꎬ增强机体对肿瘤细胞的杀伤功能ꎬ抑制肿瘤细胞增长[２５]ꎮ所以ＨＳＰ６０与肿瘤细胞的关系存在争议ꎮ本研究证明ꎬ在ＭＤＶ引发鸡肿瘤的过程中ꎬ病鸡内脏会见大小不等的肿瘤ꎬ肿瘤细胞的发展会导致内脏不同程度损伤和ＨＳＰｓ表达量的变化ꎮＨＳＰ６０蛋白主要分布在肿瘤组织及肿瘤细胞细胞质内ꎬ而在肿瘤组织周边的细胞内表达量较低ꎻ在整个试验周期内ꎬ攻毒组ＨＳＰ６０蛋白转录水平和含量较空白对照组均显著增高ꎬ与肿瘤细胞增殖具有一定的相关性ꎬ有望成为鸡肿瘤疾病发展过程的诊断指标之一ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＡｋｂａｒＨꎬＦａｓｉｃｋＪＪꎬＰｏｎｎｕｒａｊＮꎬｅｔａｌ.ＰｕｒｉｎｅｒｇｉｃｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｕｒｉｎｇＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｉｎｃｈｉｃｋｅｎｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２３ꎬ１３(１):２０４４.[２]㊀ＫａｎｎａｋｉＴＲꎬＧｏｗｔｈａｍａｎＶ.Ｍａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅ:ｔｉｍｅｔｏｒｅｖｉｅｗｔｈｅｅｍｅｒｇｉｎｇｔｈｒｅａｔｉｎＩｎｄｉａｎｐｏｕｌｔｒｙ[Ｊ].ＷｏｒｌｄｓＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ￣ｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２０ꎬ７６(１):９１－９９.[３]㊀ＭａｓｕｄａＹꎬＫａｗａｂａｔａＳꎬＵｅｄｏｉＴꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｌｅａｄｅｒ￣ｌｅｓｓ￣ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｔａｒｇｅｔｉｎｇＥ.ｃｏｌｉａｎｄｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇｇｒａｍ￣ｐｏｓｉｔｉｖｅｐａｔｈｏｇｅｎｓ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｐｅｃ￣ｔｒｕｍꎬ２０２１ꎬ９(１):００１４１２１.[４]㊀ＢａｌａｋｒｉｓｈｎａｎＫＮꎬＲａｍｉａｈＳＫꎬＺｕｌｋｉｆｌｉＩ.Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｒｅｓｓｉｎｐｏｕｌｔｒｙ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].Ａｎｉｍａｌｓꎬ２０２３ꎬ１３(２):３１７.[５]㊀ＪａｖｉｄＨꎬＨａｓｈｅｍｉａｎＰꎬＹａｚｄａｎｉＳꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２２ꎬ１２３(１１):１７０４－１７３５.[６]㊀ＨａｎａｆｉＳＡꎬＺｕｌｋｉｆｌｉＩꎬＲａｍｉａｈＳＫꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｎａｔａｌｔｈｅｒｍａｌｓｔｒｅｓｓａｆｆｅｃｔｓａｃｕｔｅ￣ｐｈａｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓꎬｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ７０ꎬａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｂｒｏｉｌｅｒｅｍｂｒｙｏｓａｎｄｎｅ￣ｏｎａｔｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｅｒｍａｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ１０９:１０３３２８. [７]㊀ＪａｒｉｙａｐａｎＮꎬＢａｔｅｓＭＤꎬＢａｔｅｓＰＡ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗｌｙｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｈｕｍａｎｐａｔｈｏｇｅｎｓｃａｕｓｉｎｇｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓｕ￣ｓｉｎｇＰＣＲ￣ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓｏｎｔｈｅ３ᶄｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ７０(ｔｙｐｅＩ)ｇｅｎｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＮｅｇｌｅｃｔｅｄＴｒｏｐ￣ｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓꎬ２０２１ꎬ１５(１１):ｅ０００９９８２.[８]㊀ＺｈｅｎｇＷＹꎬＬｉｕＢꎬＨｕＷꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｒａｎｓｐｏｒｔｓｔｒｅｓｓｏｎｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｊｕｒｙａｎｄｍａｉｎｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｓｔｅｍｏｆｇｏａｔｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＰｈｙｓｉｏｌｏ￣ｇｙａｎｄＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎꎬ２０２１ꎬ１０５(１):１－１３. [９]㊀ＭａｔｓｕｍｏｔｏＴꎬＩｍａｈｏｒｉＤꎬＯｈｎｉｓｈｉＥꎬｅｔａｌ.Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃ￣ｔｕｒｅｓａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈｖｉａｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｉｎｈｉｂｉ￣ｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｅｎｙｌａｔｅｄｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＨｙｐｅｒｉｃｕｍｅｒｅｃｔｕｍ[Ｊ].Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａꎬ２０２２ꎬ１５６:１０５０９７. [１０]ＫｕｐｐｕｓｗａｍｉＪꎬＳｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒＧＰ.Ｎｕｔｒｉ￣ｓｔｒｅｓｓꎬｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎꎬａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ￣ｒｏｌｅｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｒｅｓｓＣｈａｐｅｒｏｎｅｓꎬ２０２３ꎬ２８(１):３５－４８. [１１]ＳｔｅｔｌｅｒＲＡꎬＧａｎＹꎬＺｈａｎｇＷＴꎬｅｔａｌ.Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ:ｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓ￣ｔｅｍ[Ｊ].ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ９２(２):１８４－２１１. [１２]ＷａｎｇＹꎬＷａｎｇＸ.