虚拟实验作业引物设计载体构建
载体构建流程
载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
载体构建
载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的PCR扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。
载体的选择实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。
根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
举例如下：实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。
应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。
引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。
在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。
载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。
常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。
Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。
因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。
翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。
PCR、载体构建及转化
1.目的基因分离(PCR）
2. 载体构建 3. 转化
1.目的基因分离(PCR）
目的基因分离(PCR）
There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polymerases, too. Denaturing, annealing, and extending. Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do. PCR, when you need to detect mutations. PCR, when you need to recombine. PCR, when you need to find out who the daddy is. PCR, when you need to solve a crime
质粒DNA提取
• 采用改良的SDS碱裂解法，结合生物膜选择 性吸附DNA旋转离心柱技术快速纯化质粒 DNA。
质粒DNA提取
准备： 1、检查试剂是否齐全，够用，-20℃预冷的无水乙醇 2、灭菌的小三角瓶、枪及枪头、计时器、塑料插板、记号笔、吸水纸、 盛冰盒 3、计算SII的用量（NaOH,SDS） 步骤： 1、在超净台内将试管中的菌液移入1.5ml离心管中， 2、1000rpm离心1.0min,其间取SI，和RNase A, 3、弃上清，留沉淀 4、每管加入100µl SI和RNase A 0.4µl（RNase A浓度为10.0mg/ml） （可提前算好总的SI和RNase A用量，混匀后分装于离心管中） 5、充分涡旋均匀， 6、计算好SII用量，临时将0.4N NaOH, 2%SDS 等体积混合于灭菌的三角 瓶中， 7、每管加入混合好的SII 200µl，轻轻上下颠倒几次
克隆载体表达载体构建详细版
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
虚拟实验实验报告
篇一：虚拟实验报告第一章文献综述1.1 丙酮酸脱氢酶概述在原核生物中，丙酮酸脱氢酶复合体存在于细胞质中。
在哺乳动物细胞中，丙酮酸脱氢酶复合体主要定位在线粒体上，整个复合体的各个组成酶都是由核基因编码的，在核糖体上表达，转运到线粒体中。
高等植物细胞有两种不同的丙酮酸脱氢酶复合体形式，一种是线粒体丙酮酸脱氢酶复合体，另一种是定位在质体基质中的质体丙酮酸脱氢酶复合体。
目前认为，线粒体丙酮酸脱氢酶复合体催化反应生成的乙酰辅酶a进入三羧酸循环彻底氧化产生能量，而质体丙酮酸脱氢酶复合体催化反应生成的乙酰辅酶a则进入脂肪酸合成途径(bhavnani and wallace, 1990)。
1.2 丙酮酸脱氢酶结构研究原核细胞如大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶复合体由丙酮酸脱氢酶(e1，ec 1.2.4.1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(e2，ec 2.3.1.12)、二氢硫辛酸脱氢酶(e3，ec 1.8.1.4)组成，这三个组成酶都结合了不同的辅助因子，其中e1结合了辅助因子焦磷酸硫胺素（thiamin diphosphate，tpp）和mg2+；e2的赖氨酸残基上共价结合了硫辛酸(lipoic acid)；e3紧密结合了fad分子。
整个复合体由24个e2单体构成核心框架结构，24个e1单体和6个e3单体结合在e2核心框架上(bosma et al., 1982)。
真核生物的丙酮酸脱氢酶复合体除了含有上述的e1、e2、e3外，还有调节它活性的丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶（pyruvate dehydrogenase phosphatase）以及e3结合蛋白（e3 binding protein）。
整个复合体核心框架结构由60个e2单体以及12个e3结合蛋白单体组成，在其周围结合有20－30个e1异型四聚体（22）、6－12个e3同型二聚体、1－2个丙酮酸脱氢酶激酶同型/异型22四聚体的形式存在，和亚单位的分子量分二聚体以及2－3个丙酮酸脱氢酶磷酸酶异型二聚体(kresze and ronft, 1981)。
载体构建步骤
一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。
载体构建程序
载体构建一般程序1、提取拟南芥叶片DNA2、设计引物3、获得目的基因片段4、特定的限制性内切酶酶切5、基因片段连接入质粒6、连接产物转化进感受态细胞中7、摇菌，PCR检测插入基因8、测序各步的具体内容：1、提取拟南芥叶片DNA：Mini-scale genomic DNA extraction from Arabidopsisleaves，野生型拟南芥的叶片的DNA。
2、设计引物：对于用于普通的PCR的基因的引物设计，要符合以下几个条件：（1）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
（2）产物不能形成二级结构。
（3）引物长度一般在15~30碱基之间。
（4）G+C含量在40%~60%之间。
（5）碱基要随机分布。
（6）引物自身不能有连续4个碱基的互补。
（7）引物之间不能有连续4个碱基的互补。
（8）引物5′端可以修饰。
（9）引物3′端不可修饰。
（10）引物3′端要避开密码子的第3位。
如果要用于酶切的基因，除了满足以上的条件外，首先需选择合适的限制性内切酶，需要满足：（1）所要连接的质粒上有该酶切单克隆位点；（2）目的基因中没有该酶切位点；（3）在基因本身的引物5’端加上所选酶切位点识别碱基序列；（4）根据情况在引物5’端或3’端加上保护碱基，一般只在5’端加保护碱基就行了。
3、获得目的基因：使用高保真酶Prime STAR HS DNA Polymerase,以提取的WTDNA为模板做PCR，获得所需目的基因片段。
