第八章 DNA序列测定
DNA序列测定word版
第四节DNA序列测定目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等（1977）提出的酶法（双脱氧链终止法）和Maxam（1977）提出的化学降解法。
虽然其原理大相径庭，但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种（或多种）特定的残基，形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。
然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。
高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳亦是DNA序列测定技术的重要基础，可分离仅差一个核苷酸、长度达300~500个核苷酸的单链DNA分子。
DNA序列测定的简便方法为详细分析大量基因组的结构和功能奠定了基础，时至今日，绝大多数蛋白质氨基酸序列都是根据基因或cDNA的核苷酸序列推导出来的。
除传统的双脱氧链终止法和化学降解法外，自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
此外，新的测序方法亦在不断出现，如上世纪90年代提出的杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）等。
一、双脱氧末端终止法测序㈠原理双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。
1980年他又因设计出一种测定DNA(脱氧核糖核酸)内核苷酸排列顺序的方法而与W·吉尔伯特、P·伯格共获1980年诺贝尔化学奖。
桑格是第四位两次获此殊荣的科学家。
其原理是：利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以单链DNA为模板，并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物，根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基团与引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯键。
通过这种磷酸二酯键的不断形成，新的互补DNA得以从5′→3′延伸。
Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸（ddTNP）作为链终止剂。
《微生物学》主要知识点-08第八章微生物的遗传
第八章微生物的遗传概述：遗传(heredity or inheritanc® 和变异(variation)是生物体的最本质的属性之一。
遗传即生物的亲代将一整套遗传因子传递给子代的行为或功能。
变异指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。
基因型(ge no type某一生物个体所含有的全部基因的总和。
表型(phe no type)某一生物所具有的一切外表特征及内在特性的总和。
饰变( modification)不涉及遗传物质结构改变而发生在转录、翻译水平上的表型变化。
8.1遗传变异的物质基础8.1.1三个经典实验1. 经典转化实验：1928年F.Griffith以Streptococcus pneumoniae为研究对象进行转化(transformation)实验。
1944年O.T.Avery等人进一步研究得出DNA是遗传因子。
S strun A2. 噬菌体感染实验：1952年Alfred D.Hershey和Martha Chase用32P标记病毒的DNA，用35S标记病毒的蛋白质外壳，证实了T2噬菌体的DNA是遗传物质。
3.植物病毒的重建实1956年H.Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）与TMV 近源的霍氏车前花叶病毒（Holmes ribgrass mosaic virus,HRV）所进行的拆分与重建实验证明，RNA也是遗传的物质基础。
8.2微生物的基因组结构：基因组（genome是指存在于细胞或病毒中的所有基因。
细菌在一般情况下是一套基因，即单倍体（haploid）;真核微生物通常是有两套基因又称二倍体（diploid ）。
基因组通常是指全部一套基因。
由于现在发现许多非编码序列具有重要的功能，因此目前基因组的含义实际上是指细胞中基因以及非基因的DNA序列的总称，包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能还尚不清楚的DNA序列。
基因测序技术的原理
基因测序技术的原理基因测序技术是一种在基因水平分析生物体遗传信息的方法，它的原理是根据DNA双螺旋结构的特性将DNA分子拉直，并通过生物化学反应和高通量测序技术将DNA序列信息读出。