Ａｐａｎ￣ｃａｎｃｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅａｔ￣ｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ９０ｂｅｔａ１(ＨＳＰ９０Ｂ１)ｉｎｈｕｍａｎｔｕｍｏｕｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２２ꎬ１２(１０):１３７７.[１３]ＰａｈｗａＲꎬＤｕｂｈａｓｈｉＪꎬＳｉｎｇｈＡꎬｅｔａｌ.ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨＳＰ９０ｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔａｎｔｉ￣ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｐａｐｉｌｌａｒｙｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ４１(１):２０８.[１４]ＬｉＹＢꎬＬｉＪꎬＷａｎｇＺＬꎬｅｔａｌ.ＳｔｕｄｙｏｎＨｓｐ９０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｉｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｓｅｒｕｍｏｆｃｈｉｃｋｅｎｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ２０１４ꎬ１３(６):１３５５－１３６２.[１５]裴兰英ꎬ冯秀娟ꎬ李娟ꎬ等.马立克病病毒感染鸡心脏组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析[Ｊ].畜牧兽医学报ꎬ２０１４ꎬ４５(１２):２０１３－２０１８.[１６]ＨｏｔｅｒＡꎬＲｉｚｋＳꎬＮａｉｍＨＹ.Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６０ｉｎｈｅｐａｔｏ￣ｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ:ｉｎｓｉｇｈｔｓａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ７:６０.[１７]ＴａｎｇＹＸꎬＺｈｏｕＹꎬＦａｎＳＱꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｒｏｌｅｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆＨＳＰ６０ｉｎｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙꎬ２０２２ꎬ２０１:１１５０９６.[１８]ＺｈａｎｇＪＬꎬＨｕａｎｇＪＱꎬＦａｎｇＣꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ６０(ＳｐＨＳＰ６０)ｆｒｏｍＳｃｈｉｚｏｔｈｏｒａｘｐｒｅｎａｎｔｉａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｆｏｕｒＳｐＨＳＰｓｄｕｒｉｎｇｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａ￣ｒｉｄｅ(ＬＰＳ)ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｆｉｓｈｅｓꎬ２０２２ꎬ７(３):１３９. [１９]ＶｏｃｋａＭꎬＬａｎｇｅｒＤꎬＦｒｙｂａＶꎬｅｔａｌ.Ｎｏｖｅｌｓｅｒｕｍｍａｒｋｅｒｓ４５１山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ＨＳＰ６０ꎬＣＨＩ３Ｌ１ꎬａｎｄＩＧＦＢＰ￣２ｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＯｎｃｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓꎬ２０１９ꎬ１８(６):６２８４－６２９２. [２０]ＣｈｅｎＹꎬＬｉＸＹꎬＳｈａｏＳＷ.ＴｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆＨＳＰ６０ｉｎｄｉ￣ｇｅｓｔｉｖｅｓｙｓｔｅｍｃａｎｃｅｒｓ:ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗａｎｄｍｅｔａ￣ａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙꎬ２０１９ꎬ６５(１０):１９３７－１９４５. [２１]ＲｉｚｖｉＳＦꎬＨａｓａｎＡꎬＰａｒｖｅｅｎＳꎬｅｔａｌ.Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘ￣ｉｔｙｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ２７ｉｎｃａｎｃｅｒａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ[Ｊ].Ａｒ￣ｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓꎬ２０２３ꎬ７３６:１０９５３７. [２２]ＶａｒｇａＡꎬＮｇｕｙｅｎＭＴꎬＰｅｎｚｅｓＫꎬｅｔａｌ.ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＤ３(ＰＫＤ３)ｒｅｑｕｉｒｅｓＨｓｐ９０ｆｏｒｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｐｒｏｍｏｔｉｏｎｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｃｅｌｌｓꎬ２０２３ꎬ１２(２):２１２. [２３]ＣａｍｐａｎｅｌｌａＣꎬＢｕｃｃｈｉｅｒｉＦꎬＡｒｄｉｚｚｏｎｅＮＭꎬｅｔａｌ.Ｕｐｏｎｏｘｉ￣ｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓꎬｔｈｅａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃＨｓｐ６０/ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ￣３ｃｏｍｐｌｅｘｐｅｒｓｉｓｔｓｉｎｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒ￣ｎａｌｏｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００８ꎬ５２(４):２２１－２２８.[２４]ＧａｍｍａｚｚａＡＭꎬＣａｍｐａｎｅｌｌａＣꎬＢａｒｏｎｅＲꎬｅｔａｌ.Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎａｎｔｉ￣ｔｕｍｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｃｌｕｄｅＨｓｐ６０ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉ￣ｃａｔｉｏｎｓｌｅａｄｉｎｇｔｏｔｈｅＨｓｐ６０/ｐ５３ｃｏｍｐｌｅｘｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｉｎ￣ｓｔａｕｒａｔｉｏｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓꎬ２０１７ꎬ３８５:７５－８６.[２５]ＰａｎＺＰꎬＣｈｅｎＹꎬＰａｎｇＨＹꎬｅｔａｌ.Ｄｅｓｉｇｎꎬｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｄｕａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏ￣ｔｅｉｎ９０/ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ(Ｈｓｐ９０/ｍＴＯＲ)ａ￣ｇａｉｎｓｔｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２２ꎬ２４２:１１４６７４.５５１㊀第１２期㊀㊀㊀李艳兰ꎬ等:鸡马立克病肺组织肿瘤病变与热休克蛋白表达的相关性分析。