反应体系：5*prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 10uldNTP Mixture (各2.5mM) 4ul引物1（10uM）1ul引物2（10uM）1ul模板DNA（WT）2ulPrime STAR HS DNA Polymerase（2.5u/ul）0.5ul灭菌水up to 50ul (31.5ul)反应程序：94℃4min;98℃20s;55℃30s;35 cycles72℃70s;72℃10min;12℃-----PCR反应结束后取所有反应液进行琼脂糖凝胶电泳，之后进行胶回收。
载体构建操作流程
载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。
超螺旋结构应至少占到90%。
测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。
2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。
以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。
根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。
3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。
1)称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。
2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。
3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
5)重复操作步骤。
6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。
7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
引物设计和载体构建知识点
引物设计和载体构建知识点引物设计和载体构建是分子生物学中重要且基础的实验技术，它们在基因克隆、基因组编辑等方面起到了不可替代的作用。
本文将对引物设计和载体构建的相关知识点进行介绍。
一、引物设计引物是指在PCR等实验中用于扩增特定DNA片段的短寡核苷酸序列。
一个好的引物设计能够确保PCR扩增的特异性和高效性。
1. 引物长度引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增非特异性产物，而过长的引物则可能降低扩增效率。
2. 引物序列引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，并且避免二聚体和头部稳定性等问题。
同时，还要注意避免引物内部和引物之间的序列相互互补。
3. 引物的Tm值引物的Tm值是指引物与目标DNA片段结合的解离温度。
引物的Tm值应该在50-65摄氏度之间，以确保引物的特异性和高效性。
4. 引物的GC含量引物的GC含量直接影响引物的稳定性和特异性。
过高或过低的GC含量可能导致非特异性扩增产物的生成。
通常情况下，GC含量在40-60%之间较为理想。
二、载体构建载体是指在基因工程中用于携带外源DNA片段并将其导入到宿主细胞中的分子。
载体构建是基因克隆和基因组编辑等实验的基础。
1. 选择合适的载体选择合适的载体是载体构建的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和噬菌体等。
根据实验需要选择合适的载体，例如质粒常用于DNA片段的克隆和表达，而病毒则常用于基因传递和基因治疗。
2. 载体的线性化和限制酶切线性化载体有助于DNA片段的插入和连接。
通过使用适当的限制酶对载体进行切割，生成具有完整黏性末端的线性载体。
3. DNA片段的连接将目标DNA片段与线性载体进行连接，一般采用DNA连接酶或者DNA ligation kit。
连接后的载体能够稳定地携带外源DNA片段。
4. 载体的转化和筛选将构建好的载体导入到宿主细胞中，通过培养基中的选择性抗生素或者其他筛选方法选择具有外源DNA片段的转化子。
总结：引物设计和载体构建是分子生物学实验中的重要环节，它们对于基因克隆、基因组编辑等研究具有重要意义。
载体的构建
载体的构建1、目的基因片段的获得1）查找目的基因相关信息。
一般在这个网站上（/index.jsp拟南芥信息较全）进行搜索，可以查到目的基因的全基因组序列、cDNA序列和CDs序列（根据实验目的进行选择）。
也可以查到与这个基因相关的其它信息。
2）设计引物目的基因序列获得之后，现在就需要进行实验将其片段从DNA或cDNA中扩增出来。
首先设计引物，一般通过primer premier 5.0或DNAMAN软件进行设计。
通过引物的设计，就确定了你将会得到什么样的片段。
所以说，引物设计在载体构建中具有重要作用。
（引物设计方法这里就不提了，以后在实验过程会慢慢学会）引物之前酶切位点的选择：要将目的片段插入到载体中，主要是通过酶切位点的作用。
在载体上存在多克隆位点，目的片段中叶存在酶切位点，这就需要我们进行选择。
primer premier 5.0软件中可以查找到目的片断中不存在的酶切位点，在通过与载体上多克隆位点进行比较，选择所需要的酶切位点。
最后，需要注意的是考虑目的片段插入到载体上后表达会不会移码，否则会改变氨基酸序列。
3）DNA或cDNA的提取4）PCR扩增目的基因利用上述提取的DNA或cDNA进行PCR扩增目的基因片段。
一般的实验步骤如下：模板 3 μl(根据实验情况而定)10×EXTaqbuffer 2 μldNTPMIX 2 μlF(上游引物) 1 μlR（下游引物） 1 μlEXTaq(实验室不同可能会不一样) 0.5 μlddH2O 10.5μl———————20μlPCR仪程序设定是：1)94℃5:00min2)94℃30s3)Tm（退火温度）30s4)72℃时间以片段长度而定（一般1Kb设定1min）5)72℃10min6)4 ℃for ever循环从2）到4），循环数一般为25~30个5）PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳（以目的片段1Kb为例）PCR扩增结束后，接着跑琼脂糖凝胶电泳，然后对有目的条带的胶进行回收。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
《载体构建流程》课件
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
载体构建连接实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本次实验旨在通过载体构建和连接技术，将目的基因与载体成功连接，构建一个含有目的基因的重组质粒。
此实验是基因工程中的重要步骤，对于后续的基因表达、蛋白质纯化等研究具有重要意义。
二、实验原理载体构建连接实验主要包括以下几个步骤：1. 目的基因的获取：通过PCR扩增或化学合成等方法获得目的基因。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，并对其进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：利用DNA连接酶将目的基因与线性化载体连接，形成重组质粒。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：通过PCR、酶切分析等方法筛选出含有目的基因的重组质粒。
三、实验材料1. 实验试剂：PCR引物、dNTPs、DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、碱性磷酸酶（CIP）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心机、超净工作台等。
3. 实验材料：目的基因模板、载体质粒、感受态细胞等。
四、实验方法1. 目的基因的获取：根据目的基因的序列设计PCR引物，进行PCR扩增。
2. 载体的选择与制备：选择合适的载体，用限制性内切酶进行酶切处理，制备线性化载体。