这项技术不仅可以用于研究基因组学、进化学和生物多样性等领域，还可以用于基于遗传学的医学诊断、治疗和药物研发。
一、DNA序列测定原理DNA序列测定是指将DNA分子中的核苷酸序列一个接着一个地测定出来，从而得到完整的DNA序列信息。
DNA测序技术已经成为生命科学中的重要研究工具，主要应用于基因组学和转录组学等领域，用于解析生物体基因组的组织结构、进化历史、生态适应、遗传多样性和表观遗传学等方面的问题。
DNA序列测定主要包括三个步骤：（1）DNA样本制备DNA样本制备是DNA测序的第一步，它涉及到从体内或环境中提取DNA样本，并对DNA 样本进行精细的纯化和质控处理，以获得高质量的DNA样本。
一般情况下，从组织、细胞、血液、唾液、粪便等不同来源的样本中提取DNA，然后通过DNA纯化操作去除携带有杂质和碎片的DNA。
（2）DNA序列反应DNA序列反应是DNA测序中最核心的一个步骤，其中包含PCR扩增、文库构建、芯片及管道测序和单分子测序等不同方法。
这些方法的原理都是利用化学、物理或计算机技术对DNA分子进行处理和分析，比如在PCR扩增中，通过利用DNA聚合酶的特性，在DNA模板和引物的作用下反复的进行酶促反应，得到大量的DNA共同体。
芯片及管道测序则是基于大规模并行的DNA测序，它可以快速、高通量地获取DNA序列信息。
而单分子测序则是利用纳米技术和光学技术将单个DNA分子在线上逐个测序。
（3）数据分析数据分析是DNA测序的最后一步，主要包括测序数据质控、处理、比对、组装和注释等方面。
数据分析是一个复杂的过程，涉及到多种学科的知识，比如生物信息学、统计学和计算机科学等。
对于DNA测序数据的分析需要采用一系列的软件和工具，以得到更加准确和可靠的结果。
图解DNA测序技术的原理与操作
图解DNA测序技术的原理与操作DNA测序技术是一种快速准确地测定DNA序列的方法，它可以应用于基础研究、医学诊断、辅助决策等领域。
DNA测序技术的原理是通过测量DNA碱基之间的化学键来确定其序列。
DNA测序的发展历程DNA测序技术在20世纪中期开始发展。
当时，科学家们利用毒蕈碱和亚硝酸钠等化学试剂将DNA分解成单个核苷酸分子，然后通过电泳将分子按照大小分开。
通过观察电泳结果，科学家们得以确定碱基序列。
20世纪70年代末，Sanger发明了dideoxy法，使得测序技术得到了重大的进展。
dideoxy法以单链DNA为模板，在该模板上合成一系列新的DNA片段。
这些新的DNA片段不同于模板，因为它们以特定的方式截止于dideoxynucleotide。
这些dideoxynucleotide是无法延伸的，因此一旦它们被合成到了新的DNA片段中，该片段合成就截止了。
这种方法可以验证DNA序列，并且可以在大规模基因组测序任务中运用。
现代DNA测序技术现代DNA测序技术有多种，包括Illumina、Ion Torrent、PacBio和Nanopore等。
其中，Illumina是目前最广泛应用的测序技术之一。
Illumina 测序技术Illumina使用悬浮在小珠子上的（End-Bound）DNAs浓缩在测试管中。
在静止的状况下，铺设在黄色胶片上的DNA接头被拉伸，并用荧光标记的ddNTP来扩展从已接头的DNA的3'端到最近发出的碱基。
这种延长作用结合了测序信号和序列测量。
处理过的簇可以被移动到一个新的位置上，这样就可以在具有更高的通量和更高的密度下进行处理。
Illumina紧凑的读片机设计可容纳数以千亿的簇，因此即便少量的DNA也可以实现高通量测序。
DNA测序技术的操作步骤DNA测序的一般操作步骤包括：样品制备、文库构建、测序准备、碱基测序、数据解读和结果分析等。
具体步骤如下：样品制备：将待检测样品提取DNA，并在PCR扩增过程中对DNA进行分离和纯化，以使其达到测序指标。
DNA序列测定
不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据2片段的这种末端重叠现
象，用计算机定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。 在测序中，小片段DNA只需直接克隆到M13mp或者质粒载体中，
进行双链或单链模板测序。现在常用的M13mp载体一般是成对设计，
如M13mp18与M13mp19都有相同的多克隆位点，但方向相反。同一 待测的DNA片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序。 对于数kb大片段DNA分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克 隆，原位亚克隆，包含上述用2种限制酶消化DNA等。