某地区生猪主要疫病初步调查

参考文献
［1］曹同，郭水良，娄玉霞，等.苔藓植物的多样性及保护［M］.北京：中国林业出版社，2011.
［2］人民教育出版社，课程教材研究所，生物程教材开发研究中心.生物学（七年级上册）［M］.北京：人民教育出版，2016.
［3］张仙云，张海珠.苔藓植物的茎、叶称为拟茎、拟叶更合适［J］.生物学通报，2002，37（10）：8.
4 结语
教学是一个不断完善的过程，没有完美，只有更好更适合，以上所述，是笔者在苔藓教学实践中的一点探索和经验，希望能够使苔藓植物得到更多的关注，也希望为植物学的教学做出一点有益的补充，更重要的是学生能够在教学中获得更多的知识和思考，为后续学习打下良好的基础。
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2017，23（21）
阳性率最高为 11.1%、33.3%、22.2%、44.4%。
关键词：疫病；病毒核酸；监测
中图分类号 S763.38
文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）21-0104-02
近年来，生猪价格行情看好，广大养殖户养猪积极性
高，但生猪疫病尤其是病毒性传染病始终是影响生猪生
产效益的主要因素，且越来越呈多样化、高发病率、高死
［4］刘献君，张俊超，吴洪富.大学教师对于教学与科研关系的认识和处理调查研究［J］.高等工程教育研究，2010，2：35-42.
［5］陈静，吴薇.教学型大学教师教学科研关系观研究——基于集美大学的调查［J］.高教探索，2012，1：134-140.
表 1 生猪疫病定点监测场设置情况
定点场名称 A B
类别自繁自养自繁自养
年出栏（头） 4100 1000
防疫条件较好一般
定点场名称 C D E F G H I

