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REVIEWS索拉非尼的发现和研制：治疗肿瘤的多激酶抑制剂Scott Wilhelm, Christopher Carter, Mark Lynch, Timothy Lowinger, Jacques Dumas,Roger A. Smith, Brian Schwartz, Ronit Simantov and Susan KelleyNature Review Drug Discovery, 2006, Vol 5:835-844摘要：自二十世纪八十年代的分子生物学革命以来，对肿瘤病因学认识的大大提高，推动了特异性抑制肿瘤信号通道的靶向治疗的发现和发展。

过去十年，快速、高流量筛选技术的采用和精炼对这种靶向治疗的发现和发展过程起了极大的促进作用。

在此，我们将描述索拉非尼（最初被命名为BAY 43-9006）的发现和持续发展情况。

它是第一个可靶向作用于Raf激酶并同时影响肿瘤细胞信号系统和肿瘤血管系统的口服多激酶抑制剂。

索拉非尼（多吉美，拜耳制药）的发现全过程- 从前驱化合物的最初筛选至2005年12月通过FDA批准用于晚期肾细胞癌的治疗- 仅用11年全部完成，并在第一项Ⅰ期临床试验开始后5年获得上市批准。

Department of Cancer Research, Bayer Pharmaceuticals Corp., West Haven, Connecticut 06516, USA. Correspondence to S.W. e-mail:scott.wilhelm.b@ doi:10.1038/nrd2130在二十世纪，肿瘤治疗的主要方法是手术、放疗和化疗。

然而，手术治疗晚期转移(Metastasis)肿瘤并不能达到治愈，放疗及化疗亦因其严重的副反应且缺乏辨别正常组织与肿瘤细胞的能力而受限。

此外，这些治疗方法对于固有抵抗放疗化疗的实体瘤-最常见的恶性肿瘤-的疗效有限。

二十世纪的多数时间内，因对促进肿瘤发生的分子机制缺乏了解，药物研发计划主要集中在新的细胞毒化疗药物的开发上。

然而，在二十世纪八十年代，几个小组开始研究对恶变起重要作用的主要分子改变。

由此引发了对诱发肿瘤的致癌基因以及在正常情况下抑制肿瘤发生的抑癌基因的发现1-7，以及对表观遗传异常 (Epigenetic events) 的鉴定，如通过启动子甲基化作用影响细胞生长调节基因而增加个体的肿瘤发生危险度8。

致癌基因常被来自遗传/自发产生获得的活化性突变或与其它基因的融合作用而激活8，或者因基因扩增、启动子活性增强或蛋白稳定性增加而被过度表达8，因此在人类肿瘤生成的基因学机制中具有重要作用。

同时，由失活性基因突变或表观遗传异常（例如，启动子超甲基化）引起的遗传/自发性抑癌基因失活在肿瘤发生中的作用也在这一时期得到认识3,8-9。

这些划时代的发现极大地促进了在分子水平上对肿瘤的理解，后续对致癌基因功能的研究也对于许多主要信号转导通路的认识起到积极作用。

已发现的若干致癌基因主要分为两大类，一类负责编码生长因子（如c-sis）10，持续活化的生长因子受体酪氨酸激酶（RTKs）【如表皮生长因子受体（EGFR，亦被称为ErbB）；ErbB2（亦被称为HER2/neu); 及fms】11-13；另一类编码非受体酪氨酸激酶（如Src）14，这些激酶可以通过普遍存在的由Raf、MEK （MAPK激酶）及ERK（细胞外信号调节激酶）组成的MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）细胞内信号转导通路传递信号。

其它还有一些致癌基因编码MAPK级联中的持续激活因子（Ki-ras, N-ras及B-raf V600E）15-16或此信号转导通路中的核内转录因子(myc, fos and jun)17-19。

这种高度进化保守的MAPK信号通路通过RTKs和Ras将细胞外生长因子信号传导至多个下游的核内效应基因（如转录因子）来调节正常的细胞增殖、存活、分化、粘附及迁移20。

人们越来越清晰地认识到，通过MAPK信号传导通路的异常激活在人类肿瘤的生成中具有重要作用，其中包括多个丰富血管化的实体肿瘤及血液学恶性肿瘤。

自上世纪八十年代以来，随着在分子水平上对肿瘤病因学理解的加深，过去十多年间的药物研发重点已由非特异性的化学疗法转移到理性设计靶向作用于肿瘤特异性信号通路的药物上来。

通过抑制CASE HISTORYREVIEWS肿瘤特异性通路，新的靶向药物有望以其不作用于正常细胞的特点提供比标准化疗方案更好的安全受益，以及更高的疗效指数 (Therapeutic index)。

靶点选择：Raf激酶Raf丝/苏氨酸激酶[A-Raf, B-Raf及Raf1(或C-Raf)]是MAPK 级联的第一类激酶，也是细胞增殖及存活的关键调节因子20。

另外，近来已证明野生型Raf1能够不依赖于MAPK信号系统，而通过与细胞凋亡及抗细胞凋亡调节蛋白的直接相互作用来延长细胞存活时间20-21。

这些不依赖于Raf激酶活性（即除蛋白磷酸化之外的作用机制）的直接Raf通路的失调激活亦可能在肿瘤生成和多种类型实体瘤的进展过程中发挥作用20-21。

~30%的人类肿瘤中可检测到Raf激酶亚型信号通路的失调20。

B-Raf的持续活化可由激活的致癌突变如b-raf V600E突变引起，该突变在黑色素瘤（63%）22及乳头状甲状腺癌（超过50%）中非常普遍23-24。

野生型Raf1在大部分人类实体肿瘤内极度活跃，常由于上游致癌基因ras突变后持续性活化所致；或致癌基因并无突变的情况下，由于上游区生长因子和/或其受体RTKs过表达所引发。