3. 目的基因与载体的连接：a. 将目的基因和线性化载体进行PCR扩增，获得双链DNA。
b. 用Klenow片段或T4 DNA聚合酶将PCR产物进行末端修复，使末端具有3'-羟基。
c. 用CIP处理线性化载体，去除5'-磷酸基团。
d. 将目的基因和线性化载体进行连接反应，加入DNA连接酶。
e. 将连接产物进行PCR扩增，验证连接成功。
4. 重组质粒的筛选与鉴定：a. 将连接产物转化感受态细胞，涂布于含抗生素的琼脂平板上。
b. 在37℃恒温箱中培养过夜。
c. 挑取单菌落进行PCR扩增，验证重组质粒的存在。
d. 对重组质粒进行酶切分析，确认目的基因已插入载体。
TRV载体构建方法
1、引物设计根据所需要沉默的基因序列设计引物。
如需沉默家族基因，设计引物克隆保守片段；如需沉默特异基因，可选择非保守区域或3’非编码区设计克隆片段。
插入片段长度在150 bp – 1000 bp 均可（在300 bp – 800 bp 沉默效果较好，一般为300-800bp,太小则降低沉默效率；太大则不稳定，易造成片段缺失。
沉默单个基因选择目的基因3’端的非保守区域能够保证沉默效果和特异性）。
根据上图中的TRV质粒图谱，在引物两端加入相应的酶切位点(首先对基因片段自身的酶切位点进行分析，要选择基因片段上没有的酶切位点；质粒上的两个酶切位点最好不要紧接在一起的)。
在TRV载体中，正向和反向插入均不影响沉默效果，但一般选用的是正向插入。
2、酶切克隆得到的片段（为了保证片段碱基的准确性，一般可以用Pfu+rTaq）,连接T载体,转化大肠杆菌，摇菌PCR检测后送测。
检测DNA序列比对无误后，摇菌，提质粒，双酶切（要看Takara含酶这本书，找单酶切或是双酶切的Buffer,尽量在前面的引物设计中考虑加入能双酶切的酶切位点）得到目的基因片段（如果片段较小，酶切的质粒浓度相应提高）。
注意：这一步骤可以是连接T载体后，将PCR检测后的阳性克隆选出几个提质粒，同时做几个酶切，将能酶切成功的一个片段回收，并将那个质粒或菌液送测，送测验证序列的正确性。
同时，将pTRV2的空载体质粒转化大肠杆菌，PCR检测，再摇菌，提质粒，双酶切，氯仿、乙醇沉淀（先加水放大体系，1：1加氯仿，用无水乙醇和70%乙醇沉淀）后跑胶，胶回收得到酶切后的pTRV2载体片段。
2、连接方法同连接T-EASY载体3、转化农杆菌将连接产物首先转化大肠杆菌，PCR检测，送测（用pTRV2 引物测序）。
测序无误后，摇菌，提质粒。
将提取的构建好的病毒载体质粒转入农杆菌GV3101（Kan）。
同时也将RNA1质粒转入农杆菌GV3101。
虚拟实验作业引物设计载体构建
生物技术虚拟实验结课论文学院：专业班级：姓名：学号：T e l ：指导老师：1．研究目的抗菌肽被称为天然抗生素，是宿主产生的一类可抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。
与传统抗生素相比，抗菌肽具有广谱抗菌活性、快速杀菌能力、不易产生耐药突变株的优势，同时还可选择性杀伤一些肿瘤细胞。
但是，抗菌肽在自然界中很难获得，其天然提取工艺复杂且资源有限，化学合成也存在成本高、大批量生产困难的不足。
昆虫细胞表达系统具有高等真核生物表达系统的优点，可以对表达蛋白进行翻译后修饰，有效地转录和翻译外源基因，较好地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等加工修饰过程，较客观地表达天然蛋白质的结构并维持其生物学活性。
将重组的杆状病毒系统感染昆虫蛹及幼虫，可使抗菌肽在昆虫的血淋巴中自动富集，简化了收获抗菌肽的过程(Hellers et al. 1991)。
本试验用昆虫杆状病毒表达系统表达抗菌肽Shiva-1a的基因，并对表达产物的抑菌活性进行研究，为选择合适的基因工程的方法高效率表达抗菌肽提供一定的思路，同时也为转基因动物的抗病育种提供候选基因和理论基础。
2．研究流程图3．具体研究方法，步骤并截图说明3.1人类ALR基因mRNA的fasta文件输出打开NCBI的Map Viewer Home网页，如图（1）在列表框中选择nucleotide，然后在文本框中输入我要的目的基因shiva-1a图（1）目的序列：ORIGIN1 ggatccccag tcgacaacga caaaatagta cctcaagctc aacaagcatt ttaggtgtcc61 ttagcttact atttctctgg ctaactgtat gaagccatct atcaccctgt gtgcaattag121 ctcattgtgt agataagaag gtaaaaccat cttgaaacag gaaaccaata tccttcctgt181 ctaatcaaca aatctaaaag atttattctt ttcatctatc tcctcttgcg tttgtccacc241 acaacaggct gcttacaggt tcaggatggt tttgacaaag agaacatttt catgagttac301 ttttgtgtct ccaccccaaa gaggaaaatt tgtttcatac agaaggcgtt cattgtatga361 attaaaactg ccacctaagt gtgggctaac ccgaccaaga gggatttcac ctaaatccat421 tcagtcagtg tatgggggtt taaagaaatt ccagagagtc atcagaagag gaaaaacaaa481 ggtaatgctt tctgccacac aggtagactc tttgaaaata tgtgtaatat gtaaaacatc541 gtgacacccc catattattt ttccagcatt aacagtataa attgcctccc atgctgaaga601 gctgcctatc acccttgcta atcactcctc acagtgacct caagtcctgc aggcatgtac661 agcatgcagc tcgcatcctg tgtcacactg acacttgtgc tccttgtcaa cagcgcaaga721 tctaccatgc cgcgctggcg tctgttccgc cgtatcgacc gtgttggcaa acagatcaaa781 cagggtatcc tgcgtgctgg cccggctatc gctctggttg gcgacgcccg cgcagttggt841 tgagaattcg aatggccatg ggacgtcgag ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg901 gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta aatataaaat961 ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa1021 cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt1081 gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa cattctactc1141 ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccttcagaa ttgctaagtt1201 ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa1261 aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atattctgta acctttataa1321 gtaggcataa cagttataat cataacatac tgttttttct tactccacac aggcatagag1381 tgtctgctat taataactat gctcaaaaat tgtgtacctt tagcttttta atttgtaaag1441 gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg ccttgactag agatcataat cagccatacc1501 acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa1561 cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa1621 taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt1681 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcc//在Send的下拉菜单中作如下选择：如图（9），并点击Create File,待屏幕下方出现文件下载提示时，进行文件的保存，可以将文件以格式txt储存。