2）M13mp18和M13mp19载体 （1）mp系列载体特点： ①都是从同一重组M13mp1改造而来。 ②在基因II-IV（500bp，570bp左右）之间有1个多克隆位点 （multiple cloning sites，MCS）可供外源基因插入。 ③该区域（MCS）插入了1小段Ecoli.DNA，有β-半乳糖苷酶基因 （LacZ）的调控序列及其N端146个aa编码信息，它与宿主菌（含LacZ） α-互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶，使平板上底X-gal生色成蓝噬菌斑， 当外源基因插入MCS，破坏了α-互补，几乎无一例外生成无色（白）噬斑。 这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志。 （2）M13mp18和M13mp19是一对载体，它们有相同的13个多克隆 位点，但方向相反。（当RF DNA被两种限制酶切割后，M13mp18和 M13mp19轻易不能重新环化，当连接混合液中含外源匹配末端dsDNA片 段时方闭合成环，这一片段在二者中将以互为相反的两个方向插入。这样 M13mp18正链中含有外源DNA的一条链，而在M13mp19正链中含外源 DNA的另一条链）。所以M13mp18和M13mp19作为一对载体可用同一通 用引物，（从所插入DNA片段任一端开始），测定互为相反两条链的DNA 序列。（并可制备只与外源DNA任意1条DNA链互补的探针）。（分子克 隆P202）。
DNA及测序
在 4 组 独 立 的 DNA 合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4 种 不 同 的 ddNTP， 结果将生成 组核苷酸链 ， 它们将分别（ 随机 ） 终 ， 结果将生成4组核苷酸链 它们将分别（随机） 组核苷酸链， 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上 的位置上。 止于每一个 ，每一个 ，每一个 ，每一个 的位置上。对 组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。 组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 就可读出序列。
引物标记法测序(Dye 引物标记法测序(Dye Primer)
一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。 一个样本， 个反应。 个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。 个反应 个反应中引物序列相同
AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddATP (terminator) AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddCTP AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddGTP AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddTTP
嘧啶（ 和 ） 嘧啶（C和T）序列的测定
用肼处理ss-DNA时，可使嘧啶开环，被哌啶 处理 时 可使嘧啶开环， 取代后而导致磷酸二酯键断裂。若反应在高盐 高盐浓 取代后而导致磷酸二酯键断裂。若反应在高盐浓 度下进行， 与肼的反应受抑制 因而可测得C的 与肼的反应受抑制， 度下进行，T与肼的反应受抑制，因而可测得 的 序列，比较加盐与不加盐反应的结果，就可测定T 序列，比较加盐与不加盐反应的结果，就可测定 的序列。 的序列。 该法的一大优点是不需要模板，引物和DNA聚 该法的一大优点是不需要模板，引物和 聚 合酶。待测DNA链的检测用32p末端标记。 合酶。待测 链的检测用 末端标记。 末端标记
DNA序列测定
Sanger双脱氧核苷酸链 末端终止法
1958年和1980 年诺贝尔化学 奖获得者英国 生物化学家弗 雷德时里克· 桑 格
基本原理：
• 通常 DNA 的复制需要： DNA 聚合酶，单链 DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸 引物， 4 种 dNTP （ dATP 、 dGTP 、 dTTP 和 dCTP ）。聚合酶用模板作指导，不断地将 dNTP 加到引物的 3’-OH 末端（新掺入的脱 氧核苷酸5’-P-OH与前一核苷酸的3’-OH以 磷酸二脂键相连），使引物延伸，合成出新 的互补DNA链。
脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较
• 这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和 4种dNTP（其中一种为α -32P标记），将此 反应物分为4等份，每份内加入一定比例的 一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应 体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶 催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可 形成一种全部具有相同的5’-引物端和一 种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短 不一片段。