家畜育种学作业

家畜育种学作业习题一1、什么是家畜？试述家畜的起源2、驯化动物与驯养动物有何区别？3、各种家畜的祖先是哪些野生动物?4、解释种、品种和品系。

5、品种是怎样形成的？6、影响品种形成的因素有哪些？7、家畜品种一般是怎样分类的？8、你知道哪些国内外著名家畜家禽品种？各有何主要用途？习题二1、名词解释基因频率基因型频率遗传漂变数量性状育种值亲缘相关重复力遗传力遗传相关2、家畜的表现性状主要类型有哪些？为什么说数量性状遗传规律的研究对家畜育种是非常重要的？3、数量性状有哪些特点？它的遗传基础是什么？为什么绝大多部分数量性状表现为正态分布？4、如何对数量性状的表型值进行剖分？什么是育种值？为什么家畜育种中要尽量设法利用它进行种畜选择？5、描述群体遗传结构的基本指标有哪些？是如何度量的？简述群体遗传平衡定律？6、影响群体遗传结构的主要因素有哪些？对家畜育种工作有哪些启示？7、造成亲属间相关的主要原因有哪些？如何度量亲属间遗传相关程度？8、描述数量性状遗传规律的遗传参数有哪些？各有哪些主要作用？9、简述重复力估计的原理？为什么多次度量均值可以提高度量的准确性？10、简述遗传力的基本概念和估计原理？为什么说遗传力是一个性状、群体和所处环境的综合体现？11、估计遗传力的主要资料类型有哪些？各自的估计方法和需要满足的条件？12、影响遗传力估计准确性的因素主要有哪些？有什么克服办法？13、造成性状遗传相关的主要原因有哪些？如何对性状表型相关进行剖分？14、估计遗传相关的主要方法有哪些？遗传相关的主要作用？15、研究表明猪应激综合症（PSS）个体是一个常染色体隐性基因Hal n 纯合导致的，表现为对氟烷刺激敏感。

早期是利用氟烷测验仪检测，检测成本较高，而且不能检测出杂合子个体，现在可以利用PCR技术对个体的基因型直接检测。

对某纯种猪群进行PCR检测，其中NN型400头、Nn型80头、nn型20头。

计算基因频率和基因型频率？该猪群在这一基因位点是否处于Hardy-Weinberg平衡？处于平衡状态的基因型频率如何？如果利用氟烷测验淘汰该隐性基因，5代后的基因频率是多少？16、检测178个样本，发现一个基因座上有三个等位基因，分别记为A、B和C，各种基因型的个体数如下，试计算各种基因型频率？三个等位基因的频率？为什么没有检测到CC基因型的个体？检验该样本是否处于平衡状态？基因型AA AB BB AC BC CC个体数17 86 61 5 9 017、某羊场统计了11头羊2周岁到5周岁的毛长（cm），结果如下，试计算毛长的重复力？利用得到的总表型方差计算这4次度量均值的方差。

广东海洋大学340农业知识综合二2013-2015历年考研真题汇编

广东海洋大学340农业知识综合二2013-2015历年考研真题汇编广东海洋大学2022年攻读硕士学位研究生入学考试农业知识综合二（340）A卷（请将答案写在答题纸上，写在试卷上不给分。