载体构建实验方法及步骤
载体构建实验方法及步骤载体构建（vectorconstruction）是分子生物学研究常用的手段之一。
依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
实验步骤1.载体选择：根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
以Nrf2基因序列：1794bp 为例；2.引物设计：引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接。
Nrf2pC1EcoR-F：CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGT TGCCACCNrf2pC1BamH-R：CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCT TCTTGC3.PCR扩增：以小鼠光感受器细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点，1%琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带（1794bp）。
4.载体和目标片段的限制性酶切：质粒载体Plvx-DsRed-monomer-C1和目的基因PCR产物的Ec oRI和BamHI双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2h；1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx-DsRed-monomer-C1酶切大片段和目的基因酶切片段。
5.连接转化：质粒Plvx-DsRed-monomer-C1 EcoRI+BamHI酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应12小时。
取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基，37℃恒温摇床培养50min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100ug /ml Ampicillin抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜。
6.挑取克隆提质粒验证：挑取5个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB 培养液中，300rpm，37℃恒温摇床培养过夜，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行测序验证。
PCR、载体构建及转化
挑菌
准备工作: 1、提前打开37℃摇床，开紫外灯杀菌。 2、灭菌的带盖的刻度试管，试管架，消毒的黄枪头， 镊子，Amp抗性的LB液体培养基。 步骤： 1、将Amp抗性的LB液体培养基分装入试管，每管46ml。 2、用黄色的枪头挑白色的单克隆，连带枪头放入试 管中。 3、盖上试管盖，置摇床中，37℃，170转摇培过夜 （16-18小时）。
1在超净台内将试管中的菌液移入15ml离心管中21000rpm离心10min其间取si和rnase3弃上清留沉淀4每管加入100lsi和rnase04lrnasea浓度为100mgml可提前算好总的si和rnasea用量混匀后分装于离心管中5充分涡旋均匀6计算好sii用量临时将04nnaoh2sds等体积混合于灭菌的三角7每管加入混合好的sii200l轻轻上下颠倒几次dna8插入冰盒中静置5min此时菌液变的清亮粘稠9每管加入siii150l上下颠倒数次此时有白色絮状沉淀出现
引物设计常用软件： DNAstar：序列分析
Primer5.0：引物设计
DNAman：序列比对 在线引物设计： http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
2. 载体构建
T-Vector连接
反应体系： • 2×Ligation Buffer 2.5µl • Inset fraction 1.5µl • T-easy vector 0.5µl • T4-ligase 0.5µl 混匀后置16℃连接0.5- 小时。
蓝白斑筛选：
• 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
•设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型 菌株，无法作用于X-gal产生蓝色物质。 •操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的启动子， 在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色（空载）。 •当外源DNA与含lacz‘的载体连接时，会插入进MCS，这种 重组质粒不再表达α 肽链，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可 分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
载体构建流程
PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的 杂蛋白、离子等会造成酶切困难或星活 性，残余的聚合酶也会填平粘性末端， 造成克隆失败。
• 所以此步对整个分子克隆都至关重要， 可适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也 可以胶回收。
酶切目的基因和载体
酶切注意事项
• 两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切， 切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切 低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要 求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐 浓度要求的。只要其中一种酶需要添加BSA， 则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会 影响任何内切酶的活性。
谢谢！
• 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免 出现星号活性，可通过增加反应体系的总体积 的方法实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
• 通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切 产物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回 收酶切产物连接所得阳性克隆。