G
G T G G T
A TGCAGTA
C
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
双脱氧末端终止法的主要操 作步骤
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
PE Applied Biosystems
化学裂解法
（Maxam－Gilbert
DNA序列分析法）
沃尔特· 吉尔伯特
dna序列测定
三. 四种测序反应液的制备
• 测序反应液组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、
Mgcl2、引物、纯水、四种dNTP，分别在四个反 应管中加入一种相应ddNTP。
dna序列测定
• 自然界中物种(生物)的丰富多样性是 由其生命本质决定的，物种的本质特征 的多样性首先体现在其DNA序列的多样性 (病毒为RNA)，这种千差万别的DNA序列 正是自然界中形态和功能各异的物种的 基石。我们要了解各物种的本质特征， 就必需从其DNA的一级结构上开始。因为 其DNA的一级结构是各物种生理功能的基 础，也是我们对其进行深入研究的出发 点。
测序速度高达200bp/小时，一个样品一次可测定 700多个碱基。
激光
ddCTP ddGTP ddTTP ddATP
DNA测序仪的应用
• 1、基因组测序 • 2、基因突变分析 • 3、基因连锁图谱和指纹图谱 • 4、基因表达 • 5、疾病的基因诊断
DNA测序检测
亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)
末端终止法测序步骤
• 一.测序DNA模板制备 • 二.四种反应液的准备 • 三.引物与模板退火 • 四.延伸反应 • 五.电泳 • 六.读序
DNA测序方法
• 末端终止法：最常用。
• 化学裂解法：研究DNA的二级结构，
与蛋白质的相互作用。
• 杂交测序法：DNA多态性分析。
一. 测序模板的制备
测序可分为单链测序与双链测序，对于 未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA序 列可采用双链测序。但不管单链测序还是双 链测序，其测序反应都一样。
DNA体外合成与序列测定
ddATP ddGTP
OH 3ˊ HO P 5ˊ
ddTTP ddCTP
5ˊP
ddATP
5ˊP
ddGTP
5ˊP
ddTTP
5ˊP
ddCTP
石河子大学生命科学学院
单泳道电泳及信号收集
正极
负极
石河子大学生命科学学院
核酸序列测定
B. Maxam-Gilbert DNA化学降解法
基本原理：
在一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别 得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱 基。
由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链
2024/8/D8 NA，从而读取DNA核12 苷酸序列。
南京石农河业子大大学学生生命命科科学学学学院院
反应：同时加入引物和 模板、DNA聚合酶1、一 种 ddNTP、 以 及 四 种 dNTP（有一种带放射性 标记）。 变性胶电泳分离反应混 合物。 放射自显影术，检测单 链 DNA 片 段 的 放 射 性 带 。 结果判读，从放射性X 光底片上，直接读出 DNA的核酸顺序。
因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记 末端）延续到发生化学降解的位点。
每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组 反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通 过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末 端标记的分子。
鲜明特点是可以探测DNA构象中的蛋白质－DNA相互作用。
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南京石农河业子大大学学生生命命科科学学学学院院
Maxam－ Gilbert化学修饰法的原理
DNA序列测定
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第十章 核酸分子杂交技术
• 概念：具有互补序列的两条核酸单链在 一定条件下，按碱基配对原则形成双链 的过程。
• 探针 待测核酸 杂交分子 • 核酸分子杂交的基本原理 • 核酸分子杂交的基本方法 • 探针的标记