本科目满分150分）第一部分动物遗传学（50分）一、名词解释（每题3分，共15分）1．mRNA2．遗传多样性3．遗传漂变4．遗传图谱5．近交衰退二、填空题（每空2分，共10分）1. 经典遗传学的三大基本定律分别为：孟德尔的和律，以及摩尔根的定律。

2. 证明遗传物质是核酸的三个实验：的侵染试验、重建试验。

三、简答题（每题4分，共16分）1．说明杂种优势的含义并做出简单解释。

2．简述分子遗传标记的技术。

3．在一个原来平衡的群体中，对隐性纯合子进行完全选择。

已知在原群体中显性纯合子的频率是0.36，问需要经过几代的选择才能是隐性基因的频率下降到0.005？4．简述动物遗传标记的发展过程。

四、论述题（共9分）图示并解释伴性遗传的原理及其在生产实践中应用有哪些？第二部分动物营养学与饲料学（50分）一、名词解释（每题3分，共15分）1．饲养标准2．能量饲料3．必需氨基酸4. 热增耗（HI）5．理想蛋白二、填空题（每空2分，共10分）1. 与硒元素在动物体内有协同抗氧化作用的一种维生素是。

2. 引起动物白肌病是因为动物缺乏微量元素或维生素E。

3. 判断大豆饼粕生熟程度时要进行性检测。

4. 饲料消化能减去尿能及消化道可燃气体的能量后剩余的能量称为。

5. 使用禾谷类及其它植物性饲料配制家禽饲料时，为第一限制性氨基酸。

三、简答题（每题4分，共16分）1．简述必需脂肪酸的概念、分类及营养生理功能。

2．将下列的饲料原料按国际分类法进行分类：酵母、饲用甜菜、鱼粉、食盐、骨粉、稻草秸秆、大麦、大豆、秕壳、石粉、尿素、麸皮、棉籽粕、苜蓿干草、玉米、血粉、磷酸二氢钙。

3．简述配合饲料的优点。

4．简述动物对饲料的消化方式。

四、论述题（共9分）三聚氰胺能否被动物利用？畜禽采食含有三聚氰胺的饲料后，对肉蛋奶等产品的安全有何影响？第三部分动物生理学（50分）一、名词解释（每小题3分，共15分）1．动物生理学2．动作电位3．基础代谢4．内分泌5．生殖周期二、填空题（每空2分，共10分）1．细胞膜的转运方式有单纯扩散、易化扩散、、出胞和胞吞（入胞）作用。

热激蛋白及其与果蔬的抗冷性关系

热激蛋白及其与果蔬的抗冷性关系张晓勇，陈发河*，吴光斌(集美大学生物工程学院，福建厦门 361021)摘要：热激处理能够减缓果蔬采后低温贮藏时冷害的发生，热激蛋白的诱导是提高果蔬冷害耐受性机理中的一部分。

本文介绍了热激蛋白及其与果蔬抗冷性关系的研究进展。

关键词：热激处理；果蔬；热激蛋白；抗冷性Heat-shock Proteins (HSP) and Relationship of HSP with Chilling Tolerance of Fruits and VegetablesZHANG Xiao-yong ，CHEN Fa-he *，WU Guang-bin(College of Bioengineering ，Jimei University ，Xiamen 361021, China)Abstract ：Heat treatment can reduce the chilling injure of postharvest fruits and vegetables when they are stored at low temperature. The induction of HSPs might be part of the overall mechanism of thermal induction of chilling tolerance in fruits and vegetables. This paper reviewed the recent advances in the studies on HSPs and how they are involved in the induction of chilling tolerance in fruits and vegetables.Key words ：heat-shock treatment ；fruits and vegetables ；heat shock proteins ；chilling tolerance中图分类号：TS255.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)12-0726-05收稿日期：2007-11-14基金项目：福建省自然科学基金项目(B0510026)；福建省科技计划重点项目(2007N0046)作者简介：张晓勇(1982-)，男，硕士研究生，研究方向为果蔬采后生理与贮藏保鲜。