• 此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化 的目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序 列干扰。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
经典载体构建流程
载体构建方案
要求：1.构建真核表达体，含有筛选标志；2. 3｀端连接EGFP，5｀端连接SP序列3．每一步构建的详细结果，图表及中间产物；4.包括每一步酶切图谱，aFGF基因片段，基因片段合成的引物，SP片段及其引物，和其他相关中间产物5.详细的实验方法及实验所需的条件，实验报告，测序报告。
以下供参考主要试剂质粒:pUC19SP+质粒(含信号肽SP序列),（SP序列指IL-2受体信号肽序列，signal peptide of human IL-2）pBV220-aFGF质粒(含有aFGF全长基因),BluescriptM13+质粒pCDNA3·1质粒酶DNA限制性内切酶及T4连接酶参考构建方法一：分泌型pCDNA-SP-aFGF真核表达载体的构建pBV220 aFGF用EcoRI+HindIII双酶切下aFGF基因片段后,将其亚克隆至经过同样双酶切的Blue-scriptM13+中,构成BluescriptM13+aFGF;pUC19-SP载体用SmaI+HindIII双酶切,Bluescript M13+aFGF用EcoRI+HindIII双酶切,然后进行连接,补平,再连接,定向克隆形成Bluescript M13-SP-aFGF克隆载体;再利用其多克隆位点,用EcoRI+XhoI双酶切下SP-aFGF,克隆到pCDNA3.1真核表达载体之中。
参考构建方案二:可参考附件文献，通过基因融合得来，搭桥引物见附件参考文献aFGF简介：aFGF是不能分泌的多肽生长因子,不能分泌的原因在于它们的基因序列中不带有信号肽序列。
IL-2受体的信号肽能介导培养的干细胞在体内外分泌表达aFGFHuman mRNA encoding interleukin-2 (IL-2) a lymphozyte regulatory moleculeGenBank: V00564.1FASTAGraphicsGo to:LOCUS V00564 801 bp mRNA linear PRI 07-OCT-2008DEFINITION Human mRNA encoding interleukin-2 (IL-2) a lymphozyte regulatorymolecule.ACCESSION V00564VERSION V00564.1 GI:33780KEYWORDS interleukin; signal peptide.SOURCE Homo sapiens (human)ORGANISM Homo sapiensEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Homo.REFERENCE 1 (bases 1 to 801)AUTHORS Taniguchi,T., Matsui,H., Fujita,T., Takaoka,C., Kashima,N., Yoshimoto,R. and Hamuro,J.TITLE Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2JOURNAL Nature 302 (5906), 305-310 (1983)PUBMED 6403867REFERENCE 2AUTHORS Devos,R., Plaetinck,G., Cheroutre,H., Simons,G., Degrave,W.,Tavernier,J., Remaut,E. and Fiers,W.TITLE Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression inE. coliJOURNAL Nucleic Acids Res. 11 (13), 4307-4323 (1983)PUBMED 6306584FEATURES Location/Qualifierssource 1..801/organism="Homo sapiens"/mol_type="mRNA"/db_xref="taxon:9606"CDS 48..509/codon_start=1/product="interleukin-2"/protein_id="CAA23827.1"/db_xref="GI:33781"/db_xref="GDB:119344"/db_xref="GOA:P60568"/db_xref="HGNC:6001"/db_xref="InterPro:IPR000779"/db_xref="InterPro:IPR009079"/db_xref="InterPro:IPR012351"/db_xref="PDB:1ILM"/db_xref="PDB:1ILN"/db_xref="PDB:1IRL"/db_xref="PDB:1M47"/db_xref="PDB:1M48"/db_xref="PDB:1M49"/db_xref="PDB:1M4A"/db_xref="PDB:1M4B"/db_xref="PDB:1M4C"/db_xref="PDB:1NBP"/db_xref="PDB:1PW6"/db_xref="PDB:1PY2"/db_xref="PDB:1QVN"/db_xref="PDB:1Z92"/db_xref="PDB:2B5I"/db_xref="PDB:2ERJ"/db_xref="PDB:3INK"/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P60568"/translation="MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMI LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT"sig_peptide 48..107ORIGIN1 atcactctctttaatcactactcacagtaacctcaactcctgccacaatgtacaggatgc 61 aactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacctacttcaa 121 gttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttacagatgattt 181 tgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagtttt 241 acatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaac 301 ctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggact 361 taatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgt 421 gtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggattacctttt 481 gtcaaagcatcatctcaacactaacttgataattaagtgcttcccacttaaaacatatca541 ggccttctatttatttaaatatttaaattttatatttattgttgaatgtatggtttgcta 601 cctattgtaactattattcttaatcttaaaactataaatatggatcttttatgattcttt 661 ttgtaagccctaggggctctaaaatggtttcacttatttatcccaaaatatttattatta 721 tgttgaatgttaaatatagtatctatgtagattggttagtaaaactatttaataaatttg 781 ataaatataaaaaaaaaaaa c信号肽序列：atgtacaggatgc aactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt。