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核酸分子杂交的基本原理
基的引物 – PCR标记法 – 末端标记法
• 探针的纯化
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– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
• 探针的选择和标记 • 杂交 • 杂交结果检测
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Western 杂交印迹法(Western bloting)
• 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血 清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
• 主要步骤：
– 蛋白质样品的制备 – SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳 – 蛋白质的电转移：NC膜 – 靶蛋白的免疫学检测
* 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 * 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 * 显色反应：酶促反应
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液相杂交
• 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中 • RNA酶保护分析法 • 核酸酶S1保护分析法
• 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
DNA自动序列测定
DNA自动序列测定试验［实验原理］DNA测序(DNA sequencing )是对DNA分子的一级结构的分析。
其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP,引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿 3 —5的方向移动，dNTP 按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3'-OH末端。
然而，如果在DNA合成体系中加入双脱氧核苷三磷酸(2' -®dNTP),后者与dNTP 的区别在于脱氧核糖的C3位置缺少-OH,这样，一旦2' ,3d'NTP掺入到DNA链中，由于没有3'-0H，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的引物链在此终止。
DNA自动测序技术也采用了这一基本原理。
即在反应体系中除了加入正常反应所必需的4种dNTP夕卜，还加入了一定比例的4种荧光染料基团标记的2' ,3cTdNTP,链合成过程中，dNTP和荧光染料基团标记的2' ,3ddNTP处于一种竞争状态，结果DNA合成反应的产物是一系列长度不等的具有荧光信号的多核苷酸片段，借助计算机自动数据处理最终得到DNA碱基的排列顺序。
［试剂与仪器］试剂：1. BigDye Termi nator v3.1 Cycle Seque nci ng Kit:⑴Ready Reaction Mix;⑵阳性对照模板和引物；⑶BigDyeTerminator v3.1Sequencing Buffer (5 )。
x2. 目的基因测序引物。
3. 100% 乙醇；125mM 的EDTA；3M 醋酸钠(pH 5.2)；70% 乙醇。
4. Hi-Di甲酰胺仪器：1. MicroAmp? 96-Well Reaction Plate ；2. PCR 扩增仪(Gen eAmp PCR System 9700)；3. 低温高速离心机；4. DNA序列分析仪(ABI公司3130基因分析仪)。
DNA序列测定
DNA序列测定DNA序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。
可分离相差仅1个碱基的300～500bp的核酸分子。
常用测序方法：1. 双脱氧末端终止法1.1.1 测序原理四个反应管中，在DNA聚合酶催化下，以单链DNA为模板，加入单引物、四种dNTP，以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。
双脱氧核苷酸(ddNTP)的5`端-OH 是正常的，而其3`端-OH则没有，因此能与引物延伸链的3`端连接，而不能连接其后继核苷酸，于是引物链的延伸至此结束，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼出所测DNA序列。