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ＨＰＮＳｓｍＲＡ转录水平的影响不同；ＰＲＡ的转录水平随着应激时间的延长一直呈现出上升的趋势，望ＨＳｍＮ有
成为猪运输应激的判定指标之一。
关键词：热休克蛋白；荧光定量ＰＲ；Ｃ原位杂交；运输应激
中图分类号：８２３￥５．文献标识码：Ａ
Ｄｅｃ．．０２０７
文章编号：０２８（０７００５ — ５１０— ２６２０）６— ８７００
长途运输应激对猪肾脏中ＨＳｓｍＲＡＰＮ转录水平及定位影响
李玉保，恩东，茹茜鲍赵
（．１南京农业大学动物医学院，江苏南京２０９；．１０５２聊城大学农学院，山东聊城２２５）５０９摘要：利用原位杂交和本实验室建立的猪ＨＰＲＡ一步法实时荧光定量ＲＳｓＮｍＴ—ＰＲ技术平台等方法，Ｃ研究长途运输对猪肾脏中Ｈｓ７及ＨＰ０ｍＮＰ。Ｓ９ＢＲＡ转录水平及在组织细胞中定位的影响。经１２４６和１，，，０ｈ的运输应激后，肾组织中ＨＳ，ｍＲＡ的转录水平随着运输应激时间的延长一直呈现出上升的趋势，输应激持续到Ｐ。Ｎ运１，Ｐ。ＲＡ的转录水平升到最高，０ｈ时ＨＳ，ｍＮ为对照组的１．４２倍；ＰｏＲＡ的转录水平在应激初期（２ｈＨＳｇｍＮ１— ）急剧升高（００）到运输应激持续到６ｈ后，Ｐ＜．１，升高不再显著。ＨＰＮＳｓｍＲＡ在肾组织细胞中的定位无肉眼可见的随着应激时间的延长而发生相应变化。ＨＰ。Ｎｓ７ｍＲＡ和ＨｓｇｍＮＰ０ＲＡ在肾小球毛细血管内皮细胞的胞核以及肾小管上皮细胞中呈阳性分布。运输应激可以导致ＨＰＲＡ转录水平的变化，ＳｓｍＮ并且对不同家族的
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第２９卷第６期
２００７年ｌ２月
江西农业大学学报
ＡｃａＡｇｉｕｕａｎｖｒｉｔｉｎｘｅｓｓｔｒｈｒｅＵｉｅｓｔｉＪａｇｉｎｉｃａｓ
Ｖｏ．９．．１２Ｎｏ６
ａｅｂｅｉｎｉｇｏｒｓｒｔｅｓｔｔｇｎｎｆｔａｐｏｔｓｓ．ＨＳ０ａＰ９ｈｎｒＰ７ｎｄＨＳ０ｍＲＮＡｘｒｓｅｒｆｒｎｔｌｙｉｏｉｎｅｕｂｌｓｅｐｅｓｄｐｅｅｅｉｌｎｓｍｅｋｄｙｔｕｅ．ａＴｒｓｏｔｓｒｓａｆｅｔｔｅｔａｓｒｐｉｎｏＰｓｍＲＮＡ，ａｄｔｅｅｅｔｉｉｅｅｅｗｅｎＨＳａｌｅ．ｎａｐｒｔｅｓｃｎａｃｈｎｃｔｏｆＨＳｒｉｎｆｃｓｄｆｒｎｔｂｔｅＰｓｆｍｉｓｈｉＦｕｔｅｍｏｅ，ｔｅｃｎｅｒａｉｎｏＰ７ｍＲＮＡｎｒａｅｏｔｎｏｓｙｆｏｔｅｂｇｎｉｆｔａｓｏｔｓｅｓｒｈｒｒｈｏｃｎｔｔｆＨＳ０ｏｉｃｅｓｄｃｎｉｕｕｌｒｍｅｉｎｎｇｏｎｐｒｔｓ，ｈｒｒｍｉｈｌｍａｋｔｅｅｉｅｓｅｓｇｔｂｅａｈａｌｒｏｄｔｒｎｔｓ．ｍｒ