载体构建流程v3
DNA重组技术实验原理、方法和步骤实验原理1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
图1 TA克隆原理示意图2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA 尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物技术虚拟实验结课论文学院：专业班级：姓名：学号：T e l ：指导老师：1．研究目的抗菌肽被称为天然抗生素，是宿主产生的一类可抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。
与传统抗生素相比，抗菌肽具有广谱抗菌活性、快速杀菌能力、不易产生耐药突变株的优势，同时还可选择性杀伤一些肿瘤细胞。
但是，抗菌肽在自然界中很难获得，其天然提取工艺复杂且资源有限，化学合成也存在成本高、大批量生产困难的不足。
昆虫细胞表达系统具有高等真核生物表达系统的优点，可以对表达蛋白进行翻译后修饰，有效地转录和翻译外源基因，较好地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等加工修饰过程，较客观地表达天然蛋白质的结构并维持其生物学活性。
将重组的杆状病毒系统感染昆虫蛹及幼虫，可使抗菌肽在昆虫的血淋巴中自动富集，简化了收获抗菌肽的过程(Hellers et al. 1991)。
本试验用昆虫杆状病毒表达系统表达抗菌肽Shiva-1a的基因，并对表达产物的抑菌活性进行研究，为选择合适的基因工程的方法高效率表达抗菌肽提供一定的思路，同时也为转基因动物的抗病育种提供候选基因和理论基础。
2．研究流程图3．具体研究方法，步骤并截图说明3.1人类ALR基因mRNA的fasta文件输出打开NCBI的Map Viewer Home网页，如图（1）在列表框中选择nucleotide，然后在文本框中输入我要的目的基因shiva-1a图（1）目的序列：ORIGIN1 ggatccccag tcgacaacga caaaatagta cctcaagctc aacaagcatt ttaggtgtcc61 ttagcttact atttctctgg ctaactgtat gaagccatct atcaccctgt gtgcaattag121 ctcattgtgt agataagaag gtaaaaccat cttgaaacag gaaaccaata tccttcctgt181 ctaatcaaca aatctaaaag atttattctt ttcatctatc tcctcttgcg tttgtccacc241 acaacaggct gcttacaggt tcaggatggt tttgacaaag agaacatttt catgagttac301 ttttgtgtct ccaccccaaa gaggaaaatt tgtttcatac agaaggcgtt cattgtatga361 attaaaactg ccacctaagt gtgggctaac ccgaccaaga gggatttcac ctaaatccat421 tcagtcagtg tatgggggtt taaagaaatt ccagagagtc atcagaagag gaaaaacaaa481 ggtaatgctt tctgccacac aggtagactc tttgaaaata tgtgtaatat gtaaaacatc541 gtgacacccc catattattt ttccagcatt aacagtataa attgcctccc atgctgaaga601 gctgcctatc acccttgcta atcactcctc acagtgacct caagtcctgc aggcatgtac661 agcatgcagc tcgcatcctg tgtcacactg acacttgtgc tccttgtcaa cagcgcaaga721 tctaccatgc cgcgctggcg tctgttccgc cgtatcgacc gtgttggcaa acagatcaaa781 cagggtatcc tgcgtgctgg cccggctatc gctctggttg gcgacgcccg cgcagttggt841 tgagaattcg aatggccatg ggacgtcgag ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg901 gtgtgacata attggacaaa ctacctacag agatttaaag ctctaaggta aatataaaat961 ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa1021 cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt1081 gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg aggctactgc tgactctcaa cattctactc1141 ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc ccaaggactt tccttcagaa ttgctaagtt1201 ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa1261 aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa ttatggaaaa atattctgta acctttataa1321 gtaggcataa cagttataat cataacatac tgttttttct tactccacac aggcatagag1381 tgtctgctat taataactat gctcaaaaat tgtgtacctt tagcttttta atttgtaaag1441 gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg ccttgactag agatcataat cagccatacc1501 acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa1561 cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa1621 taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt1681 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcc//在Send的下拉菜单中作如下选择：如图（9），并点击Create File,待屏幕下方出现文件下载提示时，进行文件的保存，可以将文件以格式txt储存。
获得目的基因的已知信息。
图（9）3. pFastBac Dual载体genbank文件的输出打开/vector-database/网站，在Search Vector Database 后面输入pFastBac Dual载体名称，点击Search。
会出现多种质粒，然后可以在右边的条件筛选中选择，如图图（10）在新生成的页面中点击sequence超链接，如图（11）图（11）在新生成的页面上Sequence下点击GenBank选项，如图（12）图（12）全选GenBank中的全部信息，并复制到写字板中，并生成.gb文件。
获得载体相关的全部信息。