1.1.2 测序步骤A 测序DNA模板制备测序可分为单链测序与双链测序，对于未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA序列可采用双链测序。
但不管单链测序还是双链测序，其测序反应都一样。
其中单链模板可通过将待测DNA片段克隆到噬菌体M13中或通过不对称PCR制备；双链模板可通过将待测DNA片段克隆到质粒DNA中或通过PCR扩增制备。
所得模板DNA应通过纯化处理才能用于后继测序反应。
B 测序引物的设计测序所用引物一般采用通用引物，也可根据已有序列设计引物，引物一般有15～30个碱基，应遵循一般引物设计原则a、G+C含量为45～55%。
b、3端最好以A或C结尾，不要以T结尾。
c、引物长度以15～30bp为宜。
d、引物本身不能形成二级结构。
C 四种测序反应液的制备测序反应液组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、纯水、四种dNTP，分别在四个反应管中加入一种相应ddNTP。
标记物：测序反应的标记物有核素和荧光染料。
标记载体有引物、dNTP、ddNTP。
现在应用较多的是将荧光染料标记于引物或ddNTP上，因核素对环境的污染而逐渐应用得比较少。
但也可以不进行标记而采用银染系统检测。
D 延伸反应引物在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补原则逐步在引物的3’端加上四种脱氧核糖核苷酸，四个反应管中的ddNTP随机地与dNTP竟争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，在电泳图谱上形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA梯带。
核酸的序列测定
核酸的序列测定
DNA序列是指携带遗传信息的DNA分子中的A、C、G、T的序列。
分析方法主要有两种，一种是Maxam-Gilbert化学法，另一种是Sanger的双脱氧法。
现在一般都采用后者，其基本原理是：
1．用凝胶电泳分离待测的DNA片段（用作模板）。
2．将模板、引物、4种dNTP、合适的聚合酶置于4个试管，每一试管按精确比例各加入一种ddNTP，用同位素或荧光物质标记。
3．利用ddNTP可特异地终止DNA链延长的特点，4个试管的聚合反应可以得到一系列大小不等、被标记的片段。
4．将4个反应管同时加到聚丙烯凝胶上电泳，标记片段按大小分离，放射自显影后可按谱型读出DNA序列。
在以上两种方法的基础上，通过与计算机技术和荧光技术的结合，发明了自动测序仪。
目前，常用的测序策略是“鸟枪法”，形象地说是将较长的基因片段打断，构建一系列的随机亚克隆，然后测定每个亚克隆的序列，用计算机分析以发现重叠区域，最终对大片段的DNA定序。
1。
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双脱氧酶法测定DNA顺序1 双脱氧酶法测定DNA顺序1 DNA顺序
待测序列 引物及固定端
5，
AT TA G A C G T C C G T G C AAT G C ①
3， 5，
加引物 3， A C G T T A C G
5，A T T A G A C
， G T C C G T G C AAT G C 3
’
donghua
PCR法 法
直接测序 循环测序
直接测序
可以直接从粗制的生物样品中测出目的DNA序列。 可以直接从粗制的生物样品中测出目的DNA序列。 DNA序列 首先通过PCR从样品中扩增出目的DNA 首先通过PCR从样品中扩增出目的DNA PCR从样品中扩增出目的 随后通过电泳将扩增产物的双链DNA同反应剩余 随后通过电泳将扩增产物的双链DNA同反应剩余 DNA dNTP及引物分开 回收PCR扩增的DNA片段。 及引物分开， PCR扩增的DNA片段 的dNTP及引物分开，回收PCR扩增的DNA片段。 对扩增产物进行测序反应。 对扩增产物进行测序反应。测序引物可以是扩 增靶DNA一对引物中的一条，也可以是能与PCR DNA一对引物中的一条 增靶DNA一对引物中的一条，也可以是能与PCR 产物杂交的其他引物。 产物杂交的其他引物。
DNA样品制备 样品制备 待测DNA标记 标记 待测 标记单末端DNA片段的纯化 片段的纯化 标记单末端 碱基特异性化学裂解反应 凝胶高压电泳分离 读取序列
G
G+A
C+T
C T C G C G T A A A C
在一个模板DNA的测序反应中 在一个模板DNA的测序反应中，设置一套四种反 DNA的测序反应中， 应 体 系 ， 每 一种 反 应体 系 除了 加 不同 种 类的 ddNTP外 其余成分相同。 ddNTP外，其余成分相同。 如在A管中除加入dATP、dCTP、dGTP、dTTP外， dATP、 如在A管中除加入dATP dCTP、dGTP、dTTP外 还需加入一定浓度的ddATP 标记） 还需加入一定浓度的ddATP （32P标记） 。 每种反应中可得到一套长度不等的的DNA片段 每种反应中可得到一套长度不等的的DNA片段， 长度不等的的DNA片段， 经变性电泳分离， 放射自显影， 用只读法（ 经变性电泳分离 ， 放射自显影 ， 用只读法 （ 从 下至上）即可从图谱上读出DNA序列。 DNA序列 下至上）即可从图谱上读出DNA序列。