此外，ras致癌基因（主要是k-ras）的持续性活化常见于人类实体肿瘤内，包括90%的胰腺癌，45%的结直肠癌，30%的肝细胞癌（HCC），35%的非小细胞肺癌(NSCLC)，15%的黑色素瘤及10%的肾脏肿瘤25。

不伴有致癌基因突变情况下的Raf1功能极度活化常见于肾细胞癌（RCC）（50%）26和HCC（100%，30/30活检中）27，并且与卵巢癌28及对雄激素不敏感的前列腺癌29的不良预后密切相关。

1989年，Kasid等人证明用特异反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide， ASON）ISIS 5132干扰raf1基因可抑制无胸腺小鼠体内的人类肺、乳腺及卵巢肿瘤异种移植物的生长30。

该发现第一次证明了raf1基因是有效的抗肿瘤靶向作用点。

ISIS 5132是一种20-碱基磷硫酰ASON，被设计用来与raf1的3'-非翻译区序列杂交，引起raf1的降解，减少Raf1蛋白合成30。

有趣的是，ISIS 5132亦可降低Raf1的活性并增强数个人类肿瘤对细胞毒药物及放疗的敏感性30。

拜耳制药与Onyx制药的合作为将Raf1作为抗肿瘤药物设计目标提供了进一步的依据。

他们发现，在带有结肠、胰腺或纤维肉瘤人类肿瘤异种移植物（均带有k-ras致癌基因）的小鼠体内表达一种可以干扰由Raf向ERK信号传递的MEK构建质粒，与对照质粒相比可使小鼠存活时间延长2倍31。

药用化学和组合化学当该项目团队在1994年组建之时，用来鉴定Raf激酶抑制剂的试剂和方法已经具备。

一种用于高通量筛查（High-throughput screening，HTS）和鉴定选择性Raf/ MEK/ERK激酶抑制剂的闪烁迫近分析法（Scintillation proximity assay, SPA）由Glaxo-Wellcome Inc.的McDonald等人开发并证明了该方法的可行性32。

已经证明在带有致癌基因k-ras和/或b-raf突变的肿瘤细胞系内存在增强的Raf-MEK-ERK信号通路。

这类肿瘤细胞系对于实现在体外及动物体内的人类肿瘤异体移植物 (Xenograft) 研究极为重要，以鉴定和选择Raf激酶抑制剂，并为Ⅰ期临床试验的进一步评估和设计提供选择。

因此，研发一种新型Raf1激酶靶向抑制剂并用于治疗肿瘤的必要条件及工具已经具备。

在索拉非尼的药物化学研发之初，肿瘤领域内还没有上市的激酶抑制剂。

然而，在索拉非尼获得批准之前，两个分别靶向作用于Bcr-Abl 和 EGFR的第一代靶向抗肿瘤药物——i m a t i n i b（G l e e v e c;N o v a r t i s）和e r l o t i n i b （Tarcrva;Genentech）——已开始显示临床疗效33-34。

设计用于加速鉴定新型有效的靶向药物的多种技术的开发应用对于这些成功具有决定性作用35。

HTS，如上所述用于鉴定选择性Raf/ MEK/ERK抑制剂，是这些主要方法中的一种；该方法连同组合化学 (Combinatorial chemistry) 一起已成为当代肿瘤药物研发过程的必要组成部分35-36。

另外一个决定性因素是早期ADME （吸收、分布、新陈代谢及排泻）优选法的采用，大大推动了临床前可行性证据的研究37。

1994年，拜耳和Onyx相互合作共同致力于靶向作用于Ras-Raf-MEK-ERK通路的新疗法研发。

使用HTS筛选针对Raf1激酶抑制活性的工作于1995年启动，最终测试了大约200,000种化合物38-39。

经过努力发现了一种有潜力的前驱化合物3-噻吩基尿素1，其Raf1 IC50（半值最大抑制浓度）为17µM （图1）。

图 1. 索拉非尼化学优选概述。

通过高通量筛选鉴定出Raf1抑制剂1(1 Raf1)。

最终生成索拉非尼的药物化学过程在正文中进行了描述。

通过苯环上4-甲基置换作用，使前导物3-噻吩基尿素（复合物 1）的Raf1抑制潜能提高了10倍（达到1.7µM，复合物2）。

然而，采用传统药物化学方法未能鉴定出IC50值在1µM 以下的该3-噻吩基尿素复合物的变构体。

因此，为了进一步探索3-噻吩基尿素前驱化合物的结构-活性关系（Structure-activity relationships, SAR）并改善其Raf1抑制潜能，研究者采用并行合成法技术组构了包括~1,000种该前驱化合物的二芳H HOOOHNNHOOOClCF3NHNHOONNHONN N N N NHNHOSOONHNHOSOO1 Raf1 IC50=17µM3 Raf1 IC50=1.1µM4 Raf1 IC50=230nMBAY 43-9006(sorsfenib)2 Raf1 IC50=17µM基尿素类似物的复合物库。

经过对这个合成物库中有Raf1抑制作用的化合物进行筛选，鉴定出一种Raf1激酶IC50为1.1µM 的新类似物3-氨基-异 唑（复合物3）39-40（图1）。