或者在下面的载体库中直接找步骤如下：1、进入网站/2、点击左下角3、在中输入要搜索的载体名称4、出现如下界面5、点击进入则出现所要载体信息，点击sequence序列：1 TTCTCTGTCA CAGAATGAAA ATTTTTCTGT CATCTCTTCG TTATTAATGT 50 51 TTGTAATTGA CTGAATATCA ACGCTTATTT GCAGCCTGAA TGGCGAATGG 100 101 GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG TGGTTACGCG 150 151 CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT 200 201 TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA 250 251 AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA 300 301 CCCCAAAAAA CTTGATTAGG GTGATGGTTC ACGTAGTGGG CCATCGCCCT 350 351 GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG AGTCCACGTT CTTTAATAGT 400401 GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT CGGTCTATTC 450 451 TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG 500 501 AGCTGATTTA ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT ATTAACGTTT 550 551 ACAATTTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG 600 601 TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC 650 651 CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA 700 701 CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT 750 751 TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT 800 801 TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC 850 851 CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA 900 901 AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC 950 951 AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA 1000 1001 CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG 1050 1051 CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA 1100 1101 CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG 1150 1151 GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT 1200 1201 ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT 1250 1251 TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA 1300 1301 TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC 1350 1351 GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC 1400 1401 GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC 1450 1451 CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG 1500 1501 AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC 1550 1551 TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT 1600 1601 TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC 1650 1651 CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG 1700 1701 AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC 1750 1751 TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA 1800 1801 TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC 1850 1851 AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC 1900 1901 AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC 1950 1951 AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA 2000 2001 GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG 2050 2051 TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT 2100 2101 ACAGCGTGAG CATTGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG 2150 2151 ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG 2200 2201 CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA 22502251 CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC 2300 2301 TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC 2350 2351 TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA 2400 2401 TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA 2450 2451 CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA GCGCCTGATG 2500 2501 CGGTATTTTC TCCTTACGCA TCTGTGCGGT ATTTCACACC GCAGACCAGC 2550 2551 CGCGTAACCT GGCAAAATCG GTTACGGTTG AGTAATAAAT GGATGCCCTG 2600 2601 