循环测序
循环测序 引物 底物 一条引物 普通PCR 普通PCR 二条引物 脱氧核苷三磷 酸 指数
脱氧核苷三磷酸、 脱氧核苷三磷酸、 双脱氧核苷三磷酸 扩增方式 线性
单引物PCR） 原理（单引物 ）
第一步，PCR扩增的DNA经变性成单链形式 扩增的DNA经变性成单链形式， 第一步，PCR扩增的DNA经变性成单链形式， 第二步， 标记的引物与其中的一条链退火， 第二步，32P标记的引物与其中的一条链退火， 第三步， DNA聚合酶的催化下发生链延伸 聚合酶的催化下发生链延伸－ 第三步 ， 在 DNA 聚合酶的催化下发生链延伸 － 终止反应。 终止反应。 循环30次左右 循环30次左右 30
④ ⑤
3， ddAGGC ACGTTACG 3， ddATCTGCAGGC 5， 5， 5， 5， 5， 5， 5， 5， 5， 5， 5， 5，
⑥ 加在序列
胶之A行 胶之 行
加ddATP/klenow片断 3， ddAATCTGCAGGC 片断
④
⑤
3， ddTGCAGGC 3， ddTCTGCAGGC
化学降解法测序系统中的特异修饰方法 碱基 G A+G C+T C A>C 条件与特点 pH8 硫酸二甲酯对 进行修饰， pH8.0 下 ， 用 硫酸二甲酯 对 N7 进行修饰 ， 使 C8-C9键对碱基裂解具有特异的敏感性 pH2 哌啶甲酸使嘌呤环的 原子质子化， 使嘌呤环的N pH2.0哌啶甲酸 使嘌呤环的N原子质子化，导 致脱嘌呤， 致脱嘌呤，消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 可打开嘧啶环， 肼 可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后 易于除去 在 1 . 5 mol/L NaCl存在下 ， 只有胞嘧啶可与 NaCl 存在下， 存在下 肼发生明显可见的反应 90℃ mol/L NaOH处理 可使A 处理， 在90℃，用1.5mol/L NaOH处理，可使A位点 发生剧烈断裂反应， 发生剧烈断裂反应，而C位点断裂反应微弱
⑥ 加在序列
胶之C行 胶之 行
加ddCTP /klenow片断 片断
单链模板DNA 单链模板 引物 ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
A
C
G
T
5’CAGATTAGCTCAG3 ’ 5’CAGATTAGCTCA3’ ’ 5’CAGATTAGCTC3’ ’ 5’CAGATTAGCT3’ ’ 5’CAGATTAGC3’ ’ 5’CAGATTAG3 ’ ’’ 5’CAGATTA 3’ 5’ 5’CAGATT 3’ 5’CAGAT 3’ ’ 5’CAGA 3’ ’ 5’CAG 3’ ’ 5’CA 3’ ’ 5’C 3’ ’
3，பைடு நூலகம்
，、3，－ 以2，、 ，－双脱氧三 ，、 ，－双脱氧三 磷酸（ ，、 ，、3， 磷酸（ 2，、 ， dNTP) ② 来中止DNA的复制反应 来中止 的复制反应
AC GTTAC G
5，
加[32P]dATP， dTTP， ， ， dGTP ，dCTP 分成四份进行反应
③
双脱氧酶法测定DNA顺序2 双脱氧酶法测定DNA顺序2 DNA顺序
⑥ 加在序列
胶之T行 胶之 行
加ddTTP /klenow片断 片断
3， ddTAATCTGCAGGC 3， ddGC 3， ddGGC 3， ddGCAGGC 3， ddC 3， ddCAGGC 3， ddCTGCAGGC
④
⑤
⑥ 加在序列
胶之G行 胶之 行
加ddGTP /klenow片断 片断
④
⑤
第十章 DNA序列测定 序列测定
主要方法
双脱氧链终止法 PCR法 PCR法 芯片法 化学降解法
双脱氧链终止法 1、基本原理 、
利用DNA在体外合成过程中 利用DNA在体外合成过程中，当双脱氧 DNA在体外合成过程中， 核苷酸参与后，DNA链合成会被终止 链合成会被终止， 核苷酸参与后，DNA链合成会被终止， 参与后 并产生了一系列长度不等， 末端不同 并产生了一系列长度不等 ， DNA片段 经过电泳分离后， 片段， 的DNA片段，经过电泳分离后，即可从 胶片上读出相关的序列。 胶片上读出相关的序列。
变性 退火 延伸／ 延伸／终止 ddNTP
化学降解法
一个末端标记的DNA片段在4组或5 一个末端标记的DNA片段在4组或5组互为 末端标记的DNA片段在 独立的化学反应中得到部分降解 部分降解， 独立的化学反应中得到 部分降解 ， 其中 每一组反应特异性的针对某一种或某一 类碱基。 通过化学降解的分子具有共同 类碱基 。 通过化学降解的分子具有 共同 起点和 不同的终点。 起点 和 不同的终点 。 将各组反应产物进 行电泳， 经放射自显影即可读取其序列。 行电泳 ， 经放射自显影即可读取其序列 。