CGTAAGCGGG TGTGGGCGGA CAATAAAGTC TTAAACTGAA CAAAATAGAT 2650 2651 CTAAACTATG ACAATAAAGT CTTAAACTAG ACAGAATAGT TGTAAACTGA 2700 2701 AATCAGTCCA GTTATGCTGT GAAAAAGCAT ACTGGACTTT TGTTATGGCT 2750 2751 AAAGCAAACT CTTCATTTTC TGAAGTGCAA ATTGCCCGTC GTATTAAAGA 2800 2801 GGGGCGTGGC CAAGGGCATG GTAAAGACTA TATTCGCGGC GTTGTGACAA 2850 2851 TTTACCGAAC AACTCCGCGG CCGGGAAGCC GATCTCGGCT TGAACGAATT 2900 2901 GTTAGGTGGC GGTACTTGGG TCGATATCAA AGTGCATCAC TTCTTCCCGT 2950 2951 ATGCCCAACT TTGTATAGAG AGCCACTGCG GGATCGTCAC CGTAATCTGC 3000 3001 TTGCACGTAG ATCACATAAG CACCAAGCGC GTTGGCCTCA TGCTTGAGGA 3050 3051 GATTGATGAG CGCGGTGGCA ATGCCCTGCC TCCGGTGCTC GCCGGAGACT 3100 3101 GCGAGATCAT AGATATAGAT CTCACTACGC GGCTGCTCAA ACCTGGGCAG 3150 3151 AACGTAAGCC GCGAGAGCGC CAACAACCGC TTCTTGGTCG AAGGCAGCAA 3200 3201 GCGCGATGAA TGTCTTACTA CGGAGCAAGT TCCCGAGGTA ATCGGAGTCC 3250 3251 GGCTGATGTT GGGAGTAGGT GGCTACGTCT CCGAACTCAC GACCGAAAAG 3300 3301 ATCAAGAGCA GCCCGCATGG ATTTGACTTG GTCAGGGCCG AGCCTACATG 3350 3351 TGCGAATGAT GCCCATACTT GAGCCACCTA ACTTTGTTTT AGGGCGACTG 3400 3401 CCCTGCTGCG TAACATCGTT GCTGCTGCGT AACATCGTTG CTGCTCCATA 3450 3451 ACATCAAACA TCGACCCACG GCGTAACGCG CTTGCTGCTT GGATGCCCGA 3500 3501 GGCATAGACT GTACAAAAAA ACAGTCATAA CAAGCCATGA AAACCGCCAC 3550 3551 TGCGCCGTTA CCACCGCTGC GTTCGGTCAA GGTTCTGGAC CAGTTGCGTG 3600 3601 AGCGCATACG CTACTTGCAT TACAGTTTAC GAACCGAACA GGCTTATGTC 3650 3651 AACTGGGTTC GTGCCTTCAT CCGTTTCCAC GGTGTGCGTC ACCCGGCAAC 3700 3701 CTTGGGCAGC AGCGAAGTCG AGGCATTTCT GTCCTGGCTG GCGAACGAGC 3750 3751 GCAAGGTTTC GGTCTCCACG CATCGTCAGG CATTGGCGGC CTTGCTGTTC 3800 3801 TTCTACGGCA AGGTGCTGTG CACGGATCTG CCCTGGCTTC AGGAGATCGG 3850 3851 TAGACCTCGG CCGTCGCGGC GCTTGCCGGT GGTGCTGACC CCGGATGAAG 3900 3901 TGGTTCGCAT CCTCGGTTTT CTGGAAGGCG AGCATCGTTT GTTCGCCCAG 3950 3951 GACTCTAGCT ATAGTTCTAG TGGTTGGCCT ACGTACCCGT AGTGGCTATG 4000 4001 GCAGGGCTTG CCGCCCCGAC GTTGGCTGCG AGCCCTGGGC CTTCACCCGA 4050 4051 ACTTGGGGGT TGGGGTGGGG AAAAGGAAGA AACGCGGGCG TATTGGTCCC 41004101 AATGGGGTCT CGGTGGGGTA TCGACAGAGT GCCAGCCCTG GGACCGAACC 4150 4151 CCGCGTTTAT GAACAAACGA CCCAACACCC GTGCGTTTTA TTCTGTCTTT 4200 4201 TTATTGCCGT CATAGCGCGG GTTCCTTCCG GTATTGTCTC CTTCCGTGTT 4250 4251 TCAGTTAGCC TCCCCCATCT CCCGGTACCG CATGCTATGC ATCAGCTGCT 4300 4301 AGCACCATGG CTCGAGATCC CGGGTGATCA AGTCTTCGTC GAGTGATTGT 4350 4351 AAATAAAATG TAATTTACAG TATAGTATTT TAATTAATAT ACAAATGATT 4400 4401 TGATAATAAT TCTTATTTAA CTATAATATA TTGTGTTGGG TTGAATTAAA 4450 4451 GGTCCGTATA CTCCGGAATA TTAATAGATC ATGGAGATAA TTAAAATGAT 4500 4501 AACCATCTCG CAAATAAATA AGTATTTTAC TGTTTTCGTA ACAGTTTTGT 4550 4551 AATAAAAAAA CCTATAAATA TTCCGGATTA TTCATACCGT CCCACCATCG 4600 4601 GGCGCGGATC CCGGTCCGAA GCGCGCGGAA TTCAAAGGCC TACGTCGACG 4650 4651 AGCTCACTAG TCGCGGCCGC TTTCGAATCT AGAGCCTGCA GTCTCGACAA 4700 4701 GCTTGTCGAG AAGTACTAGA GGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG 4750 4751 AGGTTTTACT TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA 4800 4801 CATAAAATGA ATGCAATTGT TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA 4850 4851 TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT 4900 4901 TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA TGTATCTTAT 4950 4951 CATGTCTGGA TCTGATCACT GCTTGAGCCT AGGAGATCCG AACCAGATAA 5000 5001 GTGAAATCTA GTTCCAAACT ATTTTGTCAT TTTTAATTTT CGTATTAGCT 5050 5051 TACGACGCTA CACCCAGTTC CCATCTATTT TGTCACTCTT CCCTAAATAA 5100 5101 TCCTTAAAAA CTCCATTTCC ACCCCTCCCA GTTCCCAACT ATTTTGTCCG 5150 5151 CCCACAGCGG GGCATTTTTC TTCCTGTTAT GTTTTTAATC AAACATCCTG 5200 5201 CCAACTCCAT GTGACAAACC GTCATCTTCG GCTACTTT 5238保存为.gb格式均可。